基于实时细胞分析技术评价注射用益气复脉(冻干)类过敏反应

目的 建立中药注射剂体外类过敏反应评价方法,快速评价不同批次注射用益气复脉（冻干）类过敏反应表现。方法 体外培养嗜碱性白血病细胞株RBL-2H3细胞,选择Compound 48/80为阳性药,采用实时细胞分析（real-time cell analysis,RTCA）系统检测药物干预后引起的细胞指数（CI）值变化,并利用甲苯胺蓝、鬼笔环肽染色观察细胞形态、骨架变化,以及检测组胺和β-已糖苷酶释放量验证RBL-2H3细胞的脱颗粒情况。选择20个批次的注射用益气复脉（冻干,100 μg/mL）作用于RBL-2H3细胞,进行基于RTCA技术的类过敏反应评价。结果 阳性药Compound 48/80（20 μg/mL）能够使RBL-2H3细胞的CI值在加药后30 min内呈先快速上升后下降趋势;形态学研究发现,Compound 48/80使细胞形态和细胞骨架均发生明显改变,发生明显的脱颗粒现象;组胺和β-己糖苷酶释放实验进一步证实Compound 48/80导致炎症介质的释放,引起了明显的脱颗粒现象;提示RTCA系统可以用于快速敏感的评价RBL-2H3细胞脱颗粒。不同批次的注射用益气复脉（冻干）对RBL-2H3细胞CI值无明显影响,提示所选批次为合格批次,无类过敏反应现象的发生。结论 建立了一套基于RTCA系统的类过敏反应体外快速评价技术,可用于注射用益气复脉（冻干）等中药注射剂类过敏反应的体外快速评价。     

基于实时细胞分析技术的乌头碱致心律失常体外评价技术研究

目的以乌头碱为工具药,建立基于实时细胞分析(real-time cell analysis, RTCA Cardio)系统的体外心律失常检测技术,为抗心律失常药物的研发提供可靠方法。方法利用八导生理记录仪从整体动物水平检测乌头碱对实验大鼠心律的影响;体外培养心肌细胞,首先利用RTCA方法考察心肌细胞的接种密度,利用RTCA Cardio系统监测乌头碱对心肌细胞搏动的影响,分析细胞的CI值、细胞搏动频率、振幅、不规则性节律等。结果八导生理记录仪检测50 mg·g~(-1)乌头碱对整体动物的影响结果发现乌头碱可诱发室速、室颤、RR间期缩短以及心率增加等心律失常的表现;RTCA Cardio系统显示2～8μmol·L~(-1)乌头碱可呈剂量依赖性的导致心肌细胞搏动频率增加、搏动幅度降低、搏动状态异常等心律失常现象。结论 RTCA Cardio系统可以快速、敏感、准确检测乌头碱诱导的心肌细胞心律失常现象,为抗心律失常药物的研发提供了方法学参考。     

雷公藤多甙诱导小鼠腹腔激活巨噬细胞凋亡的实验研究

目的体外观察雷公藤多甙对小鼠腹腔激活巨噬细胞凋亡的影响。方法分离小鼠腹腔巨噬细胞,以脂多糖(LPS)激活,与雷公藤多甙(TWP)进行共同孵育;分别采用夹心ELISA法检测巨噬细胞NF-кB的核内浓度及凋亡电泳试验显示巨噬细胞凋亡情况。结果 TWP在12.5～100μg/L范围内对LPS活化的巨噬细胞凋亡具有促进作用,呈剂量依赖关系。结论 TWP可以促进激活巨噬细胞的(Mф)凋亡。     

芒果核仁水提物的体外抗炎作用研究

目的 研究芒果核仁水提物的体外抗炎作用.方法 通过脂多糖(LPS)诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞的体外炎症模型,在细胞培养液中加入不同浓度的芒果核仁水提物,采用Griess reaction法检测上清液中NO的浓度.结果 芒果核仁水提物可显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞的NO释放,并存在剂量依赖关系.结论 芒果核仁具有良好的体外抗炎作用.     

木樨草素通过抑制miR-142-3p降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞损伤

摘要：目的:探讨木樨草素对脂多糖（LPS）诱导的肺泡巨噬细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法:采用1 mg·L-1的LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NR8383建立细胞损伤模型,并用不同剂量(0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4μg·ml-1)的木樨草素处理NR8383细胞。实验分为对照组、LPS组(1 mg·L-1)、LPS(1 mg·L-1)+木樨草素低、中、高剂量组(0.1,0.3,0.9μg·ml-1)、LPS(1 mg·L-1)+anti-miR-NC组、LPS(1 mg·L-1)+miR-142-3p inhibor组、LPS(1 mg·L-1)+木樨草素(0.9μg·ml-1)+miR-142-3p mimic组;采用MTT法检测木樨草素对NR8383细胞存活率的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）的水平;qRT-PCR法检测miR-142-3p的表达量;Western blot检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase3）、Cleaved-Caspase3蛋白表达量。结果:随着木樨草素浓度的升高,LPS组细胞存活率升高,而对照组细胞存活率无明显变化;与对照组比较,LPS组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、miR-142-3p的表达量、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达升高（P<0.05）;与LPS组比较,LPS+木樨草素低、中、高剂量组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、miR-142-3p的表达量、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达降低（P<0.05）,且呈剂量依赖性（P<0.05）;与LPS+anti-miR-NC组比较,LPS+miR-142-3p inhibor组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达降低（P<0.05）;与LPS+木樨草素组比较,LPS+木樨草素+miR-142-3p mimic组细胞凋亡率、TNF-α和IL-1β的水平、Caspase3、Cleaved-Caspase3蛋白表达升高（P<0.05）。结论:木樨草素通过抑制miR-142-3p表达可抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡,改善炎症反应。     

三甲氧基二苯乙烯对小鼠巨噬细胞产肿瘤坏死因子-α及细胞核因子-κB活性的作用研究

目的研究三甲氧基二苯乙烯（BTM）对小鼠巨噬细胞经脂多糖（LPS）诱导后产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及细胞核因子-κB（NF-κB）活化的调控作用。方法培养RAW246．7小鼠巨噬细胞,加入不同浓度的BTM或白藜芦醇,再加入LPS活化细胞,收集细胞上清液用L929细胞结晶紫染色法检测TNF-α的活性,制作细胞爬片用免疫细胞化学法检测巨噬细胞中NF-κB的表达。结果BTM和白藜芦醇本身对L929细胞无细胞毒性;经不同浓度BTM和白藜芦醇处理后巨噬细胞产生TNF-α的水平及表达NF-κB的阳性率呈剂量依赖性减少,BTM抑制巨噬细胞产生TNF-α及表达NF-κB的能力大于白藜芦醇,巨噬细胞产生TNF-α的活性及NF-κB的阳性细胞率均与药物浓度呈负相关,TNF-α的活性和NF-κB的阳性细胞率呈正相关。结论BTM和白藜芦醇在浓度为5～80μmol／L范围内,呈浓度依赖性地通过抑制NF-κB的活化来抑制TNF-α的产生,且BTM抑制巨噬细胞产生TNF-α和NF-κB活化的能力犬于白藜芦醇。     

年龄对人脂肪来源间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨供体年龄对脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）体外生物学特性的影响。方法 收集外科腹部术后留取的皮下脂肪组织和外周血,按年龄分为儿童组、成年组和>50岁组,每组10例,分离培养ADSCs;流式细胞术分析ADSCs免疫表型,实时细胞分析系统检测ADSCs增殖细胞指数（CI）及迁移CI,使用不同的诱导分化培养液检测ADSCs向脂肪细胞和成骨细胞的分化能力,实时逆转录-聚合酶链反应检测骨桥蛋白（OPN）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）mRNA表达水平。将ADSCs与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）共培养,酶联免疫吸附试验检测上清液干扰素（IFN）-γ含量。结果 传3代后3组ADSCs形态均为典型的纺锤形,均表达典型间充质干细胞（MSCs）表面标志物CD90、CD105和CD73。与成年组、>50岁组比较,儿童组细胞体外增殖CI、迁移CI及OPN mRNA相对表达水平均增加（P<0.05）。儿童组ADSCs抑制PBMCs的IFN-γ分泌水平优于成年组及>50岁组ADSCs（P<0.05）。结论 儿童来源ADSCs具有更强体外增殖、迁移、多向分化以及免疫抑制能力。     

硒化壳聚糖促进体外培养皮肤成纤维细胞增殖

目的研究硒化壳聚糖对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖的影响。方法用不同剂量（25、50、100、200、400mg/L）硒化壳聚糖作用于成纤维细胞,光镜下观察药物对细胞形态的影响;MTT法、3H-TdR掺入法、细胞生长动力学研究用于检测药物对细胞增殖影响,LDH漏出率检测药物对细胞增殖及损伤的影响,并以等体积细胞培养液处理为对照组。结果各药物浓度组处理细胞后,细胞形态未见明显改变,均可使细胞吸光度值增加,细胞倍增时间缩短,促进表皮细胞对3H-TdR的掺入（P〈0.05）,降低LDH漏出率（P〈0.05）。结论硒化壳聚糖对体外培养皮肤成纤维细胞增殖具有促进作用。     

尼美舒利诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡作用

目的观察尼美舒利（NIM）诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡作用。方法0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mmol&#8226;L－1NIM作用于体外培养的CNE2细胞株,光学显微镜观察细胞形态和数量变化,透射电子显微镜观察细胞形态和结构变化,噻唑蓝（MTT）法检测细胞悬液吸光度值,流式细胞术（FCM）检测细胞周期分布和凋亡率,蛋白免疫印迹反应（Western Blot）检测细胞环氧化酶2（COX 2）蛋白表达情况。结果不同浓度NIM作用3 d后,CNE2细胞皱缩,数量减少,与药物浓度呈正相关;透射电镜下,细胞形态结构随NIM浓度增加而出现不同程度破坏和死亡征象;相同作用时间下,NIM浓度越高,吸光度值越低;FCM结果显示,NIM各剂量组均在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰（凋亡峰）,随着NIM浓度增高,G0/G1期细胞所占比例逐渐下降,G2/M期细胞比例升高,凋亡率逐渐增高;Western Blot结果显示,随着NIM浓度增加,COX 2蛋白表达量逐渐减少。上述结果均与NIM浓度相关,经统计学处理,与对照组和相邻前一浓度组比较,均差异有统计学意义（P＜0.05）。结论NIM能诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡,且呈剂量依赖性,该作用与抑制COX 2有关。     

黄芪皂苷Ⅳ对小鼠T、B淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞功能的影响

目的：探讨黄芪皂苷Ⅳ（ASI）对小鼠T,B淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞分泌的细胞因子的影响。方法：采用MTT法检测T,B淋巴细胞的增殖;采用分光光度计测定法检测抗体活性;IL－1活性用胸腺细胞增殖法测定;TNF－α活性用L9292细胞杀伤法测定。结果：1）ASI50－200mg/kg ig7天能够促进T淋巴细胞增殖和抗体生成,而ASI50－100mg/kg 能够促进B淋巴细胞增殖,但是200mg/kg对B淋巴细胞增殖无影响;（2）ASI体外仅在200nmol/L对T,B淋巴细胞有促进作用;（3）ASI 1nmol/L可以促进腹腔巨噬细胞分泌IL－1,而100－1000nmol/L则抑制腹腔巨噬细胞分泌IL－1;（4）ASI体外可以抑制LPS刺激或无LPS刺激下的腹腔巨噬细胞分泌TNF－α。结论：ASI能够促进小鼠T,B淋巴细胞的增殖和抗体生成,同时可以抑制腹腔巨噬细胞体内分泌IL－1和TNF－α。     

LPS诱导小胶质细胞活化模型的建立及评价

目的探讨不同浓度脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)对小胶质细胞活化作用,建立小胶质细胞活化的模型。方法不同浓度LPS(0.01,0.1,1,10,100mg·L-1)刺激原代纯化的小胶质细胞及BV2细胞株,采用MTT法检测细胞活力;采用细胞免疫化学法观察细胞形态变化。结果 LPS(1mg·L-1)可以明显激活原代小胶质细胞,但不影响细胞活力,OX-42染色显示小胶质细胞胞体变大,轴突变短变多,形似"阿米巴状";LPS(10mg·L-1)可以激活BV2细胞,且不降低细胞活力,镜下观察发现BV2细胞胞体明显增大。结论采用LPS(1mg·L-1)刺激原代小胶质细胞,LPS(10mg·L-1)刺激BV2细胞株,可以建立稳定的小胶质细胞活化模型。     

间-尼索地平对大鼠急性肺损伤的保护作用

目的观察新型钙拮抗剂间-尼索地平对脂多糖（LPS）诱导大鼠急性肺损伤（ALl）是否有保护作用,探讨Au治疗的新思路。方法以LPS（5．0mg／kg）尾静脉注射建立肺损伤模型。观察各组大鼠肺组织病理改变,计算肺W／D值,检测肺泡上皮细胞内Ca2＋浓度,测定支气管-肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子α（TNF—α）和蛋白质含量,肺组织中丙二醛（MDA）含量,肺毛细血管通透指数（CPI）的变化。结果间-尼索地平能明显减轻LPS所致ALl模型肺组织病变情况。间-尼索地平组肺泡上皮细胞Ca2＋浓度比LPS组含量明显减少（P〈0．05）,肺W／D值比LPS组明显降低（P〈O．05）,肺CPI比LPS组明显降低（P〈0．01）,肺组织MDA含量比LPS组含量减少（P〈0．01）。结论间-尼索地平对脂多糖肺损伤有一定的保护作用。     

蜂胶胶囊对小鼠免疫功能的影响

目的探讨蜂胶胶囊对正常小鼠免疫调节作用。方法将192只BALB/c小鼠随机分为4批,每批动物分为低、中、高三个剂量组和一个溶剂对照组。其中第一批小鼠进行脏器/体质量比值和小鼠碳廓清实验;第二批小鼠进行抗体生成细胞检测和血清凝血素测定(HC50)和绵羊红细胞诱导小鼠足趾增厚(DTH);第三批小鼠进行腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验;第四批小鼠进行乳酸锂脱氢酶法(LDH)测定NK细胞活性和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验。结果高剂量组蜂胶胶囊可提高小鼠碳廓清能力(P<0.05),增强绵羊红细胞诱导小鼠DTH能力(P<0.05),促进NK细胞活性(P<0.05)和血清凝血素的生成(P<0.05),并且能促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力(P<0.05)和抗体生成细胞数的生成(P<0.05);中剂量和高剂量组蜂胶胶囊能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力(吞噬百分率P<0.05;吞噬指数P<0.05);但对免疫器官/体质量比值无明显影响。结论蜂胶胶囊对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞功能和NK功能有促进作用,即具有增强免疫力功能。     

脂多糖干预后成牙本质细胞系MDPC-23中肿瘤坏死因子受体相关因子6基因表达的研究

目的观察不同浓度脂多糖(LPS)干预后,成牙本质细胞中肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因表达的情况。方法体外培养小鼠永生化成牙本质细胞系MDPC-23,采用对照组不干预(即0μg/ml组)、10μg/ml和20μg/mlLPS干预MDPC-23后,通过反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和计算机图像分析方法,观察其TRAF6基因的表达变化。结果TRAF6在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中呈阳性表达,当LPS干预后,TRAF6基因表达呈现上调趋势。结论本实验表明TRAF6参与调控LPS引发的成牙本质细胞炎症损伤过程中的细胞因子网络,推测TRAF6可能影响龋病的形成和发展过程。     

高糖对人脐静脉内皮细胞TLR4表达的影响

目的观察高糖对人脐静脉内皮细胞TLR4表达的影响,比较加用脂多糖后不同浓度的高糖培养下对人脐静脉内皮细胞TLR4表达水平变化。方法将体外培养人脐静脉内皮细胞株分对照组（5mmol/LGS）、高糖组（10mmol/LGS、20mmol/LGS、40mmol/LGS）、高糖＋LPS组（10mmol/LGS、20mmol/LGS、40mmol/LGS/＋100ng/LLPS）,培养24h后,用ELISA法检测各组上清IL-6水平,实时定量PCR检测各组细胞TLR4及MyD88基因表达水平。结果 （1）高糖培养能促使人脐静脉内皮细胞产生IL-6水平增加,具有统计学意义（P〈0.05）,在LPS诱导下高糖能进一步促进该细胞产生IL-6,具有统计学意义（P〈0.05）。（2）随着葡萄糖浓度增高,从5mmol/L到20mmol/L,人脐静脉内皮细胞产生的IL-6逐渐增多,具有统计学意义（P〈0.05）,但再增高糖浓度（到40mmol/L）,该细胞产生IL-6水平不再继续增加（P〉0.05）。（3）在LPS存在的前提下,高糖能诱导人脐静脉内皮细胞TLR4和MyD88基因表达增加,具有统计学意义（P〈0.05）,但仅高糖培养对该细胞TLR4和MyD88基因表达无影响（P〉0.05）。结论高糖能刺激人脐静脉内皮细胞炎症反应,使炎症因子IL-6产生增多,但对TLR4和MyD88表达无明显增高;而高糖联合LPS培养能诱导人脐静脉内皮细胞TLR4和MyD88表达上调,说明高糖在LPS存在前提下可能激发TLR4信号通路。     

吡柔比星在骨肉瘤细胞放射增敏中的作用研究

目的研究吡柔比星在骨肉瘤细胞MG-63的放射增敏中的作用。方法用MTF法检测不同浓度吡柔比星对对数生长期的MG-63细胞的抑制作用,确定IC10的数值,作为实验的药物浓度。用克隆形成分析法测定MG-63细胞在IC10浓度吡柔比星作用24h后给予不同剂量（0、2、4、6、8Gy）照射以及IC10浓度紫杉醇作用不同时间（12、24、36h）后给予一定剂量射线照射的存活分数（SF）,拟合细胞生存曲线并计算放射增敏比,分析吡柔比星作用于MG．63细胞不同时间（12、24、36h）后细胞生存率的变化。结果不同浓度吡柔比星作用24h后,MG-63细胞抑制率逐渐增高（P〈0．01）,其药物毒性呈浓度依赖性,IC10为0．004μg／ml。ICIO浓度吡柔比星增敏比分别1．49（DO比）、1．06（Dq比）和1．04（SF2比）,MG石3细胞a／13值为2．23,IC10浓度吡柔比星作用后为0．27。ICIO浓度吡柔比星作用于MG-63细胞不同时间后再进行照射,细胞存活分数随时间延长逐渐降低（P〈0．01）。结论吡柔比星对MG-63细胞有放射增敏作用,在一定时间内与药物作用时间呈正相关。     

西罗莫司对小鼠树突状细胞CD（86）、I-Ab和Toll样受体4表达的影响

目的：研究西罗莫司（SRL）对小鼠骨髓源树突状细胞（DC）发育成熟和Toll样受体4（TLR4）mRNA表达的影响。方法：（1）用细胞因子定向诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化为DC,在相差显微镜和扫描电镜下动态观察DC在分化发育不同阶段的典型形态。（2）用SRL处理DC,通过流式细胞仪测定CD11c、CD86、MHC-Ⅱ类分子（I-Ab）的表达及在脂多糖（LPS）刺激后各分子表达的变化。（3）实时定量PCR法检测SRL处理DCTLR4mRNA表达水平。结果：（1）在相差显微镜和扫描电镜下可以看到DC在分化发育不同阶段的典型形态。（2）SRL抑制LPS刺激后DC表面CD86和I-Ab表达的上调。（3）与常规培养的DC相比,SRL组DCTLR4mRNA表达水平明显增高。结论：SRL处理的DC可抵抗LPS的促成熟作用。SRL促进DCTLR4mRNA表达。     

米非司酮对体外培养子宫肌瘤细胞作用的形态学观察

目的观察不同浓度米非司酮作用下体外培养的子宫肌瘤细胞的形态学变化,寻找治疗子宫肌瘤的最佳米非司酮浓度。方法光镜及电镜下观察不同浓度米非司酮（10^-8～10^-4mol/L）下体外培养的子宫肌瘤细胞的其形态学变化。结果 10^-8～10^-7mol/L米非司酮对细胞生长无影响,10^-6mol/L以上浓度肌瘤细胞萎缩,10^-4mol/L抑制作用最强。结论米非司酮破坏肌瘤细胞结构,干扰核膜、胞膜、细胞器、及染色体,并与米非司酮浓度成正相关。     

选择性环氧合酶-2抑制剂筛选模型的验证

目的验证大鼠腹腔巨噬细胞环氧合酶-2抑制剂体外筛选模型的可靠性。方法采用放免法测定用脂多糖刺激后的大鼠腹腔巨噬细胞前列腺素-2的产量,运用Western印迹法检测处理后的大鼠腹腔巨噬细胞COX-2和COX-1的表达。结果加入0.5μg.L-1浓度的LPS刺激6 h后,大鼠腹腔巨噬细胞前列腺素-2的产量最高,COX-2蛋白表达量最高;加入阿司匹林后,大鼠腹腔巨噬细胞COX-1表达明显降低。结论大鼠腹腔巨噬细胞模型可用于COX-2抑制剂体外筛选。