NOD 小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究?方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll 密度梯度离心方法,分离纯化NOD 小鼠胰岛?应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖?体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE 染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况?结果 胰岛产率为(116 ±12)个胰岛/胰腺,纯度>90%?体外糖刺激实验结果显示,NOD 小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM 小鼠胰岛?胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖?体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2 周左右?HE 染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润?结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD 小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究?     

胎球蛋白B上调致糖尿病缺血/再灌注心肌易损性增加及机制

【立论依据】 糖尿病患者缺血性心脏病(IHD)的发病率及心肌损伤程度明显高于正常人群,亟需探寻有效防治措施。胎球蛋白B(Fet-B)是由肝细胞和心肌细胞合成并分泌的糖蛋白。我们预实验发现,2型糖尿病小鼠心肌Fet-B的表达较正常小鼠高出4.84倍,且能与心肌胰岛素受体结合,诱导胰岛素下游PI3K-Akt通路受损、葡萄糖转运子4转位减少,提示心肌Fet-B表达增加可能与心肌胰岛素敏感性受损有关。此外,转录调节因子FoxO1在糖尿病状态下表达增加,然而其与Fet-B高表达的关系尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在预实验基础上,在整体和细胞水平,运用药理学方法和基因干预手段研究:2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可否通过诱导胰岛素抵抗、从而使缺血/再灌注(I/R)损伤加重,并进一步探讨其机制。 【实验内容】 (1)研究糖尿病心肌Fet-B表达变化、并分析其与心肌胰岛素抵抗的关系:检测糖尿病小鼠血浆和心肌Fet-B水平,给或不给胰岛素,检测胰岛素下游信号;检测心肌FoxO1水平;分离乳鼠心肌细胞,分别用siRNA和腺病毒转染下调和上调FoxO1,检测Fet-B变化。(2)验证糖尿病心肌I/R损伤加重,分析其与Fet-B表达变化的关系:构建ob/ob小鼠心肌I/R模型,检测心肌损伤,分析其与Fet-B表达变化的关系。(3)基因水平验证FoxO1/Fet-B表达与I/R心肌损伤有关:构建Fet-B敲除小鼠I/R模型,给或不给胰岛素,检测心功能及心肌损伤、胰岛素下游信号;再给予Fet-B,检测是否加重心肌I/R损伤和心肌胰岛素抵抗。 【材料】 WT小鼠、ob/ob小鼠、Fet-B敲除小鼠、心肌I/R模型的手术器械、细胞培养所需试剂、细胞凋亡检测试剂盒、有关信号分子的抗体、siRNA和腺病毒、RT-PCR及蛋白质印迹仪器等。 【可行性】 本实验设计立足于前期预实验结果之上,所需实验技术均为常规技术,实验室具备所需仪器,动物与试剂均购到,可行性较好。 【创新性】 Fet-B在糖尿病及心脏方面的研究在国内外均无论文发表。我们首先提出2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可诱导心肌胰岛素抵抗,进而导致I/R心肌损伤加重的新机制,并得到预实验的支持,期望为临床防治糖尿病IHD提供新靶点。     

齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用

目的 观察齐墩果酸对糖尿病小鼠胰岛损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法 建立链脲佐菌素 (STZ) 诱导的糖尿病小鼠模型,ig 给予齐墩果酸3周。实验期间监测小鼠体质量、血糖的变化,实验结束后检测小鼠血清胰岛素浓度以及血清和胰腺中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 的活性以及丙二醛 (MDA) 的量。通过胰腺 HE 染色和胰岛素免疫组化分析胰岛的病理变化,应用 Western blotting 法检测胰腺组织中 NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表达量的变化。结果 齐墩果酸能增加糖尿病小鼠的体质量,降低糖尿病小鼠的空腹血糖,升高血清中的胰岛素浓度,显著提高血清和胰腺中 SOD 和 CAT 的活性,MDA 水平显著降低。HE 染色等形态学检测显示齐墩果酸能减轻小鼠胰岛萎缩,增加胰岛β细胞的数目。Western blotting 结果显示齐墩果酸增加胰腺组织内 IκBα 的表达,降低 NF-κB p65 蛋白表达。结论 齐墩果酸能减轻 STZ 诱导的胰岛损伤,可能是通过减轻氧化应激水平,减弱胰岛内 NF-κB 信号通路的过度激活而发挥保护作用。     

Exendin-4对AD样学习记忆减退的保护作用及其机制的研究

【立论依据】 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease AD)是一种慢性神经退行性疾病。异常过度磷酸化的细胞骨架蛋白Tau和神经丝(NFs)是早期病理改变,与胰岛素信号的失调存在密切关系。艾塞那肽Exendin-4是哺乳动物胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)受体的有效激活剂,能够增加葡萄糖的利用和代谢,与脑内GLP-1R结合后有神经保护作用。 【设计思路】 采用胰岛素抵抗的AD动物模型,研究艾塞那肽对AD样认知、记忆减退和神经纤维退行性变的影响;检测动物的学习记忆能力、胰岛素信号分子、NF的糖基化和磷酸化、突触素的表达水平,进一步阐明胰岛素信号和神经纤维退行性变的关系和可能的机制。 【实验内容】 (1)实验分组:本实验采用PS1/APP/Tau三转基因鼠(3×Tg-AD)和c57BL6小鼠(野生鼠),每种小鼠分4组:①、②组高糖高脂饲料饲养8周,腹腔注射STZ一次建立Ⅱ型糖尿病模型;③、④组腹腔注射生理盐水。①、③组皮下注射Exendin-4,给药治疗8周,②、④组不给药,等量注射生理盐水8周。(2)Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力。(3) 处死小鼠,迅速取脑,左半脑置于10%中性甲醛固定,病理切片用于免疫组织化学荧光。右半脑组织裂解匀浆,蛋白质印迹技术检测小鼠脑组织相关蛋白的改变。 ELISA检测各组小鼠脑内Aβ40和42的沉积。 【材料】 动物:PS1/APP/Tau三转基因鼠(3×Tg-AD)、c57BL6小鼠(野生鼠);试剂:链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、艾塞那肽(Exendin-4 ) 【可行性】 本团队前期Exendin-4对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的保护性实验,提示Exendin-4的保护作用,给我们后期动物实验打下的基础。 【创新性】 (1)本设计采用的Tau/APP/PS1三转基因小鼠,建立同时具有NFT和SP两种病理改变和学习记忆障碍的动物模型,能更好的模拟临床AD的发病过程和病理特征。(2)本设计建立胰岛素抵抗的AD模型,有利于阐明了胰岛素信号转导途径的失调在 AD的发病的重要作用。(3)本项目所要阐明的实验现象和机制,还没有相关的研究报告,有很好的创新性和前沿性。     

移植转导自身免疫调节因子的骨髓细胞对I型糖尿病预防和治疗的实验研究

【立论依据】 I型糖尿病又称自身免疫性糖尿病,是由于自身免疫耐受机制打破、自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞所致的自身免疫性疾病。迄今对自身免疫病的治疗方案多不理想,目前常规采用的免疫抑制手段不但降低患者免疫力,也使疾病容易复发。理想的治疗自身免疫病的策略是特异性清除自身反应性T细胞,重建对自身组织抗原的免疫耐受。而自身免疫调节因子(AIRE)恰在胸腺阴性选择中具有调控组织限制性抗原(TRAs)表达、促进自身反应T细胞的清除、参与免疫耐受诱导的功能。因此,我们设想利用基因转导手段操纵骨髓细胞中AIRE的表达,通过模拟胸腺的阴性选择,诱导免疫耐受,为I型糖尿病的防治提供新策略。 【设计思路】 本实验拟通过以自身免疫糖尿病小鼠(NOD鼠)为模型,移植表达AIRE的骨髓细胞,使其在NOD鼠体内通过调控TRAs的表达清除自身反应性T细胞,观察其诱导特异性清除对胰腺组织特异性T细胞的作用及对NOD鼠糖尿病发生的影响,探索I型糖尿病防治新方法。 【实验内容】 (1)构建编码小鼠AIRE的逆转录病毒载体,将其转导入骨髓DCs细胞。(2)将转导AIRE的骨髓DCs细胞移植至经放射线照射的NOD小鼠,获得NOD嵌合鼠。(3)采用流式细胞术检测NOD嵌合鼠胸腺和脾脏中GFP⁺细胞数量,检测NOD鼠嵌合程度。(4)采用real-time PCR法、流式细胞术检测Ins2 mRNA水平和蛋白水平表达变化,检测AIRE对TRAs的调控作用。(5)检测NOD鼠糖尿病发生时间和程度以及其病理学和胰岛素自身抗体的改变。 【材料】 NOD鼠、编码AIRE的逆转录病毒载体、real-time PCR仪、流式细胞仪、葡萄糖检测试剂盒、尿糖试纸、ELISA试剂盒等。 【可行性】 前期工作中,以胸腺阴性选择为理论依据,对AIRE的表达、分布及其在自身耐受中的作用进行了系统、深入的研究,现以基因转导和骨髓细胞移植为技术手段,切实可行。 【创新性】 本研究首次将基因操纵和骨髓细胞移植两大先进技术相结合,利用AIRE能特异性清除自身反应性T细胞的功能,探究治疗I型糖尿病的方法,为自身免疫疾病的防治提供新思路。     

左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响

【立论依据】 观察左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病(DN)小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白及Rho、ROCK蛋白表达的影响研究左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用及基于Rho/ROCK信号通路改善足细胞损伤的影响。 【设计思路】 MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。观察左归降糖益肾方对DN小鼠血糖、肾功能及Rho、ROCK蛋白表达等的影响研究其是否具有保护DN肾脏的作用及是否通过抑制Rho／ROCK信号通路改善足细胞损伤。 【实验内容】 8周龄MKR小鼠50只随机分为5组,空白组(A组)、DN组(B组)、DN＋左归降糖益肾方组(C组)、DN＋Rho/ROCK信号通路抑制剂Y-27632组(D组)、DN＋糖适平＋贝那普利组(E组)。B、C、D、E组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术后2周开始给药。C组小鼠给予中药提取液灌胃治疗30 d。D组小鼠给予Y-27632腹腔注射15 d(隔天注射)。E组给予糖适平＋贝那普利灌胃治疗30 d。A、B组则以等体积蒸馏水灌胃。30 d后处死小鼠。电化学法检测小鼠空腹血糖,全自动生化仪检测尿素氮、血肌酐,ELISA法测定尿微量白蛋白,免疫组化及蛋白质印迹法测定肾脏组织Rho、ROCK蛋白表达,光镜观察肾小球形态结构,电镜观观察足细胞形态结构。 【材料】 MKR小鼠、左归降糖益肾方、贝那普利、糖适平、Y-27632、高脂饲料等。 【可行性】 课题组前期研究表明高脂饮食联合右侧肾切除的MKR转基因2型糖尿病小鼠是良好的糖尿病肾病模型;左归降糖益肾方具有改善糖尿病肾病的作用。国内外研究中均表明抑制Rho／ROCK信号通路具有保护糖尿病肾脏的作用。故本实验基于Rho／ROCK信号通路研究左归降糖益肾方对糖尿病肾病的作用机制具有可行性。 【创新性】 (1)MKR转基因2型糖尿病小鼠给予高脂饮食联合右侧肾切除建立糖尿病肾病模型。(2)近年来研究发现Rho／ROCK信号通路在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用。本实验基于Rho／ROCK信号通路探讨左归降糖益肾方对糖尿病肾病足细胞损伤的影响。     

二甲双胍通过DEC1改善2型糖尿病小鼠脂代谢紊乱

【立论依据】 2型糖尿病(T2D)因胰岛素分泌相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低,表现高糖和高胰岛素并存的代谢病。常与肥胖、高血压、高血脂等共同发生发展。近年发现二甲双胍(metformin,M)不仅可下调血糖,改善胰岛素耐量,且具有抗炎、改善脂代谢的作用,但其中机制仍不清楚。转录因子DEC1与多种细胞功能如细胞的增殖和分化、自身免疫性疾病以及应激反应密切相关。新近发现:DEC1能与核受体(PXR/CAR/LXR/PPAR)的伴侣核受体RXRα结合,抑制代谢性核受体作用,Knockdown内源性DEC1后,明显增加LXR靶基因的表达,LXR在调节代谢脂类发挥重要作用,提示DEC1参与了体内物质代谢和能量代谢。本实验室发现,高糖和高胰岛素均能显著诱导小鼠脂肪和肝细胞DEC1表达,同时诱导脂质合成酶表达而抑制脂质分解酶表达;动物实验也显示在T2D小鼠脂肪和肝脏组织DEC1表达显著增加,给予二甲双胍能下调DEC1表达,并改善脂质代谢紊乱。因此提出二甲双胍通过DEC1改善T2D小鼠脂代谢紊乱的假设。 【设计思路】 在整体和离体水平研究并阐明二甲双胍通过DEC1改善T2D小鼠脂代谢紊乱。 【实验内容】 研究二甲双胍对T2D小鼠肝脏、脂肪组织和原代小鼠肝细胞脂质代谢紊乱的作用和机制。 【材料】 雄性C57小鼠分为对照组(C)、2型糖尿病组(T2D)和二甲双胍治疗组(T2D+M)3组,C组普通饮食,T2D组和T2D+M组高脂饮食, 第8周的第1天,腹腔注射30 mg/kg的链佐菌素,C组给予等体积溶剂1次,第9周的第1天,T2D+M组连续给予二甲双胍20 mg/(kg·d)灌胃4周,T2D给予等体积NS。第13周第1天处死小鼠。称重,取肝脏组织用油红O染色观察肝脏中性脂肪积累;提取肝脏和小肠S9成分,测定肝脏甘油三酯和总胆固醇含量;用蛋白质印迹法测定小鼠肝脏SREBP1c、ACC1和FAS以及Ces1d、Ces1e的蛋白表达水平。同时,培养原代小鼠肝细胞,在离体水平研究二甲双胍对小鼠肝细胞在高糖和高胰岛素脂质代谢的作用及其机制。 【可行性】 立项依据充分,前期结果支持,实验室有良好的经费和技术支持和保障。 【创新性】 首次提出以DEC1为靶标治疗2型糖尿病脂质代谢紊乱。     

基于TFH-B细胞轴探讨白芍总苷治疗CIA小鼠的作用机制

【立论依据】 类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病,其发病原因尚不明确,B细胞产生的抗体在RA的发病机制中起着重要作用,TFH是辅助B细胞主要的T细胞亚群。白芍总苷具有多途径抑制自身免疫反应,对类风湿关节炎具有确切疗效,因此,拟基于TFH-B细胞轴探讨白芍总苷治疗CIA小鼠的作用机制。 【设计思路】 通过白芍总苷对牛Ⅱ胶原诱导关节炎(CIA)小鼠脾脏中TFH-B细胞表型、mRNA表达水平、血清中相关细胞因子、Ig亚类的影响,初步探讨白芍总苷治疗CIA小鼠中对TFH-B细胞轴的影响。 【实验内容】 将DBA小鼠分为白芍总苷组、益赛普组、布洛芬组、模型组以及空白组,每组15只小鼠。通过牛Ⅱ胶原与弗氏佐剂1 d,14 d免疫小鼠,建立CIA小鼠模型。末次免疫后,各实验组小鼠隔日灌胃给药,并采用关节炎指数(AI)评分法每日评价小鼠关节炎症程度,至第28天。采用流式细胞术检测脾脏中CD3+CD4+CXCR5+ICOS+TFH细胞及B细胞的表型;荧光定量RT-PCR法检测脾脏中Bcl-6和ICOS表达水平;酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测血清中相关细胞因子IL-21、IL-17、TGF-β以及Ig不同亚类的水平;免疫组化方法检测脾脏中CXCR5+ICOS+TFH细胞、B细胞的分布及滑膜处炎细胞的浸润。 【材料】 流式细胞术抗体、细胞因子ELISA检测试剂盒、荧光定量PCR试剂盒等。 【可行性】 小组成员已掌握了CIA小鼠模型的建立方法以及小鼠的灌胃,尾静脉注射等实验技术,已发表相关SCI论文一篇。新疆医科大学基础医学院形态中心实验室及病原生物学重点实验室可提供实验所需设备及相关实验指导。 【创新性】 TFH是辅助B细胞功能主要的T细胞亚群, TFH对B细胞的相关调节作用在RA发病中相关机制的研究较少;白芍总苷对RA治疗作用的机制尚未有定论,通过测定小鼠脾脏中Bcl-6和ICOS转录水平,从转录水平、细胞因子水平及细胞水平探讨白芍总苷对TFH细胞的影响和作用机制。     

NADPH氧化酶来源的活性氧在2型糖尿病发生发展中的作用

【目的】 探讨NADPH氧化酶来源的活性氧在糖尿病发生发展中起到的作用。 【方法】 我们建立了长时程高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的大鼠模型来模拟人类2型糖尿病。在此模型基础上,运用常规的形态学和生物化学测定有关蛋白质的含量;运用免疫放射法测定胰岛素的含量。通过对糖代谢通路关键酶、血糖、胰岛素的测定来判定大鼠糖尿病的发生、发展。通过对大鼠体内ROS、MDA、TOAS的测定来判定大鼠体内氧化应激的状态。通过测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及糖原磷酸化酶的活性来反映大鼠糖代谢通路的变化。 【结果】 apocynin可以明显降低糖尿病大鼠的血糖升高水平,于此同时,在apocynin的干预下,糖尿病大鼠体内的氧化应激的水平比其它各组明显降低,其还可降低糖尿病大鼠肝脏糖原分解关键酶的活性、使其更接近于正常水平。 【结论】 NADPH氧化酶来源的活性氧可能通过糖原分解通路,对2型糖尿病的发生发展发挥作用。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。