蝎毒镇痛活性肽在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌产生蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1的发酵过程进行优化, 确定了最佳发酵条件: 1.2%甲醇, 0.6%酪蛋白水解物, 初始pH 6.0, 3×接种量。在此发酵条件下, BmK AngM1在毕赤酵母重组菌中的表达量可超过500 mg·L^-1, 比对照提高了两倍以上。本研究为大规模发酵制备BmK AngM1奠定了基础, 更好地满足了BmK AngM1的理论研究及新药开发的需要。     

天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达

利用甲醇诱导的醇氧化酶1（AOX1）启动子，构建了天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达系统。为了提高表达水平，在紧邻野生型编码区处设计了两种密码子优化的编码区并使之表达。利用来源于酿酒酵母的截短的α交配因子分泌信号，以保证天然成熟蛋白的分泌。利用PCR方法筛选AOX1基因被替换的单拷贝插入转化子，比较不同克隆的表达水平。经甲醇诱导后，野生型的表达水平为125mg／L，两种含有密码子优化编码区的突变株分别为65和125mg／L。纯化的重组蛋白通过埃德曼降解、液相色谱、质谱以及不溶性蓝色淀粉测定等方法显示重组蛋白与大麦中的野生型蛋白具有相同特征。     

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

重组人肝细胞生长因子真核表达载体的构建

目的构建重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的真核表达载体,为后续毕赤酵母蛋白高效表达提供基础。方法根据酵母表达偏爱密码子合成rhHGFcDNA全长序列,将rhHGF和pGAPZαA质粒双酶切后行连接转化,构建穿梭载体pGAPZαA-rhHGF,并鉴定。结果重组真核表达载体pGAPZA-rhHGF经限制性内切酶分析,与理论值相符,测序结果未见碱基变异。结论成功构建了pGAPZαA-rhHGF真核表达载体,为后续毕赤酵母高效表达rhHGF蛋白提供了可行性。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测

为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素(Endostatin),在毕赤酵母中进行组成型表达的研究。将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中,构建表达载体pGAPZαA-ENDO,并转化到毕赤酵母X-33中。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型表达Endostatin蛋白。重组人Endostatin产量达到102mg/L。Western blot显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合。纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性。利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白。     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

猪囊尾蚴cCl亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的 优化猪囊尾幼cCl亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法 毕赤酵母转化菌在BMMY、BMM、MM及各加1％酪蛋白水解物(CA)的诱导培养基中经0．5％甲醇诱导表达后，上清液行SDS—PAGE。结果 高拷贝毕赤酵母转化菌SMDll68的表达水平高于酵母转化菌GS115，Mut^s型比Mut 型表达量高，表达水平与拷贝数呈正相关，即拷贝数越高，表达量也越高；在诱导培养基BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基；阴性对照菌末见目的表达条带。结论 猪囊尾蚴cCl亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化，为大量制备生产打下了基础。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

Enhancement of recombinant BmK AngM1 production in Pichia pastoris by regulating gene dosage,co-expressing with chaperones and fermenting in fed-batch mode

The scorpion peptide BmK AngM1 was reported to exhibit evident analgesic effect, but its yield by extraction from scorpion venom limits the research and application. The heterologous expression of BmK AngM1 was achieved in Pichia pastoris in our previous study. In order to realize high-level expression of recombinant BmK AngM1 (rBmK AngM1), the gene dosage of BmK AngM1 was optimized in engineered strains. The yield of rBmK AngM1 in the four-copy strain reached up to 100 mg/L, which was further enhanced to 190 mg/L by co-expressing with chaperones of PDI, BiP, and HAC1. Moreover, the yield of rBmK AngM1 was up to 1200 mg/L by high-density fermentation in 10 L fermenter. Finally, 360 mg rBmK AngM1 was purified from 1 L cultures by a two-step purification method. The efficient and convenient techniques presented in this study could facilitate further scale-up for industrial production of rBmK AngM1.     

Purification and characterization of a new peptide with analgesic effect from the scorpion Buthus martensi Karch

Abstract: A new peptide, designated as Buthus martensi Karch (BmK) AngM1, with an isoelectric point (pI) of 5.8 was purified and characterized from the venom of Buthus martensi Karch. The molecular mass was calculated as 7040.5 Da from multiple‐charged ions by elelctrospray ionization mass spectroscopy (ESI/MS). The complete amino acid sequence of BmK AngM1 of 64 amino acid residues was determined by automatic sequencing of N‐terminal part of the native peptide and the fragments of reduced and S‐carboxymethylated (RCM)‐peptide degraded by Staphylococcus aureaus V₈ protease and TPCK(N‐p‐Tosyl‐L‐phenylalanine chloromethyl ketone)‐treated trypsin. Bioactivity tested using mouse‐twisting model showed an evident analgesic effect with 63.0% (P < 0.001) inhibition efficiency at the dose of 0.8 mg/kg, but the LD₅₀ was larger than 50 mg/kg. Electrophysiological studies showed that BmK AngM1 at the concentration of 1 μm obviously inhibit voltage‐dependent Na⁺ current (I_Na) and voltage‐dependent delayed rectifier K⁺ current (I_K) but had no effects on transient K⁺ current.     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

Fos expression in rat spinal cord induced by peripheral injection of BmK I, an alpha-like scorpion neurotoxin

In this paper, the central neuronal activities elicited by BmK I, a specific voltage-gated Na+ channel modulator, were examined by monitoring the c-Fos expression pattern of rat spinal cord. c-Fos protein in laminae I-II, V-VI, and VII-X could be detected at 0.5 h, increased steadily at 1 h, reached a peak at 2 h, and then decreased rapidly from 4 to 24 h after Bmk I was subcutaneously injected into the rat hind paw. However, c-Fos expression in laminae III-IV was activated to a peak at 0.5 h and then declined gradually from 0.5 to 24 h. Furthermore, c-Fos expression could be induced by BmK I in a dose-dependent manner. In addition, the increase of c-Fos expression in laminae I-II, V-VI, and VII-X induced by BmK I, and not in laminae III-IV, could be partially inhibited by systemic morphine in a dose-dependent manner. The results suggested that peripheral administration of BmK I could evoke a profound change of spinal neuronal activities manifested as specific patterns of c-Fos expression, which may be partially attributed to the selective modulation of BmK I on voltage-gated Na+ channels located in peripheral nociceptors.     

东亚钳蝎BmK αIV基因的克隆、可溶性表达与纯化

目的通过pSYPU-1b原核表达载体表达东亚钳蝎BmKαIV并纯化。方法利用PCR技术从蝎尾cDNA中扩增BmKαIV基因,构建表达载体pSYPU-1b-rBmKαIV。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达。通过金属离子螯合亲和色谱和阳离子交换柱色谱法对重组蛋白进行分离纯化。结果成功克隆BmKαIV基因,SDS-PAGE显示重组蛋白以可溶性形式表达,通过两步色谱方法获得了含量质量分数为95%以上的样品。结论 BmKαIV通过pSYPU-1b载体实现可溶性表达并被纯化。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。