丙型肝炎病毒单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：以基因工程表达的丙型肝炎病毒抗原蛋白（HCAg）为抗原，建立分泌单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞系．并对其分泌的McAh进行鉴定。方法：用纯化HCV基因工程表达抗原（HCAg）免疫Balb／c小鼠，取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备McAb。采用ELISA及分片断鉴定技术进行鉴定。结果：筛选出5株能稳定分泌特异性抗-HC的McAb杂交瘤细胞株，经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体，特异性强，效价高。与不同抗原蛋白的ELISA反应呈特异性阳性反应。分片断鉴定结果显示，所获5株McAb主要为抗HCV核心蛋白和非结构蛋白NS3。结论：此5株丙肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丙肝抗原具有特异亲和性，为丙型肝炎病毒抗原诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

天津地区抗霍乱弧菌单克隆抗体（McAb）细胞系的建立及其应用的研究

用 SP_2/0小鼠骨髓瘤细胞与 EL-Tor 霍乱弧菌免疫的 Balb/c 小鼠脾细胞,在 PEG-1000作用下进行融合,获得9株分泌抗霍乱弧菌 McAb 的杂交瘤细胞系。用 ELISA 法对其中两株分泌的 McAb 进行特异性、敏感性实验,免疫球蛋白的类型鉴定及染色体检查。并用羟基磷灰石梯度提纯的 McAb 与兰州生研所生产的多克隆抗体(PcAb),对200例临床粪便标本,用双盲法进行快速检测。结果表明,McAb 的敏感性和特异性均优于 PcAb,同时也证实 McAb 应用于霍乱病人的诊断及菌株鉴定的可行性。     

2型猪链球菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogen-ase,GDH）的单克隆抗体。方法分别以2型S.suis全菌细胞和重组GDH蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株并克隆化;免疫印迹（Western blot）鉴定GDH单克隆抗体的特异性;制备小鼠腹水并进行抗体效价测定。结果细胞融合后经ELISA筛选获得分泌的阳性细胞株,经过有限稀释克隆化筛选,获得4株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单抗腹水的抗体效价均在1∶102400以上。结论本研究获得了4株能稳定分泌抗体且其分泌的抗体能够与GDH蛋白进行特异性反应的单克隆抗体细胞株,所获得特异性单克隆抗体能用于猪链球菌结构和功能的研究,也能够进一步用于猪链球菌感染血清学诊断方法研究。     

接头蛋白c-Crk 单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备接头蛋白c-Crk单克隆抗体。方法以c-Crk为抗原,免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立稳定分泌抗c-CrkmcAb的杂交瘤细胞,用ELISA,western-blot等鉴定其生物活性。结果获得两株能稳定分泌c-CrkmcAb的杂交瘤细胞（3C7、3G11）,亚类均为IgG1;腹水效价为1∶105;western-blot、免疫组织化学分析和ELISA检测证实两株mcAb均与c-Crk有较高的特异性。结论本实验成功制备了两株抗c-Crk特异性的mcAb,可用于c-Crk免疫检测方法的建立。     

抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的产生

将SP 2/O-Ag 14/小鼠骨髓瘤细胞和用乙酰胆碱脂酶免疫的Balb/c小鼠脾细胞在PEG-1000作用下进行融合,获14株分泌抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体的杂交瘤细胞系。用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其分泌的抗体滴度进行了检测,其免疫鼠腹水滴度最高可达1:2 560 000。对其中5株杂交瘤分泌的滴度很高的抗体做了特异性交叉免疫试验,仅与乙酰胆碱脂酶发生特异反应,与其它4种酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶及胰蛋白酶)无交叉反应;对其中12株杂交瘤分泌的抗体还进行了免疫球蛋白类型鉴定及染色体检查。上述杂交瘤细胞经3～6个月稳定传代后冻存于液氮中1年多后复苏,其抗体水平未见下降。     

氯胺酮单克隆抗体的研制及其免疫学特性研究

目的：制备氯胺酮单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行分析。方法：采用丁二酸酐偶联法将氯胺酮（Ket）与BSA和OVA偶联合成人工完全抗原Ket—BSA和Ket—OVA,选择Ket—BSA免疫BALB／C小鼠,用Ket—OVA作包被抗原进行间接ELISA和竞争ELISA检测免疫小鼠血清效价,从而选择小鼠脾细胞为融合备用。应用杂交瘤技术制备氯胺酮单克隆抗体（Ket—McAb）,并对其效价、亲和性和特异性等进行鉴定。结果：成功地合成了氯胺酮人工完全抗原,用该抗原免疫小鼠产生高效价抗Ket抗体（1：12800）,并能被Ket单体抑制;建立了一株分泌稳定的单克隆抗体细胞株,细胞培养上清液的抗体效价为1：6400,腹水抗体效价为2×10^6;同种型为IgG2a,50％抑制浓度为80ng／ml,经鉴定能与Ket特异性结合与其它毒品类药物如冰毒、摇头丸,大麻、吗啡等无交叉反应。结论：抗氯胺酮McAb是一种特异的探针,对吸毒和戒毒病例的检测具有潜在的应用价值。     

抗重组人巨细胞病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得抗人巨细胞病毒(HCMV)单克隆抗体(McAb).采用重组HCMV(rhCMV)gp52蛋白片段免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,经ELISA法筛选阳性克隆及测定效价,用免疫印迹法进行特异性鉴定.最终获得4株(3E9,5A6,4G12,2H2)能稳定分泌高效价抗rhCMV McAb的杂交瘤细胞.其培养上清的ELISA效价分别为12048,11024,11024,1512;腹水效价分别为1×10-7,1×10-7,1×10-6,2×10-6.它们分别识别gp52蛋白上的2个不同的抗原表位,2H2识别gp52蛋白上的一个表位,3e9,5A6和4G12识别另一个表位.该单抗可作为快速诊断CMV感染的特异性抗体.     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

牛至油增强小鼠免疫功能的实验

目的：研究牛至油对小鼠免疫功能的影响。方法：采用ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）、NK细胞活性测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验等方法考察牛至油对小鼠免疫功能的作用。结果：牛至油在促进NK细胞活性和单核-巨噬细胞方面的具有明显的作用，但在ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力试验中并未表现出显著的差异。结论：牛至油确实具有增强机体免疫功能的作用。     

人3型副流感病毒感染小鼠模型的建立及免疫应答特点

目的  建立人3型副流感病毒（human parainfluenza virus type 3,HPIV3）感染小鼠模型,并研究其免疫应答特点。方法 用HPIV3兰州分离株HPIV3LZ1728C19毒株鼻腔接种BALB/c小鼠,每天检测体温和体质量。用ELISA检测血清HPIV3特异性IgG、IgA滴度,实时定量PCR检测鼻腔灌洗液和肺组织病毒滴度,流式细胞术检测外周血、肺、脾淋巴细胞中的HPIV3特异性IFN-γ CD4⁺和IFN-γ CD8⁺ T细胞,酶联免疫斑点法检测淋巴细胞中分泌HPIV3特异性IgG/IgA的B细胞,肺组织切片观察病理变化。结果 感染后第3天,小鼠鼻腔和肺的病毒负载量分别到达峰值10⁴拷贝/ml鼻洗液和10⁷拷贝/g组织,肺部发生炎症性病理变化。感染组早期体质量增加显著滞后于对照组（感染后第3天：t=4.64,P<0.05）。感染组血清中HPIV3特异性IgG（t=2.94,P<0.05）和IgA水平（t=18.66,P<0.05）显著增高,外周血、肺、脾均出现HPIV3特异性抗体分泌淋巴细胞。病毒感染诱导小鼠肺产生记忆性IFN-γ CD8⁺ T和IFN-γ CD4⁺ T细胞应答,脾和外周血产生IFN-γ CD4⁺ T细胞应答。结论 成功建立了HPIV3感染小鼠动物模型,感染小鼠产生了显著的肺黏膜体液和细胞免疫应答。     

氯霉素单克隆抗体的制备与纯化

目的制备氯霉素(CAP)单克隆抗体。方法用人工合成抗原氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体,用间接竞争ELISA法和间接ELISA测定抗体特异性。结果得到两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-4以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,回收率达80%,抗体活性好并且与BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等无交叉反应。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,对动物性食品中CAP的检测具有较大的价值。     

人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化

目的制备人绒促性素(hCG)单克隆抗体。方法hCG抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合,间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行克隆化培养;制备腹水抗体;间接ELISA法测定抗体效价;采用HiTrap rProtein A FF亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清中抗体效价达10-3以上,腹水抗体效价达10-7以上,纯化后的单抗纯度达98%以上,回收率达75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。     

肝癌组织γ-谷氨酰转移酶单克隆抗体制备及ELISA方法的建立

目的应用纯化的人肝癌组织中蔓陀罗凝集素(DSA)强结合的γ-谷氨酰转移酶(GGT)制备单克隆抗体(McAb),并建立ELISA检测方法。方法应用亲和色谱法纯化肝癌组织中DSA强结合的GGT;采用单克隆抗体技术获得其McAb;protein A-Sepharose亲和色谱法纯化McAb,过碘酸钠法标记HRP法后建立ELISA方法。结果获得5株能特异性识别DSA强结合GGT的McAb细胞株,其中3株细胞所分泌McAb具有较高的特异性,应用所获得McAb进行HRP标记后,建立的ELISA方法,其检测灵敏度为10μg/L,批内及批间平均变异系数为8.9%和11.5%。结论成功制备了DSA强结合的GGT McAb杂交瘤细胞系,并建立了ELISA免疫学检测方法,为临床应用打下基础。     

小鼠HSP27/HSPB1单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备针对热休克蛋白27/热休克蛋白B1(HSP27/HSPB1)的特异性单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用HSP27/HSPB1作为免疫抗原免疫BalB/c小鼠,通过常规杂交瘤技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞经PEG融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,进行克隆化培养后接种于小鼠腹腔制备HSP27/HSPB1单克隆抗体,并利用间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光技术对所制备的抗体进行鉴定。结果获得了一株可稳定分泌HSP27/HSPB1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为4C9C7,其亚类是IgG1,分泌的单克隆抗体能特异性结合组织和细胞中的HSP27/HSPB1蛋白。结论本实验成功制备了可稳定分泌HSP27/HSPB1单克隆抗体的杂交瘤细胞及HSP27/HSPB1特异性的单克隆抗体,可应用于各种相关的科学研究。     

抗紫杉醇单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗紫杉醇单克隆抗体并建立间接ELISA检测方法。方法:用琥珀酸酐法将紫杉醇(taxol)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制成全抗原taxol-BSA,采用紫外波长扫描法和薄层层析检测法对合成抗原进行鉴定;以taxol-BSA免疫Blab/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水。同时,对间接ELISA法反应条件进行了优化。结果:获得了3株能稳定分泌抗紫杉醇单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为taxol-A1,taxol-A2和taxol-A3;taxol-A3株腹水效价为1∶128 000,属于IgG2b亚型;建立的间接ELISA法检测条件为15μg.mL-1抗原、4℃包被过夜、1%BSA封闭1 h,PBS做抗体稀释液,单抗反应时间为30 min,酶标二抗作用时间1 h,10%浓硫酸终止反应。结论:获得了特异性的抗紫杉醇单克隆抗体并建立了间接ELISA检测方法。本研究制备的抗紫杉醇单克隆抗体及建立的间接ELISA检测方法,为从内生真菌生物合成紫杉醇发酵液中迅速、高效地分离纯化和检测紫杉醇奠定了基础。