高通量测序技术的研究进展

高通量测序技术又称二代测序技术(NGS),与被认为是第一代测序技术的传统Sanger毛细管电泳测序方法相比,二代测序技术以更低的成本提供更高通量的数据,并实现大规模的基因组研究,单次运行数据量大,可以同时对数百万个DNA分子实施测序。随着当代科学技术的进步,二代测序平台已逐渐被引入包括肿瘤学在内的众多领域中,如临床诊断,农业基因组学和法医学等。尽管NGS目前已广泛用于目的性研究,但由于该方法的新颖性,在临床实践中的应用尚未完全指南式化,大多数临床医生对NGS认知及解读能力参差不齐。该文就NGS方法、原理及其优劣性进行综述,旨在帮助临床医生利用NGS技术对疾病进行更全方位的诊疗提供参考。     

单细胞测序在肿瘤基因检测中的研究进展

肿瘤是全球第二大死亡原因,但其发生、发展和转移的分子机制尚不明确,肿瘤的诊断、检测和治疗手段仍不完善。传统的高通量检测方法是对大量的混合细胞进行遗传信息的研究,把大量混合细胞的遗传信息进行平均化,这样不仅无法观察到各种类型的细胞之间的区别,还会掩盖一些重要且数量稀少的细胞的独特特征。单细胞测序技术为探究肿瘤在单细胞层面的变化提供了新的手段,同时为发现新的生物标志物和药物靶点,促进癌症诊断、监测和治疗提供了新途径。     

高通量测序技术在临床医学中的应用进展

高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表。高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。     

不同用量BigDye在HBV测序检测中的效果分析

目的:通过减少测序反应中BigDye的用量,以降低DNA测序的检测成本.方法:64份HBV DNA阳性血清随机分成两组(试验组、常规组),两组血清均用DNA测序法进行检测.其中BigDye的用量试验组为1 μL,常规组为2 μL.结果:试验组29份满意,常规组30份满意,P>0.05,两组阳性率相同.结论:测序反应中,BigDye的用量从2 μL减少至1 μL效果仍然满意,这是降低DNA测序成本的有效方法.     

焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的方法学比较

目的探讨焦磷酸测序法检测丙肝分型在临床应用中的准确性和敏感性,评价其方法的优缺点。方法收集100 例丙肝患者的血浆标本,分装相同的2 份,通过焦磷酸测序法和Sanger 测序法分别进行丙型肝炎病毒基因分型的检测,对两种测序方法的结果进行比较。结果焦磷酸测序法和Sanger 测序法检测HCVRNA基因分型时,100 例标本中,92例结果一致,8例结果不一致,一致率为92%。其中,HCV-RNA病毒载量>1×104 IU/ml 有80 例,其测序结果完全一致为100%,HCV-RNA 病毒载量<1×104 IU/ml 有20 例,其中焦磷酸测序共检测20 例,Sanger测序法共检测14 例,12 例结果相同。结论焦磷酸测序法检测丙型肝炎病毒基因分型,不仅结果准确可靠,而且与Sanger 测序法比较,其敏感性更高。此外,焦磷酸测序还可以进行定量分析。     

高通量基因测序技术在淋巴瘤中的应用进展

近年来,基于全基因组的高通量测序技术发展迅速,由于其速度快、准确率高、成本低等优点,目前已广泛应用在临床医学的各个领域,为亚型众多、治疗复杂的淋巴瘤研究带来了革命性变化,为筛选淋巴瘤的特异性诊断标志、研究疾病的发病机制、寻找预后指标及促进新药研发起到了极大的推动作用。     

不同用量BigDye在HBV测序检测中的效果分析

目的 :通过减少测序反应中 Big Dye的用量 ,以降低 DNA测序的检测成本。方法 :6 4份 HBV DNA阳性血清随机分成两组 (试验组、常规组 ) ,两组血清均用 DNA测序法进行检测。其中 Big Dye的用量试验组为 1μL,常规组为 2μL。结果 :试验组 2 9份满意 ,常规组 30份满意 ,P>0 .0 5 ,两组阳性率相同。结论 :测序反应中 ,Big Dye的用量从 2 μL减少至 1μL 效果仍然满意 ,这是降低 DNA测序成本的有效方法。     

高通量测序技术在口腔疾病中的应用进展

高通量测序技术即下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)或深度测序,广泛应用于全基因组和转录组的测序、基因组修饰的鉴定和蛋白质相互作用的分析。高通量测序技术不仅可以全面认识口腔微生物群落在健康和疾病状态下的特征,而且可以认识某种口腔微生物的生物功能及其在群落中的作用。对患者健康和患病细胞的基因组、外显子或转录组高通量测序的见解已经能够改善许多口腔疾病的诊断分类、预测和治疗选择。目前高通量测序技术在口腔疾病研究中应用广泛,本文将从高通量测序技术平台的发展及高通量测序技术在龋病、牙周病、口腔鳞状细胞癌和其他口腔疾病中的应用进行综述。     

ABI 377全自动DNA测序仪对测序模板和引物的要求

ＡＢＩ３７７ＤＮＡ测序仪是由美国应用生物系统公司（ＡＢＩ）生产的全自动测序仪。它采用平板式凝胶测序系统，操作方便灵活。因此，在参与人类基因组计划的测序仪中，ＡＢＩ３７７占了绝大多数。测序仪分析的ＤＮＡ样品——模板必须先经测序反应，即根据Ｓａｎｇｅｒ的末端终止法原理，通过ＰＣＲ以模板的碱基序列对应地将用４色荧光标记的４种双脱氧核糖核酸（ｄｄＮＴＰ）精确无误地接上，然后测序仪通过读取这４种ｄｄＮＴＰ的荧光信号获得待测样品的序列。笔者在实际工作中发现，测序结果的好坏并不是由测序仪的检测或其凝胶分离系统…     

二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用进展

<正>目前全球感染性疾病现状严峻,但感染病原体大多仍不明确,病原体的快速测定对临床医师指导临床用药非常重要。然而,目前的诊断方法在许多方面都是有限的,如检测范围、耗时、特异性和灵敏度。传统病原检测方法包括微生物培养、镜检、抗原/抗体的免疫学方法、鉴定、药敏在感染控制中发挥着重要作用。检测病原体特异核酸序列的 PCR方法和基因分型方法等,已经无法满足对病原谱全面检测的需要。     

长读长测序技术在肿瘤领域中的应用:进展与挑战

相较于目前普遍应用的二代测序（NGS）技术，长读长测序（LRS）技术是一种能够连续读取数百万个碱基对的测序技术。本文回顾了单分子实时测序技术、牛津纳米孔测序技术和新型单分子LRS技术在肿瘤领域的研究应用。LRS技术能够更精确地检测肿瘤基因组变异，包括结构变异、拷贝数变化、基因融合等。除基因组变异检测外，LRS技术还为描绘转录组图谱、表观遗传修饰图谱提供了有效手段。LRS技术可以有效弥补NGS技术的部分技术瓶颈，深入揭示生物大分子在健康和疾病状态下的复杂性状，为更好地理解肿瘤的发生与发展机制、制定治疗策略和开发药物提供新的理论基础。此外，本文还展望了LRS技术在肿瘤领域临床应用 中的潜在价值。     

噬菌体展示随机肽克隆的一种快速、高通量测序技术

目的:探索应用焦磷酸微测序(Pyrosequencing)技术建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。方法:环7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛后随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机7肽区序列,应用Pyrosequencing技术进行实时测序和分析。结果:应用Pyrosequencing技术对10例样品的随机7肽区进行序列分析,得到一个GXXXHPQ的同源基序(X为任意氨基酸),此基序为链亲合素的结合肽基序,结果与预期相符合。结论:Pyrosequencing技术具有操作简易快速、高通量的优点,必定可以广泛应用于各种随机肽库的筛选测序。     

纳米孔测序技术在血流感染病原学诊断中的应用和展望

血流感染(BSI)是由细菌、真菌和病毒等微生物引起的血液播散性疾病，可导致菌血症、败血症、感染性休克，严重危及人类生命健康。明确病原体是精准治疗BSI的重要核心。传统血培养是病原体诊断的金标准，其不足是耗时长，会产生假阴性结果等，在临床实践中具有一定的局限性。纳米孔测序作为新一代测序技术，能快速检测病原体，完成耐药基因、毒力基因检测，可优化临床治疗。本文就纳米孔测序技术在BSI中的应用现状进行综述。     

单细胞多组学技术和应用

单细胞多组学（Single-cell multi-omics）是指结合多种不同的生物学技术,对单个细胞进行多方面的分析和研究,从而获得更全面、更准确的单细胞数据。该技术包括单细胞基因组学、单细胞转录组学、单细胞蛋白质组学、单细胞表观组学等。单细胞多组学技术的发展为我们提供了一种更加精确理解生物体内复杂的细胞类型和功能的方式,尤其是对于异质性细胞群体中少数的特殊细胞类型如干细胞或罕见癌细胞,具有非常重要的应用价值。通过融合不同技术的信息,单细胞多组学可以更准确地描述单个细胞在多个生命事件和过程中的状态和变化,为生命科学的研究提供更加全面和深入的视角。本文系统概述了目前代表性单细胞多组学技术的发展现状,总结了其在生物学研究中的重要应用和巨大潜力。     

新一代高通量测序技术及其临床应用前景

自1987年美国Applied Biosystems (ABi) 公司推出第一台自动化测序仪-ABi370以来,Sanger测序法以其可靠、准确、读长高等优点而得以迅速发展,并被广泛运用于科研和临床工作.但Sanger测序法的局限性在于对电泳分离技术的依赖,以及无法再进一步地扩大并行和微量化,造成该技术对不同生物基因组进行序列测定的规模限制和代价高昂,绘制第1张人类基因组图谱前后共耗费13年时间,显然不是一个临床所能接受的速度.     

基于二代测序技术的转录组测序生物信息分析

随着二代测序技术和生物信息学的发展,越来越多的科研人员通过转录组测序(RNAseq)研究基因表达调控、疾病发生机制和遗传育种上的问题。面对测序所产生的大量数据,生物信息学分析策略对于数据的解读显得尤为重要。本文结合不同RNA(mRNA、LncRNA、miRNA和circRNA)的特点,对转录组测序中的几类分析流程及其所涉及的软件和数据库分别做简要的介绍,为RNAseq的生信分析研究提供参考。     

高灵敏度焦磷酸测序平台的建立及应用研究

焦测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的测序技术,在进行DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,可实现自动化。但其应用过程中存在3个技术瓶颈：一是测序试剂灵敏度低、成本高;二是测定仪器价格昂贵;三是测序模板制备过程繁琐。本课题组针对这些技术瓶颈,提出了一整套解决方案,包括高灵敏度焦测序反应试剂的研制、小型便携式焦测序仪的研制、测序模板的制备方法研究等。建立的高灵敏度微型化焦测序平台在分子诊断的各个领域得到了充分的应用,如细菌病毒转基因成分等的序列测定、单核苷酸多态性测定、拷贝数变异测定、基因突变位点测定、microRNA测定、基因表达量测定和药物基因组学研究,具有测序灵敏度高、仪器体积小、成本低、操作简便快速等优点,应用前景广阔。本文详细介绍了本课题组在提高焦磷酸测序反应灵敏度、简化测序过程、改进测序仪器和拓展焦磷酸测序应用范畴所做的系列创新性工作。     

基于 Ion Torrent 测序平台技术的肿瘤基因检测及临床应用

目的：探讨Ion Torrent基因测序技术对肿瘤基因突变检测的准确性和临床适用性。方法提取110例癌症患者的石蜡包埋组织 DNA,采用 Ion Torrent 基因测序技术检测患者的22个肿瘤基因,即 EGFR、ERBB2、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、ALK、KRAS、NRAS、BRAF、MAP2K1、STK11、PTEN、PIK3CA、AKT1、DDR2、NOTCH1、TP53、FBXW7、SMAD4、CTNNB1,用Sanger测序法对部分基因突变位点进行验证。结果110例患者中,肺癌40例,结直肠癌40例,恶性黑色素瘤30例,基因突变检出率为100％,且所有病例均至少发生3个基因突变。 EGFR、FGFR3突变率均为100％,FGFR2、MAP2K1、NOTCH1突变率均为0;TP53、EGFR、KRAS突变型别多达43、15、12种,而FGFR3、ERBB4、FGFR1突变型别均有且只有1种。除了EGFR、TP53,其他基因在同一样本单型别突变率均＞90％。多基因突变个数在3种癌症组间的差异无统计学意义（ P＞0．05）。 KRAS在结直肠癌的突变率较高（P＜0．01）,BRAF在恶性黑色素瘤的突变率较高（P＜0．01）。结论 Ion Torrent测序技术准确性高、测序时间和成本低、操作简单,适合大规模地应用于恶性肿瘤的早期筛查和诊断、个体化治疗以及肿瘤基因的临床研究。     

基于Cas9靶向富集的纳米孔高通量基因测序技术的应用进展

高通量测序已逐渐成为医学与生命科学领域的一种重要技术方法,但全基因组序列分析的复杂性和测序的高成本仍是目前高通量测序的障碍。靶向测序是一种捕获基因组特定区域DNA并进行高深度测序的方法,它在遗传性疾病、癌症测序和精准医学等方面具有广泛应用。目前常见的靶向富集方法主要有杂交捕获法和多重PCR扩增法。杂交捕获法过程繁琐、成本昂贵,PCR扩增法容易受扩增效率影响导致靶序列文库丰度不均匀,且会丢失DNA序列的表观修饰信息。近年来,基于纳米孔测序平台开发了CRISPR/Cas9靶向富集高通量测序方法（nCATs）,可在无需PCR扩增的条件直接对感兴趣的基因位置进行靶向测序。该方法具有直接识别碱基修饰、读长长、实时检测、速度快等优势,在基因结构性变异、突变检测和基因的甲基化修饰检测等方面展现了良好应用前景。尤其是在融合基因的检测方面,该技术通过结合生物信息学的分析工具可检测新的融合基因和断裂位点,在临床诊疗方面具有重要的指导意义。本文将对CRISPR/Cas9靶向富集纳米孔基因测序技术的基本原理和上述应用场景进行综述,并重点阐述该技术在融合基因检测方面的最新进展。