利用多重荧光定量PCR检测阿胶原料驴、马、驴骡和马骡皮张的源性

目的 建立快速检测阿胶原料皮张源性的方法.方法 根据马、驴、驴骡和马骡的核基因肌酸激酶CKM和线粒体基因组DNA(mtDNA)的16S rRNA基因序列设计特异,并引入18S rDNA作为内参质控,建立能检测4种动物源性的5重多色荧光定量PCR检测体系.结果 本研究开发的引物和分子信标探针的特异性强,能同时区分同源性相近的驴、马、驴骡和马骡源性;灵敏度高,检测限为0.01 ng·μL-1.通过对某阿胶制品公司收购的驴皮源性检测,检测结果与DNA测序一致率达100％.结论 本方法在一管PCR反应中能同时检测4种动物源性,更简单、准确和高效,为驴皮、马皮及骡子皮张的源性鉴定探索了新的途径.     

应用线粒体12srRNA和COX-1基因进行种属鉴定

目的以线粒体DNA为目标序列,探讨生物检材的种属来源问题。方法收集人和7种动物的血液或肌肉组织样本,提取DNA定量后,复合扩增线粒体12srRNA和COX-1基因片段,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物谱带。结果人类DNA扩增产物分别为436 bp、277 bp两条谱带,而鼠、鸡、猪、兔、猫、狗、羊的扩增产物仅有一条谱带,430～450 bp,即动物基于COX-1基因片段无扩增产物。结论复合扩增线粒体12srRNA和COX-1两基因片段进行种属鉴定,方法简单,灵敏度较高,可应用于法医学实践。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的克隆、鉴定与扩增

目的 克隆SEA基因作为后续基因治疗的目的基因。方法 以金黄色葡萄球茵基因组DNA(ATCC-13565)为模板,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因特异性引物为介导，采用普通PCR和降落PCR方法分别克隆SEA基因全序列，克隆入T载体后进行DNA测序。结果 2％琼脂糖凝脂电泳和DNA测序证实该基因克隆成功。结论 通过PCR方法，可以获得后续实验所需的SEA基因。     

基于Cyt b基因的PCR技术对牛鞭药材的鉴定方法研究

目的:建立对牛鞭药材的聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法,从分子水平上对牛鞭药材的真伪进行鉴定。方法:提取牛鞭及其伪品(驴鞭、猪鞭、羊鞭)的基因组DNA,并对其完整性、纯度和浓度进行检测。利用GenBank相关信息,以牛鞭的线粒体细胞色素b基因(Cyt b)为靶基因,应用Primer-BLAST在线软件设计特异性引物,并对不同物种鞭类样品进行PCR扩增,对产物进行电泳分析;对获得的牛鞭样本PCR产物进行克隆和DNA测序验证。对所建立的PCR鉴定方法进行特异性和重复性考察验证。结果:提取所得的牛鞭及其伪品DNA的纯度较高,无蛋白质或RNA污染;1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示,牛鞭样本在200～300 bp之间均出现明显的目的基因条带,而其他伪品未见相应条带出现。DNA测序结果证实,所获牛鞭样本基因片段的核苷酸序列与GeneBank中牛鞭物种相似性均为100%。方法学验证结果显示所建方法特异性、重复性均良好。结论:本研究所建基于Cyt b基因的PCR鉴定方法简单、快速,准确性、特异性、重复性均良好,可满足牛鞭及其伪品的分析鉴定需求。     

全天麻胶囊中天麻的DNA鉴定

目的:通过DNA技术,检测全天麻胶囊中天麻药材是否掺伪。方法:提取全天麻胶囊和天麻对照药材的DNA,采用PCR技术对目的基因进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖凝胶成像系统检测和照相。结果:成功在某品牌的全天麻胶囊中检测出其采用天麻伪品马铃薯进行掺伪。结论:该方法特异性强、操作简单、准确性高,适用于全天麻胶囊的掺伪检测。     

4个地区独一味的ITS基因片段序列分析

目的：检测独一味的ITS基因序列片段,并利用ITS序列作为遗传标记分析了来自4个不同地区（甘南玛曲、西藏林芝、四川若尔盖道班、四川若尔盖热当坝）的独一味的遗传变异情况。方法：采用Plant DNA Mini Kit法作为基因组DNA提取的最佳方法,提取植物独一味的核基因组DNA,并且建立了适合独一味的PCR反应体系,利用合成的特异性PCR引物对所提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区序列进行套式扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到电泳图谱,并进行分析,测序。经Clusta 1X软件排序,MEGA3软件统计分析和分支分析,建立系统发育树,并计算各类群间的遗传距离。结果：琼脂糖电泳图谱及所测序列显示,来自于植物独一味的核DNA中rRNA基因内转录间隔区全长为670bp左右．甘南玛曲和西藏林芝的独一味遗传距离较小,四川与甘南玛曲和西藏林芝的独一味遗传距离较大。结论：基于ITS序列分析,作为品质突出的甘南玛曲独一味和其他地区的独一味相比,并未形成一个区别于其他地区独一味的一个独特的种。根据ITS序列特征所构建的系统树,与传统分类有所不同。     

实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究

目的 建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法。方法 选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭（PMA）抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增。结果 PMA能有效去除样品中死菌干扰,针对16S rRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度。在金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌检测中,最低含菌量组与阴性对照组Ct值有明显差异（P〈0.05）,其最低检出限为2 CFU/PCR。在对人工污染药品的无菌检测中,该方法与药典检测方法结果一致。结论 进行无菌检查时,采用PMA去除样品中死菌基因组DNA干扰,以裂解试剂盒抽提细菌基因组后用荧光定量PCR分析样品中细菌污染,可将检测时间缩短到4 h左右,操作简单,灵敏性高,可应用于药品无菌检查的快速筛查。     

荧光定量PCR检测重组人干扰素α2b中宿主基因组的残留DNA

目的 采用荧光定量PCR法检测注射用重组人干扰素α2b半成品中宿主基因组的残留DNA.方法 选择重组人干扰素α2b工程菌的宿主菌23S核糖体RNA基因为模板设计扩增引物,建立基于SYBR Green Ⅰ荧光染料的荧光定量PCR检测法.结果 宿主基因组DNA的量与荧光定量反应的Ct(循环阈值)值呈良好的线性关系(r~2=0.9803).结论 所用方法操作简便、快速,可用于重组人干扰素α2b制备过程中的质量监控及半成品的检定.     

人肥大细胞羧肽酶分泌型真核表达载体的构建

目的:构建人肥大细胞羧肽酶(hMC-CP)分泌型真核表达载体pcDNA3.1/CP.方法:用免疫球蛋白k链的信号肽序列置换hMC-CP自身的信号肽序列,设计并合成引物,以hMC-CP基因为模板,扩增带有分泌信号肽的hMC-CP基因,DNA测序鉴定正确后,将PCR扩增产物定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1,通过酶切和DNA测序进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增出一条特异条带,酶切鉴定和序列测定结果表明大小为1269bp的DNA片段插入表达载体.结论:成功构建了hMC-CP分泌型真核表达载体,为进一步制备真核表达的重组hMC-CP奠定了基础.     

苦豆子总碱诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的研究

目的探讨苦豆子总碱诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用.方法应用普通光镜和荧光显微镜及琼脂糖凝胶电泳分别检测凋亡小体和DNA梯状带.结果普通光镜和荧光显微镜凋亡率与对照组比较具有显著性意义(P＜0.01);琼脂糖凝胶电泳可见明显的DNA梯状带.结论苦豆子总碱具有诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的作用,其最佳的作用时间为72 h,最适剂量为1.0 g/L.     

电感耦合等离子体质谱法检测阿胶中6种有害元素的含量

目的:建立阿胶中铬、铜、砷、镉、汞、铅6种有害元素含量的测定方法。方法:微波消解法处理药材样品,用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测不同产地阿胶中6种有害元素的含量。结果:6种元素的检出限范围为0.001-0.105 ng.g-1;线性关系良好(r>0.9993);回收率为90%～115%,RSD小于15%。结论:本方法准确、灵敏、简便,可用于阿胶中有害元素的检测。     

阿胶现代研究进展

目的对阿胶的化学成分及有效物质基础、药理作用及其机理作用和质量标准等方面的研究作一总结,为阿胶的进一步研究和开发提供借鉴信息和思路。方法查阅整理近10年的研究文献资料和信息。结果与结论阿胶的化学成分及有效物质基础、药理作用及其机理作用和质量标准研究有较大的发展和突破。     

补血益母颗粒质量标准研究

目的研究补血益母颗粒中阿胶及黄芪的测定方法,为建立其质量标准提供数据依据。方法采用薄层色谱鉴别颗粒中的阿胶及黄芪,并以高效液相色谱法（HPLC）测定黄芪甲苷的含量。结果在薄层色谱中能清晰鉴别出阿胶及黄芪,HPLC法测定黄芪甲苷在1．01-50．10μg时线性关系良好（R2=O．9999）。结论薄层色谱法鉴别补血益母颗粒中阿胶及黄芪以及HPLC法测定黄芪甲苷的含量,方法简便准确,重现性好,专属性强,可作为补血益母颗粒的质量控制方法。     

山东阿胶膏的质量标准研究

目的:完善山东阿胶膏的质量标准。方法:采用薄层色谱法对山东阿胶膏中阿胶和甘草进行定性鉴别;用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法(HPLC-ELSD)测定黄芪中黄芪甲苷的含量。结果:应用所建立的方法对样品进行定性与定量分析,结果在TLC色谱中均可检出与对照品或对照药材相同的斑点,且阴性无干扰;黄芪甲苷进样量在1.032～6.192μg范围之间其对数值与峰面积对数值呈良好的线性关系,平均加样回收率为100.51%,RSD为1.43%。结论:该方法操作简便,重现性好,结果准确可靠,可用于山东阿胶膏的质量控制。     

煎药机制备中药汤剂方法探索

目的:探索医院中药汤剂煎煮与配制新方法。方法:采用HPLC法,以银翘散煎煮液中绿原酸等5个成分含量为指标,通过正交试验设计优化汤剂煎煮方法;采用目测法,以阿胶、川贝母在汤剂中的稳定性为指标,考察烊化和冲服中药的配制方法。结果:银翘散煎煮以中药饮片粉碎为最粗粉,浸泡15min,121℃加压煎煮20min为佳;阿胶、川贝母与汤液的配制可一次成型。结论:该方法操作简易,质量稳定,使用方便,可作为医院汤剂煎煮与配制的参考。     

动物胶类药材质量评价方法研究进展

阿胶、鹿角胶、龟甲胶等动物胶类药材为我国传统中医常用的补虚药,临床多用于滋阴补血,但是近年来伪、劣品扰乱了胶类药材市场,引起了医药行业的关注。传统药材性状鉴别主观因素较大,鉴别结果存在偏差。近十多年来,电泳、液相-质谱联用等技术用于胶类药材鉴别检测,专属性增强。本文总结中国药典及部颁标准中收载的胶类药材的相关报道,从化学成分、性状鉴定和质量控制方法3个方面进行综述,为控制和提高胶类药材质量提供理论依据和方法支持。     

胶液颜色与阿胶品质的相关性研究

目的研究胶液颜色与阿胶品质的相关性,快速评价阿胶的品质。方法采用分光测色仪、质构仪测定阿胶的颜色、凝胶强度,考察加热时间对阿胶颜色和凝胶强度的影响,并研究颜色与凝胶性以及成品阿胶块颜色与胶液颜色的相关性。结果阿胶浓缩出胶加热时间应控制在4~5 h,阿胶胶液颜色和凝胶强度相对稳定,且有一定关联性。成品阿胶块颜色值与出胶过程胶液颜色值呈显著的正相关性,阿胶胶液颜色值越小(颜色越深),阿胶胶块颜色值也越小(颜色深)。结论通过测定阿胶出胶过程胶液的颜色估算成品阿胶块颜色,为快速控制阿胶的外观、内在质量提供了定量的依据。     

Species identification of Asini Corii Collas (donkey glue) by PCR amplification of cytochrome b gene

Asini Corii Collas (ACC; donkey glue) is a crude drug used to promote hematopoiesis and arrest bleeding. Because adulteration of the drug with substances from other animals such as horses, cattle, and pigs has been found, we examined PCR methods based on the sequence of the cytochrome b gene for source species identification. Two strategies for extracting DNA from ACC were compared, and the ion-exchange resin procedure was revealed to be more suitable than the silica-based one. Using DNA extracted from ACC by the ion-exchange resin procedure, PCR methods for species-specific detection of donkey, horse, cattle, and pig substances were established. When these species-specific PCR methods were applied to ACC, amplicons were obtained only by the donkey-specific PCR. Cattle-specific PCR detected as little as 0.1 % admixture of cattle glue in the ACC. These results suggest that the species-specific PCR methods established in this study would be useful for simple and easy detection of adulteration of ACC.     

阿胶对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的：探讨阿胶对围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax表达的影响。方法：选用4月龄雌性大鼠为正常对照组,14月龄阴道细胞学表现为动情期延长的雌性大鼠为衰老大鼠模型。模型动物随机分别给阿胶或戊酸雌二醇片治疗。采用原位末端核苷酸标记法（TUNEL）检测卵巢细胞凋亡,免疫组化法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2,Bax。结果：阿胶高、中、低剂量组卵巢细胞凋亡阳性表达与模型组比较有显著性差异,同时可使卵巢凋亡基因Blc-2表达增强,促凋亡基因Bax表达减弱,Bcl-2/Bax比例增加。结论：阿胶通过抑制Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白表达,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,进而改善卵巢功能。     

胶类中药质量控制方法研究进展

对胶类中药质量控制方法的研究进展进行文献整理和分析。由于阿胶、鹿角胶、龟甲胶等胶类药材的独特疗效,其市场需求量大,导致原料资源供应不足,各企业产品真假优劣难辨、质量良莠不齐,因此若能针对其成分特点,建立专属性较强的胶类中药检测方法,将能有效地控制胶类药材的质量,促进胶类药材的合理使用,将对其发展产生深远影响。