临床用人感染H7N9禽流感病毒检测试剂盒获批

2013年5月21日,上海之江生物科技股份有限公司申报的“人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）”和中山大学达安基因股份有限公司申报的“人感染HTN9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）”获得国家食品药品监督管理总局批准,标志着我国临床用人感染H7N9禽流感病毒诊断试剂率先批准上市。该诊断试剂均基于荧光PCR方法,可对具有流感样症状的患者或者相关密切接触者的鼻咽拭子、口咽拭子、痰液等呼吸道分泌物样本中的H7N9禽流感病毒RNA进行体外定性检测,检测结果可用于临床辅助诊断患者是否感染H7N9禽流感病毒。     

药界

H7N9禽流感病毒检测试剂盒获批 上海之江生物科技股份有限公司申报的“人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）”和中山大学达安基因股份有限公司申报的“人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）”近日获得国家食品药品监督管理总局批准，     

临床用人感染H7N9禽流感病毒检测试剂盒获批

5月21日,上海之江生物科技股份有限公司申报的"人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)"和中山大学达安基因股份有限公司申报的"人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)"获得国家食品药品监督管理总局批准,标志着我国临床用     

贵州省2012年度禽流感病毒H5N1亚型HA-1基因分析

目的建立并完善贵州省禽流感病毒基因分析检测技术平台,了解贵州省禽流感病毒H5N1亚型HA1片断与WHO公布的流行株比对有否发生变异。方法收集禽流感H5N1亚型病毒毒株,提取病毒核酸RNA,通过RT-PCR扩增HA1片断,用电泳观察PCR产物目的条带大小,经过纯化、测序,用Biodeit、MEGA4相关软件进行序列比对,进行差异性分析,构建系统发育树。结果贵州省禽流感病毒H5N1亚型中鸭来源的禽流感病毒组成一个分支,组内差异性在0.00～5.00之间;鸡来源的禽流感病毒组成另外一个分支,组内高度同源,差异性为零。结论贵州省禽流感病毒在物种之间存在一定的种属特异性。并且与湖南省的禽流感病毒亲缘关系较近,这与两省之间地理交界有关。     

甲型H5N1禽流感病毒血凝素在sf9昆虫细胞中的表达及其鉴定

目的  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达甲型H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）并对其进行鉴定。方法  根据sf9昆虫细胞密码子偏好性,对A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）禽流感病毒的HA基因进行序列优化并全长合成。构建重组供体质粒pFastHA,经PCR及测序鉴定后,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒BacmidHA,用M13引物进行PCR鉴定。采用脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBacHA。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光法对rBacHA表达产物进行分析。结果  供体质粒pFastHA经双酶切后产生了1条与预期大小相符的1 707 bp条带,序列测定证实目的基因无突变。穿梭质粒BacmidHA经PCR扩增,得到1条与预期大小相符的3 180 bp条带。SDS-PAGE结果显示,rBacHA表达产物的相对分子质量约为65 000。蛋白质印迹法分析表明,表达产物能与禽流感病毒阳性血清结合。在荧光显微镜下,感染rBacHA的sf9细胞呈现绿色荧光,提示HA基因得到表达。结论  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功制备了具有良好抗原性的重组HA蛋白。     

2014～2015年南充市禽流感职业暴露人群及环境监测结果分析

目的 了解南充市禽流感职业暴露人群H5N1感染及环境禽流感病毒污染状况.方法 2014～2015年采集南充市禽类职业暴露人群血清标本,用红细胞凝集抑制试验(HI)检测H5N1抗体;对城乡活禽市场、家禽规模养殖、野鸟禽鸟栖息地以及禽类宰杀市场等场所的笼子、粪便以及污水标本采用实时荧光定量PCR法检测禽流感病毒(甲型流感病毒,即FluA)核酸.结果 共采集职业暴露人群160份血清标本,H5N1抗体结果均为阴性采集环境标本160份进行禽流感病毒核酸检测,FluA核酸阳性31份,总检出率为16.32％.其中H5、H7、H9核酸阳性分别是18份、0份、10份,H5、H7、H9检出率分别是9.47％、0％、5.26％,FluA核酸阳性未分型3份,未分型检出率为1.58％,不同类型标本、不同监测点环境、不同监测场所及不同季节监测结果比较差异有统计学意义(x2值分别是37.43、8.67、30.57和30.44,P＜0.05).结论 禽流感H5亚型在南充市职业暴露人群中未发现隐性感染,南充市各类型标本、各监测场所、各监测点环境及各季节均存在禽流感病毒,建议各相关政府部门加强对禽流感相关知识的宣传,加强交易以及宰杀市场等的监管,加强对外环境的监测,必要时采取短期关闭活禽交易、禽类宰杀市场,季节性休市等措施,降低禽流感病毒感染的风险.     

表达甲型H5N1禽流感病毒结构蛋白的重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的  构建表达甲型H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza A virus,H5N1 AIAV）NIBRG14株结构蛋白的重组痘苗病毒,为研制新型人用流感疫苗奠定基础。方法  通过反转录PCR扩增H5N1 AIAV NIBRG14株的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）编码基因,并将改造的HA、NA基因克隆至痘苗病毒穿梭质粒 pSCCK。在重组质粒与痘苗病毒天坛株（vaccinia virus Tiantan,VTT）于Vero细胞中发生同源重组后,筛选同时表达HA和NA的重组痘苗病毒（rVTT-HA/NA）,并对其进行鉴定。结果  反转录PCR扩增的HA和NA基因大小约分别为1 700和1 400 bp,与预期相同。DNA测序证实,改造的HA和NA序列正确。对获得的rVTT-HA/NA进行PCR及测序表明,HA和NA基因正确插入VTT。蛋白质印迹显示,rVTT-HA/NA感染的Vero细胞表达的HA和NA能与相应的抗体发生反应。表达的HA具有血凝活性,血凝滴度为1∶32。结论  重组痘苗病毒rVTT-HA/NA可稳定表达H5N1 AIAV NIBRG14株的HA和NA。     

美国：H5N1型禽流感病毒快检技术上临床

美国食品和药物管理局近日批准使用一种H5N1型禽流感病毒快速检测技术,用这种技术可以在40分钟内检测出人是否感染了H5NI型禽流感病毒。     

改良多重实时荧光定量PCR检测流感A型和B型病毒

目的：建立改良多重实时荧光定量PCR体系快速检测流感A型和B型病毒。方法根据生物信息学分析结果选定流感A型和B型病毒的靶序列,建立MRT－PCR检测体系。构建质粒标准品,评估所建立体系的灵敏度、特异性和重复性。结果成功建立了基于同源加尾系统和Taqman－分子灯标探针的改良多重实时荧光定量PCR检测体系;该方法最低检测限为102 copies／μl,特异性良好,重复性良好,变异系数（CV）为0．99％～2．50％。结论建立了快速、敏感、特异、稳定地改良多重实时荧光定量PCR（ MRT－PCR）检测体系,具有良好的临床应用前景。     

高致病性H7N9禽流感病毒研究进展

摘要：H7N9禽流感病毒在中国出现以来共造成5次流行。在第5次流行中出现了高致病性H7N9变异株,该病 毒株的HA链接肽位置发生了基因插入性突变,导致该病毒对家禽毒力的增强。同时在人感染H7N9禽流感病例中 也相继分离到了该病毒。因此,对高致病性H7N9禽流感病毒病原学及流行病学研究对于该疾病的预防和控制具有 重要意义。本文从高致病性H7N9禽流感病毒的变异来源、流行病学特征及防治措施等方面进行综述,为高致病性 H7N9禽流感的有效防治提供科学策略。     

炭疽杆菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立同时检测炭疽杆菌capA基因、PA基因的双重实时定量荧光PCR方法,用于应对突发传染病疫情和流行病学调查、突发公共卫生事件应急处置的早期检测及防范生物恐怖威胁.方法 设计和合成分别针对炭疽杆菌capA基因、PA基因的引物对和荧光双标记探针,构建质粒标准品,通过优化探针、引物浓度、反应体系试剂组分等参数,建立可同时检测capA基因、PA基因的双重实时荧光PCR方法,测试方法的灵敏度和特异性,并在实战检测中应用.结果 双重实时荧光定量PCR的炭疽杆菌capA基因、PA基因检测的灵敏度分别可达到每反应5和50拷贝,并具有良好的特异性,在实战应用中亦经过考验.结论 双重实时荧光定量PCR技术具有可以同时筛查、经济、快速、特异性强等优点,在炭疽杆菌检测方面有良好应用价值.     

天津市2001年-2004年流感病原学监测分析

目的：观察天津市流感病毒流行特点以及发生禽流感疫情时的情况。方法：2001年10月-2004年3月3个冬春季的类流感患者咽拭子标本采用MDCK细胞和鸡胚双腔法分离流感病毒，用鸡红细胞和豚鼠红细胞凝集试验（HA）证实是否存在病毒，再用红细胞凝集抑制试验（HI）进行型和亚型的鉴定。2004年用RT—PCR方法检测禽流感疫情区发热患者咽拭子标本。结果：3个监测周期共采集类流感样患者咽拭子标本953份．分离出流感毒株285株，总检出率为29、9％，男女比例为1．06：1，其中A（H1Nl）亚型4．6％（13／285株），A（H3N2）亚型59．6％（170／285株），B型35．8％（102／285株）。285株流感病毒都能适应MDCK细胞，但阳性标本液直接接种鸡胚阳性率极低，仅为2．1％（6／285）。21份禽流感监测咽拭子标本H5亚型RT—PCR结果为阴性。结论：天津地区同时存在A（H1N1）、A（H3N2）和B型流感病毒，12月为发病高峰。天津市2004年发生禽流感时未发现人感染H5亚型禽流感病毒。     

安徽省淮南市2012-2013年流感病毒细胞分离及其流行特征分析

目的：观察安徽省淮南市2012-2013年流感病毒细胞培养分离结果,研究淮南市流感流行特征,为该市流感防控提供科学依据。方法实时荧光定量PCR法对哨点医院送检咽拭子标本进行核酸快速分型后采用狗肾（ MDCK）传代细胞培养法分离病毒,红细胞凝集试验（ HA）鉴定病毒滴度,红细胞凝集抑制试验（ HI）进行型和亚型的鉴定。结果从148份流感网络实验室实时定量PCR阳性标本中,分离出流感毒株68株,总分离率45．9％,其中 A1（H1N1）型26株,分离成功率56．5％,A3（H3N2）型25株,分离成功率33.3％;BY型4株,BV型13株,B型毒株分离成功率为63．0％;各型毒株的分离成功率差异有统计学意义（P＜0．05）。2012年淮南市流行株为BV型流感病毒,于3月份达到流行高峰;2013年流行株为A（H1N1）型流感病毒,流行高峰期则是12月份。结论淮南市2012-2013年甲型流感病毒抗原的变异性强;细胞培养分离病毒对流感流行的病原鉴定起决定性作用;流感病毒B型毒株和新A（H1N1）型毒株分离成功率较高。     

表达HA基因的传染性喉气管炎病毒重组体保护鸡抵抗致死性禽甲型流感病毒感染

UL5 0基因是传染性喉气管炎病毒(IL TV)复制的非必需基因 ,UL 5 0能被增强的绿色荧光蛋白基因 (EGFP)所取代 ,它含有人巨细胞病毒立即早期启动子 (PH C MV -IE)和多聚 A尾信号。将克隆的 H5亚型禽流感病毒 (AIV)的血凝素 (HA)基因取代 EGFP表达框 (同时保留 PH CM V -IE和聚 A尾基因 ) ,形成正反两个方向的重组体。与 HA基因转录方向一致的重组体记为 ILTVΔUL5 0 -HAb,相反的为 IL TVΔUL5 0 - HAa。作者用三种活病毒重组体疫苗 IL TVΔUL 5 0 (IL TV缺失了 ΔUL5 0 )、 IL TVΔUL5 0 - HAb、IL TVΔUL 5…     

应用实时荧光PCR技术检测783例手足口病病原体的探讨

目的应用实时荧光PCR技术对临床783份样本进行分析探讨,拟建立一种特异、灵敏、快速的PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法应用广州达安生物有限公司提供的《肠道病毒7l核酸检测试剂盒（PCR一荧光探针法）》、《肠道病毒柯萨奇A16核酸检测试剂盒（PCR．荧光探针法）》,此试剂盒检测原理为：在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针,采用RT．PCR一步法技术,检测样品中是否含有EV71或CAVl6RNA。结果应用实时荧光PCR技术对783例临床标本进行检测,其中肠道病毒71型（EV71）阳性187例;柯萨奇A16（CAVl6）阳性92例。标本类型包括：咽拭子716份;血清38份;大便19份;疱疹液10份;结论实时荧光PCR技术快速、不易污染、易操作,适合用于手足口病暴发疫情的实验室应急检测。     

H9N2禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶DNA疫苗对小鼠的免疫保护研究

目的 检测H9N2禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)DNA疫苗保护小鼠抵抗致死量同源病毒感染的能力.方法 通过小鼠肺对肺传代,建立禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)小鼠适应株.同时,构建病毒HA和NA DNA疫苗,以不同剂量电击法免疫小鼠1或2次,在初次免疫后4周或加强免疫后1周用致死量(40 LD50)鼠适应型病毒攻击小鼠.通过测定小鼠血清抗体滴度、小鼠存活率和肺部病毒滴度来评价疫占的效果.结果 HA或NADNA 10μg免疫1次或3μg免疫2次均可保护小鼠抵抗致死昔H9N2病毒的感染.结论 低剂量HA或NA DNA可为抗H9N2禽流感病毒感染提供有效的免疫保护.     

两种核酸扩增检测方法用于病毒载体制品支原体检测的比较研究

目的  研究两种支原体快速检测方法在病毒载体制品中的适用性和影响因素。 方法  采用基于PCR技术的两种支原体核酸扩增检测方法,对分别表达Ⅱ型单纯疱疹病毒抗原gD和ICP27的重组仙台病毒载体疫苗（SeV-dF/HSV-2 gD、SeV-dF/HSV-2 ICP27）收获液及纯化液进行支原体检测,探究其的特异性和最低检测限,并对多个批次的收获液及纯化液进行测定。 结果  普通PCR法在对本制品病毒收获液检测时无明显PCR抑制现象,但对病毒纯化液检测时发生明显的PCR抑制,并且未能检出100 CFU/ml限度的口腔支原体和肺炎支原体。实时荧光定量PCR法在对本制品病毒收获液和纯化液的支原体检测中均无PCR抑制发生,且该方法对口腔支原体、肺炎支原体等多种支原体的检测灵敏度可达到10 CFU/ml,其中对口腔和肺炎支原体核酸拷贝数检测灵敏度可达到每毫升50基因组拷贝。 结论  实时荧光定量PCR法具有更高特异性和灵敏性,适用于作为质量内控方法快速检测病毒载体制品,及时发现支原体的污染,保证制品质量。     

一种HSN1禽流感DNA疫苗获得令人振奋的初期研究结果

最近，中国台湾地区科研人员开发出一种抗H5N1禽流感的DNA疫苗，并报道了其令人振奋的初期研究结果，表明该疫苗可抗击广谱病毒株。研究者们分析研究了取自不同H5N1病毒株的数百个编码血凝素（HA）的基因，发现在病毒表面有一种刺突状蛋白，它可与细胞受体结合，从而开始感染。然后，他们设计了含有常见于所有病毒株的一个序列的一种“交感HA”基因，并对其进行蛋白表达的优化，再将其插入一种环状DNA质粒，于大肠杆菌系统中复制，产生此候选疫苗。     

实时荧光定量PCR检测ESBLs基因型方法的研究

目的:建立一种快速检测革兰阴性杆菌产超广谱β内酰胺酶(ESBLs )耐药基因分型的SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR方法.方法:针对临床常见ESBLs的耐药基因SHV、TEM、 CTX-M、OXA及其同源性分析,设计了SHV、TEM 、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、OXA-1、OXA-2及OXA-10 共9对特异性引物,煮沸法提取DNA模板,建立并优化SYBR GREEN I实时荧光定量PCR反应体系,并对其精密度、线性范围进行测定.利用建立方法对51株表型阴性的多重耐药的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行ESBLs耐药基因检测,并与改良三维实验进行对比.结果:从39株ESBLs表型阳性菌株及51株ESBLs表型阴性多重耐药菌株中扩增出除OXA-2外共8种耐药基因型并经测序证实.线性检测范围3×10~3~3×10~8拷贝/mL , r ＝ -0.994 7 ;批间重复性试验变异系数(CV)为9.6%.荧光定量PCR方法与改良三维实验方法比较差异无统计学意义( χ2 = 1.125,P > 0.05).结论:SYBR GREEN Ⅰ实时荧光定量PCR检测ESBLs的耐药基因具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的特点,适于临床监测革兰阴性杆菌产ESBLs 基因型.     

贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列分析

目的对贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列进行分析。方法提取核酸,PCR扩增,测序分析、比对。结果同源性分析和系统发育树都说明了相同(或相近)年份的毒株核苷酸序列同源性较高,亲缘关系较近;不同年份的毒株核苷酸序列的同源性较低,亲缘关系较远;3株H3N2毒株共有59各位点核苷酸替换。结论通过序列测定分析,结果表明1995-2005年纵向比较,贵州省甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列发生了变异;通过与Genbank上相应年份标准株横向比较,贵州省3株甲3(H3N2)亚型流感病毒的血凝素基因HA1区序列未发生大的变异,仅有少数核苷酸的替换。