鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品，保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序，测序结果经Codon Code Aligner软件校对，同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中，ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列，共得到16个物种的ITS2序列50条；经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列，计算所有物种种内和种间遗传距离，构建邻接法(neighbor joining，NJ)聚类树，通过ITS2 Database预测ITS2二级结构，采用4Sale软件比对二级结构，通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining，PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致，可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码，ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果，为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

基于DNA条形码技术鉴定蒙药材刺柏叶及其混淆品

目的：基于DNA条形码技术鉴别蒙药材刺柏叶及其混淆品。方法：采用国际通用的条形码序列 ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL,对刺柏叶及其混淆品圆柏叶共计11份样品进行DNA提取、扩增,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,并用MEGA软件对拼接序列进行变异位点分析、邻接(NJ)聚类分析,并计算其平均种内、种间遗传距离。结果：4对引物的PCR扩增产物测序成功率分别为ITS2 100%、 psbA-trnH 100%、rbcL 100%、matK 0%;ITS2序列和psbA-trnH序列均可通过变异位点比较区分刺柏叶及其混淆品;NJ聚类分析的结果显示,psbA-trnH序列的NJ聚类树中刺柏叶与圆柏叶均能分别聚为一支,且psbA-trnH序列的平均种间遗传距离明显大于平均种内遗传距离。结论：psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶,可作为鉴别刺柏叶及其混淆品圆柏叶的条形码序列,为蒙药材刺柏叶及其混淆品的鉴别提供支持。     

浙龟甲的PCR鉴别研究

目的 建立聚合酶链式反应（PCR）技术鉴别浙龟甲[来源为龟黄喉水龟Clemmys mutica（Cantor）的背甲及腹甲]真伪的方法。方法 提取浙龟甲及其混淆品的基因组DNA,从NCBI网站上检索黄喉水龟及其混淆品的线粒体基因,进行分析比对,根据黄喉水龟细胞色素b（cytochrome b gene,Cytb）基因上的特异位点应用Oligo软件设计引物,对浙龟甲及其混淆品样本进行PCR扩增。结果 所设计的引物能特异性扩增黄喉水龟,扩增片段长度为357 bp,能有效区分浙龟甲及其混淆品种。结论 建立的PCR技术鉴别浙龟甲方法,具有特异性高、方法简便快捷、实用性较强的特点,在快速准确鉴别浙龟甲方面具有良好的应用前景。     

射干及类似药用植物叶绿体rbcL基因序列分析

目的 对射干Belamcanda chinensis (L.) DC.,鸢尾Iris tectorum Maxim.,野鸢尾I.dichotoma Pall.,蝴蝶花I.japonica Thunb.和德国鸢尾I.germaica L.等5种药用植物进行叶绿体rbcL基因序列分析,并对其亲缘关系进行探讨。方法CTAB(Cetyl trimelhyl ammonium bromide,CTAB)法提取总DNA,用作者设计的引物对鸢尾科5种药用植物的叶绿体rbcL(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylose Large Gene,rbcL)基因进行扩增,PCR扩增产物纯化后,用ABI310 DNA自动测序仪测序。结果获得射干和4种鸢尾属药用植物叶绿体rbcL基因部分序列(约750 bp),除德国鸢尾外, 其余4种药用植物的rbcL基因序列为首次获得;用clustal 8.0,MEGA 2.0等软件分析统计获得的目的基因片段,得到碱基突变点,遗传距离［碱基差异数(1.000～20.000)、颠换数为(0.000～9.000)、转换数为(0.000～14.000)］,根据rbcL基因部分序列数据建立分子系统树。结论根据叶绿体rbcL基因序列数据可以很好的鉴别5种鸢尾科植物。     

中日产川芎的matK、ITS基因序列及其物种间的亲缘关系

目的分析中国产川芎Ligusticum chuanxiong Hort.及日本产川芎Cnidium officinale Makino的核基因组ITS和叶绿体基因组matK序列,为探讨中日产川芎物种间的亲缘关系提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定川芎和日本川芎的ITS基因和matK基因核苷酸序列并作序列变异分析。结果川芎和日本川芎的matK序列长度均为1268 bp,编码422个氨基酸。ITS1-5.8S-ITS2序列长度均为699 bp,其中18S rRNA基因3′端序列54 bp,ITS1序列215 bp,5.8S rRNA基因序列162 bp,ITS2序列222 bp,26S rRNA基因5′端序列46 bp。根据排序比较,川芎原植物与其商品药材间的matK基因和ITS基因序列完全相同,而川芎与日本川芎间matK基因则仅有1个变异位点,即在上游959 nt处1个转换替代(T→C),反映在氨基酸序列则发生一个非同义取代V(GTG)→A(GCG);ITS基因也仅有1个变异位点,即在ITS1上游54 nt处1个转换替代(T→C)。结论通过进化速率较快的基因序列同源性分析,基本可以认为中日所产川芎基原一致,日本川芎学名似应改为Ligusticum chuanxiong Hort.。     

基于Cytb基因对药用昆虫地鳖虫炮制品的分子鉴别研究

目的:建立基于线粒体DNA细胞色素氧化酶b(Cytb)基因的分子标记技术对地鳖虫(地鳖、冀地鳖)及其混伪品炮制药材进行分子鉴定的方法。方法:采用改良的饱和氯化钠法对地鳖虫及其混伪品炮制药材的总DNA进行提取。通过通用引物REVCB2H、REVCBJ对所有样品的Cytb基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增;用MEGA 5.1软件对所有样品的Cytb基因序列采用邻接(NJ)法构建系统发育树;并利用DNAMAN软件对得到的所有样品的Cytb基因序列进行比对,分析正品、混淆品间序列差异,在差异较大区域设计特异性引物Esin-F和Esin-R进行分子鉴定。结果:以提取的DNA为模板均能成功扩增出相应的Cytb基因片段;构建的系统发育树与其亲缘关系一致;设计的特异性引物Esin-F和Esin-R在同样的条件下,只有地鳖虫得到了扩增条带。结论:建立了地鳖虫及其混伪品药材炮制品的DNA提取方法;设计的特异性引物对地鳖虫有高度的特异性,能够有效鉴别地鳖虫及其混伪品。     

覆盆子及其近缘混淆品的PCR-RFLP鉴别研究

目的 建立一种覆盆子特异性的分子鉴别方法。方法 通过对覆盆子及其混淆品的ITS序列进行测序分析，根据差异位点设计限制性内切酶，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）进行鉴别，建立并优化PCR鉴别方法，并对其稳定性和适用性进行考察与验证。结果 设计的引物可实现对覆盆子及其混淆品序列的扩增，扩增产物为800 bp大小的条带，通过对限制性内切酶MboI进行酶切后的片段长度进行分析，仅覆盆子的序列可被酶切形成2个片段，而混淆品的序列不能被切开，从而特异性鉴别是否为覆盆子。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可用于鉴别覆盆子。     

中药材龟甲的分子鉴定研究

用PCR产物直接测序法对中药材龟甲(板)进行鉴别。从乌龟 Chinemys revesii 和其他20种产地为中国或东南亚国家的龟类的组织材料中提取DNA,扩增约110bp的线粒体12SrRNA,基因片段并进行序列分析,构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库。序列比较的结果表明乌龟与其它20种龟类的这段序列均有差别,序列差异在3.7～15.7%之间。从江苏省药品检验所提供的19块龟甲检品上各取样0.1～0.5g提取 DNA,扩增与上述相同的基因片段,与构建的数据库进行比较,结果表明19块龟甲中只有3块的原动物为乌龟,其余的龟甲均为混淆品。本文的结果为药材龟甲的鉴定找到了有效、可靠的分子遗传标记方法。     

蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究

蛇类药材分子遗传标记鉴别的初步研究王义权周开亚（南京师范大学生物系,南京２１００９７）蛇类药材的鉴别,目前主要是根据其外部形态特征［１,２］和骨骼、鳞片的形态特征［３～５］。随机扩增多态ＤＮＡ（ＲａｎｄｏｍｌｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈ...     

中药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别

ＤＮＡ序列分析鉴别是中药材品种鉴定的新方法［１］,已应用于海马、龟甲、鳖甲等中药材的鉴定［２～７］。目前商品流通中乌梢蛇（ＺＡＯＣＹＳ）药材的混淆品种类较多,游蛇科（Ｃｏｌｕｂｒｉｄａｅ）的常见种类都有可能被当作乌梢蛇制成药材,品种鉴定困难［８］。而...     

市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究

目的：探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法对市售鹿鞭进行样本处理,模板制备,采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应,对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定,有三个样本为正品。结论此方法对市售鹿鞭鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行,说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。     

Development of a polymerase chain reaction to distinguish monocellate cobra (Naja khouthia) bites from other common Thai snake species, using both venom extracts and bite-site swabs.

A PCR technique was used in this study to identify and distinguish monocellate cobra snake bites using snake venoms and swab specimens from snake bite-sites in mice from bites by other common Thai snakes. The sequences of nucleotide primers were selected for the cobrotoxin-encoding gene from the Chinese cobra (Naja atra) since the sequences of monocellate cobra (Naja kaouthia) venom are still unknown. However, the 113-bp fragment of cDNA of the cobrotoxin-encoding gene was detected in the monocellate cobra venom using RT-PCR. This gene was not found in the venoms of Ophiophagus hannah (king cobra), Bungarus fasciatus (banded krait), Daboia russelii siamensis (Siamese Russell's Viper, and Calloselasma rhodostoma (Malayan pit viper). Moreover, direct PCR could detect a 665-bp fragment of the cobrotoxin-encoding gene in the monocellate cobra venom but not the other snake venoms. Likewise, this gene was only observed in swab specimens from cobra snake bite-sites in mice. This is the first report demonstrating the ability of PCR to detect the cobrotoxin-encoding gene from snake venoms and swab specimens. Further studies are required for identification of this and other snakes from the bite-sites on human skin.     

鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定

目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法碱变性法提取新鲜鹿鞭及牛鞭,采用引物设计软件PrimerPremier5.0对鹿鞭及牛鞭的细胞色素b基因序列分析,用于鉴定正品鹿鞭的特异性引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,对鹿鞭进行DNA指纹鉴定。结果对鹿鞭进行mtDNA鉴定图谱显示,真品鹿鞭有306bp条带,伪品没有。结论用此方法对鹿鞭进行鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行。鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于鹿鞭的鉴定。     

Authentication of Chinese crude drug, Gecko, by allele-specific diagnostic PCR.

Based on the sequences of the mitochondrial 12S rRNA gene fragment of 17 samples from Gekkonidae, Salamandridae, Agamidae and Hynobiidae, respectively, a pair of allele-specific primers was designed for differentiating the Chinese medicinal material Gecko from its adulterants by PCR. The results of amplification with the primers indicate that amplicons from the templates of Gekko gecko were clearly revealed by agarose gel electrophoresis, whereas no evident amplicons were found from other species. The primers were employed to identify crude drug samples from different sources. Among a total of 9 samples, 3 were diagnosed as genuine Gecko. This result is consistent with morphological identification and DNA sequence analyses.     

Authentication of oviductus ranae and its original animals using molecular marker

Two pairs of diagnostic primers, IHm01-L/IHm01-H and IHm02-L/IHm02-H, for distinguishing the Chinese crude drug Oviductus Ranae from its substitutes were designed based on sequences of Cyt b gene fragment of the original animals of the drug and substitutes. Total DNAs were extracted from crude drugs purchased from five drugstores in different regions, as well as from original animals of the drug, Rana chensinensis, and seven species of related ranid species. Diagnostic polymerase chain reactions (PCRs) were performed using the two pairs of primers with the total DNAs of the original animals as a template. The result showed that a 240 bp DNA segment was clearly amplified from all templates of Rana chensinensis using primers IHmO1-L and IHm01-H, whereas no DNA band appeared from other templates. While using primers IHm02-L and IHm02-H, we got a clear 140 bp DNA band from all the templates of R. huanrenensis and 3 oviducts of the same species, no PCR product was observed from the other samples. A set of PCR reactions was employed to identify crude drugs from the five drugstores using the two pairs of primers together with HsmL1 and HsmH1 reported in our previous study. The results show that only 20% of the Oviductus Ranae currently sold in markets are qualified products and the rest are not.     

Authentication of an animal crude drug, Zaocys, by diagnostic PCR

A pair of diagnostic primers for distinguishing the Chinese crude drug Zaocys (Zaocys dhumandes) from its substitutes was designed based on the sequence data of the original animal of the drug and substitutes. Total DNAs were extracted from genuine crude drug and 5 of its substitutes, as well as from 12 species of original animal of the snake crude drug. Diagnostic PCRs were performed using the primers with these total DNAs as a template, annealing at 60-65 degrees C. Positive amplifications were obtained from all DNA templates of Zaocys, whereas negative amplifications were obtained from that of others. The results indicate that Zaocys samples could be definitely distinguished from its substitutes by diagnostic PCR, and no incorrect discrimination was found under the same reaction conditions. The advantages of the method in the authentication of crude drugs are also discussed in the present paper.     

猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测

本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法。在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上，设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明：AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56 ℃，ARMS引物鉴别时的复性温度更宽，为52～58 ℃。在用两种引物对肝素样品进行鉴别时，仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带，而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物。