高表达Kiss-1对结肠癌SW480细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨高表达Kiss-1基因对结肠癌SW480细胞增殖及迁移的影响.方法 将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480细胞设为实验组,将pEGFP-N1质粒转染至SW480细胞设为阴性对照组,将SW480细胞设为空白对照组,采用Western blot法检测各组细胞中Kiss-1表达量;采用CCK-8法分析Kiss-1对SW480细胞增殖的影响;并用划痕实验评估Kiss-1对SW480细胞迁移能力的影响.结果 将pEGFP-N1和pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞,检测实验组Kiss-1表达量增加,实验组细胞增殖率明显低于对照组(P＜0.05),且实验组细胞划痕损伤愈合的速度明显下降.结论 高表达Kiss-1可抑制结肠癌SW480细胞的增殖,降低细胞迁移速度.     

重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

转化生长因子β1基因转染对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对结肠癌细胞SW480体外增殖的抑制作用.方法:以腺病毒为载体将人TGF-β1基因导入体外培养的人结肠癌细胞株SW480, 应用免疫组织化学及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SW480细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白及mRNA的表达情况.通过MTT法检测转染后细胞增殖的抑制情况.结果:转染hTGF-β1基因后,与对照组相比,TGF-β1蛋白和mRNA在细胞中的表达均增强.SW480的增殖受到明显抑制(P<0.05),抑制率为60%～80%.结论:转染hTGF-β1基因对体外培养的结肠癌细胞SW480的增殖有明显抑制作用.     

SOX15基因对Caco2结肠癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

目的 检测SOX15在结肠癌细胞株中表达水平以及对细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的影响.方法 应用RT-PCR检测SOX15在Cac02、SW480、HT29、HCT116结肠癌细胞以及正常结肠组织中的表达水平.通过脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒pEGFP-N1-SOX15及空质粒pEGFP-N1转染进Caco2细胞,应用RT-PCR及Western blot分别检测SOX15在Caco2细胞中的mRNA以及蛋白表达水平;CCK-8检测SOX15对Caco2细胞活力的影响,克隆形成实验观察细胞增殖变化,Transwell检测SOX15对细胞迁移及侵袭能力的调控,流式细胞仪分析细胞凋亡率.结果 SOX15在Caco2、SW480、HT29、HCT116结肠癌细胞中mRNA及蛋白质表达明显低于其在正常组织中的表达水平(P ＜0.01).pEGFP-N1-SOX15转染组细胞mRNA(1.23 ±0.10)和蛋白(1.13±0.08)表达显著高于pEGFP-N1对照组[(0.54±0.06)、(0.19±0.03),P＜0.01]及空白对照组[(0.51±0.03)、(0.14±0.02),P＜0.01];与空白对照组及pEGFP-N1对照组相比,pEGFP-N1-SOX15转染组可明显抑制细胞增殖及迁移侵袭能力(P＜0.01),并诱导细胞发生凋亡(P＜0.01).结论 SOX15在结肠癌细胞中低表达,过表达SOX15可明显抑制结肠癌细胞Caco2的增殖及迁移、侵袭能力,并促进细胞凋亡.     

FHIT基因转染对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭力的影响

目的 探讨真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT对结肠癌细胞株SW480增殖和侵袭活性的影响。方法 将携有FHIT基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-FHIT体外转染SW480细胞（SW480-FHIT）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞（SW480-pRc/CMV2）和正常SW480细胞为对照,用RT-PCR检测FHIT的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭实验分别检测FHIT基因转染前、后SW480细胞增殖和侵袭活性的变化。结果 pRc/CMV2-FHIT的酶切鉴定证实含有目的基因FHIT;SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT实验结果显示重组质粒转染组SW480细胞的增殖明显受到抑制;Transwell体外侵袭实验显示转染pRc/CMV2-FHIT能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力(P<0.01)。结论 应用基因转染技术重表达FHIT基因能有效抑制细胞的生长、增殖及侵袭活性,为以FHIT为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

IFITM1对结肠癌SW480细胞增殖和黏附的影响

目的:研究干扰素诱导的跨膜蛋白1(IFITM1)对结肠癌细胞SW480增殖和异质黏附的影响. 方法:构建pEGFP-C3/IFITM1 重组质粒,重组质粒转染结肠癌细胞株SW480,G418筛选获得亚克隆细胞株,用激光共聚焦扫描检查绿色荧光蛋白. 生长曲线法检测细胞的增殖,细胞黏附实验检测细胞的黏附性. 结果: pEGFP-C3/ IFITM1重组质粒的测序序列与IFITM序列完全一致,重组质粒转染SW480细胞后,通过G418持续压力筛选获得亚克隆细胞株IFITM1/SW480. 激光共聚焦显微镜检查结果显示表达的绿色荧光蛋白位于IFITM1/SW480的细胞膜上,提示转染后IFITM1正确表达. 细胞生长曲线显示转染后的IFITM1/SW480细胞增殖活性比对照组增殖活性明显降低. IFITM1/SW480细胞黏附数30,60 min分别为(3.93±0.08)×103和(6.10±0.21)×103,而对照组 pEGFP-C3/SW480细胞黏附数30,60 min分别为(4.61±0.25)×103, (7.17±0.22)×103,IFITM1/SW480细胞黏附数比对照组细胞黏附数显著降低(P＜0.05). 结论:IFITM1可抑制SW480细胞体外增殖和异质型黏附.     

TGF-β1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建人转化生长因子-β1（TGF-β1）的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明TGF-β1在肝纤维化发生、发展中的作用以及建立相应的基因沉寂治疗途径奠定基础.方法：从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达.结果：通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致; 测序结果显示,于531位有1个碱基突变：T→C,为无义突变.通过RT-PCR和Western Blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子质量约为52ku（绿色荧光蛋白分子质量约为27ku）,说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达.结论：成功的构建了真核表达质粒pEGFP-N1-TGF-β1,并在真核细胞COS-7中表达,为进一步研究其在肝纤维化的基因治疗中奠定了基础.     

Kiss-1高表达抑制结肠癌侵袭与转移能力的影响

目的　探讨Kiss-1高表达对结肠癌SW480细胞侵袭与转移能力的影响,初步明确Kiss-1基因对基质金属蛋白酶-9（matrix　metalloproteinase-9,MMP-9）和MMP-2表达的影响。　方法　用脂质体转染方法将质粒pEGFP-N1-Kiss-1及pEGFP-N1空载体质粒瞬时导入结肠癌SW480细胞,细胞随机分三组：空白对照组、阴性对照组、实验组。应用Transwell实验检测结肠癌细胞的侵袭能力、Western-blot和Real-time　PCR分别从蛋白和mRNA水平检测Kiss-1表达对MMP-9、MMP-2表达的影响。　结果　成功将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒瞬时导入结肠癌SW480细胞。Transwell实验检测出实验组较阴性对照组和空白对照组能明显降低SW480细胞侵袭能力的作用（P<0.05）。Western　blot和Real-time　PCR检测出实验组Kiss-1　蛋白和mRNA表达水平较阴性对照组或空白对照组显著增加,而实验组MMP-9、MMP-2蛋白和mRNA表达水平显著降低,其差异均具有统计学意义（P<0.05）。　结论　Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表达,其调控机制可能与抑制结肠癌的侵袭和转移能力有关。     

Kiss-1与结肠癌SW480细胞增殖的关系

目的以结肠癌细胞SW480为模型,初步探讨Kiss-1基因过表达与结肠癌细胞增殖的关系。方法采用脂质体转染的方法将Kiss-1/pEGFP-N1重组质粒转染至SW480细胞,上调结肠癌细胞中Kiss-1的表达水平,经G418筛选出稳定表达株;根据细胞分为3组：阴性对照组（转染pEGFP-N1空载体）、实验组（转染pEGFPN1-Kiss1）及空白对照组（未转染）。Western blot检测转染后细胞中Kiss-1表达量的变化;采用CCK8试验分析Kiss-1对SW480细胞增殖的抑制效果。结果成功将pEGFP-N1-Kiss-1重组质粒转染至SW480结肠癌细胞,western blot检测出阴性对照组和空白对照组中显示Kiss-1低表达,实验组Kiss-1表达量增加,CCK8试验表明实验组细胞增殖率明显低于对照组（P〈0.05）。结论 Kiss-1可抑制结肠癌细胞的增殖率。     

人类乳头瘤病毒16 E7真核表达载体构建及对A431皮肤鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建HPV16 E7(E7)真核表达载体,观察E7过表达对A431细胞增殖和侵袭的影响.方法 从Casld细胞中抽提总RNA,针对E7序列设计特异引物,进行逆转录和聚合酶链式反应扩增得到E7 cDNA.应用基因工程方法将得到的PCR片段克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamaineTM2000转染A431细胞.Western blot检测E7在细胞中的表达.WST-1和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.ELISA检测TGF-β分泌情况.结果 经酶切、测序鉴定,E7基因正确插入到pEGFP-N1多克隆位点,获得pEGFP-E7;Western blot检测结果显示:与未转染组相比,转染组E7蛋白高表达.过表达E7的A431细胞增殖和侵袭能力均显著增强,细胞周期中S期细胞数量增多,G1期细胞数量相对减少.TGF-β分泌增多.结论 E7过表达可改变细胞周期,提高皮肤鳞癌细胞的增殖和侵袭能力,而分泌增多的TGF-β并不能抑制肿瘤的增殖和侵袭.