脊髓DNA甲基化对吗啡在神经病理性疼痛中作用的影响

目的:探讨吗啡(morphine)在神经病理性疼痛中作用下降的表观遗传学机制。方法:42只SD雄性大鼠鞘内置管后随机分为6组(n=7):假手术组(Ⅰ组),坐骨神经慢性卡压(CCI)+生理盐水(NS)1组(Ⅱ组),CCI+5氮杂胞苷(5-aza)组(Ⅲ组),CCI+NS2组(Ⅳ组),CCI+NS+morphine组(Ⅴ组),CCI+5-aza+morphine组(Ⅵ组)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ组手术后0-14d每日鞘内注射10μlNS,Ⅲ、Ⅵ组0-14d每日鞘内注射10μl5-aza(10μmol)。CCI后21d取Ⅰ-Ⅲ组脊髓腰膨大检测总体甲基化和μ阿片受体(MOR)mRNA水平;Ⅳ-Ⅵ组鞘内注射10μlNS(Ⅳ组)和30μg吗啡(Ⅴ、Ⅵ组),注射后0,15,30,45,60min测定机械和热痛阈。结果:Ⅱ组脊髓甲基化水平高于Ⅰ、Ⅲ组,MOR表达水平低于Ⅰ、Ⅲ组,Ⅰ、Ⅲ组之间无差异;Ⅴ、Ⅵ组鞘内给予吗啡后30min机械痛阈和热痛阈明显升高,均高于Ⅳ组,Ⅵ组最高。结论:DNA甲基化可能降低了CCI大鼠脊髓MOR表达,从而影响了阿片药物的镇痛作用。     

不同时间针刺足三里穴对炎性大鼠脊髓、背根神经节中TRPV4蛋白表达的影响

目的研究不同时间针刺足三里穴对炎性大鼠脊髓及背根神经节中香草酸瞬时电位受体4(TRPV4)蛋白表达的影响。方法将54只清洁级的雄性SD大鼠驯化7 d后,进行基础痛阈筛选,然后按痛阈结果随机分组为造模组36只、空白组18只,造模组在右足足垫部皮内注射完全弗氏佐剂0.1 mL,空白对照组注射0.1 mL生理盐水。造模成功的大鼠又按照基础痛阈随机分为模型组18只和针刺组18只,每组按照不同的处理时间又分为ZT8(15:00)、ZT16(23:00)2个时间亚组,每组9只。在2个时间点进行处理,针刺组在相应时间点手针针刺患侧足三里30 min,其间每5 min捻转1 min,频率为120次/min,模型组、空白组捆绑固定30 min,不做其他处理,1次/d,共治疗7 d。在第7天治理结束后检测相应时间点大鼠的痛阈,痛阈检测后取材,提取大鼠腰椎4～6的脊髓及背根神经节,采用免疫组化的方法检测大鼠背根神经节以及脊髓中TRPV4的表达。结果①在ZT8时间点:模型组大鼠与空白组相比,背根神经节中TRPV4表达量显著增加(P<0.01);脊髓组织TRPV4蛋白表达量明显上调(P<0.05)。针刺组大鼠与模型组相比,针刺组背根神经节TRPV4表达量显著下降(P<0.01),脊髓组织TRPV4蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。②在ZT16时间点:与空白组相比,模型组大鼠背根神经节TRPV4表达量明显增加(P<0.05),脊髓组织TRPV4蛋白表达量明显上调(P<0.01)。与模型组相比,针刺组大鼠背根神经节TRPV4表达量无明显差异(P>0.05),脊髓组织TRPV4蛋白表达量降低(P<0.05)。结论炎性痛能够诱发大鼠脊髓和背根局部神经节TRPV4蛋白表达的上调;针刺足三里穴能够调节炎性痛大鼠脊髓与背根神经节TRPV4的蛋白含量。     

小剂量氯胺酮对慢性神经痛大鼠的镇痛效应和背根神经节P2X3受体表达的影响

【 目的 观测腹腔注射小剂量氯胺酮对慢性神经痛大鼠镇痛效应和背根神经节P2X3受体表达的影响，以探讨其在神经性疼痛中的作用。方法 大鼠随机分为4组：空白对照组(C组)、假手术组(S组)、腹腔注射生理盐水组(NS组)与氯胺酮组(K组)，每组8只。在大鼠右后足检测冷刺激反应、热痛敏阈基础值后，腹腔注射10%水合氯醛400 mg∕kg进行麻醉。NS组和K组构建大鼠右侧坐骨神经慢性结扎损伤模型，S组暴露坐骨神经但不结扎，C组不进行手术。手术后K组每天上午10时腹腔注射10mg·kg-1氯胺酮(用生理盐水稀释至0.5ml)，NS组则腹腔注射等量生理盐水，连续2周。14d后测定各组大鼠右后足冷刺激反应、热痛敏阈值。尔后各组取手术侧L4背根神经节，并采用免疫组化法观测P2X3受体的表达。结果 手术后14 d，NS组和K组大鼠右足热痛敏阈值均明显低于C组和S组（P<0.05），冷刺激反应则显著高于C组和S组（P<0.05）；但K组大鼠右足热痛敏阈值明显高于NS组，而冷刺激反应明显低于NS组(P<0.05)；NS组和 K组大鼠背根神经节P2X3受体免疫反应阳性细胞数量多于C组和S组，但K组显著少于NS组比较则明显降低(P<0.05)；NS组与S组大鼠背根神经节神经元P2X3受体免疫组化评分高于C组和S组，而K组却低于NS组，(P<0.05)。结论 腹腔注射小剂量氯胺酮可提高慢性神经性疼痛大鼠痛敏阈值及减弱冷刺激反应，其作用机制可能与减少背根神经节神经元P2X3受体表达有关。 【关键词】背根神经节 神经痛 氯胺酮 三磷酸腺苷 P2X3     

大鼠初级感觉神经元内PKA/CREB通路在骨癌痛中的作用

目的:观察蛋白激酶A拮抗剂H-89对骨癌痛大鼠疼痛行为和背根神经节环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平的影响。方法:1检测骨癌痛大鼠背根神经节CREB磷酸化水平:将32只雌性SD大鼠随机分为假手术组和骨癌痛组(n=16),分组后在大鼠右侧胫骨髓腔内分别注射PBS或乳腺癌Walker 256细胞,肿瘤细胞接种后1,3,7,10,14 d检测大鼠机械痛阈,第14天提取骨癌痛组大鼠第2至第5腰椎右侧的背根神经节,应用免疫印迹法检测磷酸化CREB(p-CREB)的表达量。2检测H-89对大鼠疼痛行为及CREB磷酸化的影响:将32只骨癌大鼠随机均分为DMSO组和H-89组。在肿瘤细胞接种后的第9天至第14天每天鞘内注射DMSO或H-89。分别在给药前、给药后15,30,45和60 min进行疼痛行为测试。在第14天最后一次鞘内给药1 h后,快速提取大鼠右侧背根神经节,应用免疫印迹法检测p-CREB的表达量。结果:与假手术组比较,骨癌痛组大鼠机械痛阈明显降低,背根神经节中CREB磷酸化水平升高(P<0.05)。鞘内注射DMSO或H-89后,H-89组大鼠机械痛阈较DMSO组明显升高。同时H-89组CREB磷酸化水平较DMSO组明显降低(P<0.01)。结论:蛋白激酶A通过CREB磷酸化加剧大鼠骨癌痛。     

鞘内注射吗啡联合氯胺酮对切口痛大鼠脊髓兴奋性氨基酸的含量及谷氨酸转运体-1 mRNA表达水平的影响

目的 探讨鞘内注射吗啡联合氯胺酮对切口痛大鼠脊髓兴奋性氨基酸(EAAs)的含量及谷氨酸转运体-1(GLT-1)mRNA表达水平的影响.方法 成年雄性Sprague-Dawley大鼠125只,体重为250～300 g,随机分为5组,每组各设5个时间点,每个时间点5只大鼠.按Brennan法制备大鼠急性切口痛模型.假手术组(Ⅰ组),0.9%氯化钠溶液组(Ⅱ组)于术后鞘内注射0.9%氯化钠溶液25μL,吗啡组(Ⅲ组)于术后鞘内注射吗啡10μg,氯胺酮组(Ⅳ组)于术后鞘内注射氯胺酮100 μg,吗啡联合氯胺酮组(Ⅴ组)于术后鞘内注射吗啡5μg+氯胺酮50 μg;Ⅲ～Ⅴ组鞘内给药时均以0.9%氯化钠溶液稀释至20μL,注射药物后再以0.9%氯化钠溶液5霯冲洗导管.分别于术后1、2、6、12、24 h(T1～T5)5个时间点,应用von Frey丝线测定大鼠后爪机械缩足阈值(PWT)、随后取大鼠腰段脊髓,测定EAAs[谷氨酸(GLU)、天冬氨酸(ASP)]的含量;应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测T5时间点的大鼠腰段脊髓GLT-1 mRNA的表达水平.结果 与Ⅰ组相比,除Ⅲ组在T1时间点外,Ⅱ～Ⅴ组在术后各时间点的PWT均显著降低(P值均＜0.05);Ⅲ和Ⅴ组T1、T2时间点以及Ⅱ和Ⅳ组术后各时间点的脊髓GLU、ASP含量均显著升高(P值均＜0.05).与Ⅱ组相比,Ⅲ～Ⅴ组在术后各时间点的PWT均显著升高(P值均＜0.05),Ⅳ组在T1、T2时间点以及Ⅲ和Ⅴ组在术后各时间点的脊髓GLU、ASP含量均显著降低(P值均＜0.05).与Ⅲ组相比,除T1时间点外,Ⅴ组在术后各时间点的PWT均升高;Ⅳ组在T3～T5时间点的脊髓GLU、ASP含量显著升高(P值均＜0.05),Ⅴ组在T1、T2时间点的脊髓GLU、ASP含量显著降低(P值均＜0.05).与Ⅳ组相比,Ⅴ组在术后各时间点的PWT均显著升高(P值均＜0.05),脊髓GLU、ASP含量均显著降低(P值均＜0.05).Ⅱ～Ⅴ组在T5时间点的GLT-1 mRNA表达水平均较Ⅰ组显著减少(P值均＜0.05),Ⅲ～Ⅴ组的GLT-1 mRNA表达水平均较Ⅱ组显著增加(P值均＜0.05),Ⅴ组的脊髓GLT-1 mRNA表达水平均较Ⅲ、Ⅳ组显著增加(P值均＜0.05).结论 在大鼠切口痛模型中,鞘内注射吗啡联合氯胺酮可减轻大鼠急性切口痛,可能与其降低大鼠脊髓EAAs含量和改变GLT-1 mRNA表达水平有关.     

鞘内转染Ad-hNGFβ-EGFP对神经病理痛大鼠背根神经节CGRP和SP表达的影响

目的:探讨鞘内转染携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒介导的人神经生长因子β(Ad-hNGFβ-EG-FP)对神经病理性痛大鼠背根神经节(DRG)降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质(SP)表达的影响。方法:48只雄性SD大鼠制备坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型,分别鞘内注射人工脑脊液(CSF组)或Ad-hNGFβ-EGFP基因(Ad-hNGFβ-EGFP组),于术前1 d、转染后4～28 d测定热痛阈、机械痛阈,进行行为学评分。分别于转染后4、71、4及28 d结扎L4～6背根神经节,免疫组织化学法测定DRG中CGRP和SP的表达。另设假手术组进行对比。结果:CSF组和Ad-hNGFβ-EGFP组行为学评分升高,机械痛阈及热痛阈均降低(P<0.01),2组背根神经节SP及CGRP表达均明显高于假手术组(P<0.05,P<0.01)。结论:鞘内转染Ad-hNGFβ-EGFP基因可通过降低背根神经节SP及CGRP含量而减轻大鼠痛觉过敏。     

CD147参与大鼠神经病理性疼痛发生与发展中的作用

目的 探讨CD047在大鼠神经损伤后痛觉敏化形成中的作用.方法 分别采用免疫荧光染色法和Western blotting法检测大鼠脊神经结扎(SNL)后脊髓与背根神经节CD147的表达,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠背根神经节内CD147 mRNA的表达.大鼠背根神经节内注射CD147过表达RNA或干涉RNA后,观察机械性缩足反应阈值(MWT)的变化.结果 正常大鼠脊髓几乎不表达CD147,且SNL后脊髓CD147表达几乎无变化;正常大鼠背根神经节有少量CD147表达,SNL后CD147和mRNA表达均升高;大鼠背根神经节内注射对照RNA或过表达RNA后,对照组大鼠MWT未见明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05),RNA过表达组大鼠的痛域降低,差异有统计学意义(P＜0.05).大鼠背根神经节内注射对照RNA或干涉RNA后,对照组MWT下降,干涉RNA组痛域亦下降,但仍高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 外周神经损伤后,大鼠背根神经节内CD147及其mRNA表达均上调;CD147过表达可诱发神经病理性疼痛,干涉CD147 RNA表达,抑制神经病理性疼痛.     

鞘内注射TRESK-shRNA慢病毒对大鼠痛阈及脊髓JNK磷酸化的影响

目的 评价鞘内注射TRESK-shRNA慢病毒对大鼠痛阈及脊髓JNK磷酸化的影响.方法 健康雄性SD大鼠,体质量200～ 250 g,进行鞘内置管术.取鞘内置管成功的大鼠36只,采用随机数字表法分为3组(n=12):空白对照组(C组)、TRESK-shRNA慢病毒组(TRESK组)和阴性慢病毒组(V组).TRESK组和V组分别鞘内注射TRESK-shRNA慢病毒和阴性慢病毒,10 μL慢病毒,病毒滴度为1×108 IFU/mL,1次/d,连续7 d;C组于相同时点鞘内注射10 μL生理盐水.各组大鼠分别于鞘内注射前1d(T0)及鞘内注射1 d(T1)、3 d(T2)、5d(T3)、7 d(T4)测定机械刺激缩足阈(MWT)和热刺激缩足潜伏期(TWL).鞘内注射7d疼痛行为学测定结束后处死大鼠,取L4-5段背根神经节(DRG)和脊髓组织,realtime PCR检测背根神经节TRESK mRNA表达,Westem blot 检测脊髓JNK磷酸化水平.结果 TRESK组T3、T4时的MWT明显低于C组(P＜0.05).与C组相比,TRESK组L4～5术侧DRG的TRESK mRNA表达明显降低(P＜0.05).与C组相比,TRESK组L4-5脊髓的JNK磷酸化水平明显增高(P＜0.05).结论 鞘内注射TRESK-shRNA慢病毒可降低大鼠的机械痛阈,可能与激活脊髓JNK磷酸化有关.     

鞘内注射吗啡联合巴氯芬对切口痛大鼠脊髓兴奋性氨基酸含量的影响

目的 探讨鞘内注射吗啡联合巴氯芬对切口痛大鼠脊髓兴奋性氨基酸(EAAs)含量的影响.方法 成年雄性Sprague-Dawley大鼠125只,体重250～300 g,随机分为5组,每组设5个时间点,每个时间点5只大鼠.按Brennan法制备大鼠急性切口痛模型.Ⅰ组为假手术组;Ⅱ组术后鞘内注射0.9%氯化钠溶液25 μL;Ⅲ组术后鞘内注射吗啡10 μg;Ⅳ组术后鞘内注射巴氯芬1μg;Ⅴ组术后鞘内注射吗啡2μg+巴氯芬0.5 μg.Ⅲ～Ⅴ组鞘内给药分别用0.9%氯化钠溶液稀释至20μL,注射药物后再用0.9%氯化钠溶液5μL冲洗导管.采用von Frey纤毛测定1(T1)、2(T2)、6(T3)、12(T4)和24 h(T5)各时间点大鼠后爪机械刺激缩足阈值(PWT值),随后取大鼠腰段脊髓,测定谷氨酸(GLU)、天冬氨酸(ASP)含量.结果 除Ⅲ组T1时间点外,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组在其余给药后各时间点的PwT值均显著低于Ⅰ组(P值均<0.05).Ⅲ和Ⅴ组在T1和T2时间点、Ⅱ和Ⅳ组在给药后各时间点的脊髓EAAs含量均显著高于Ⅰ组(P值均<0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组在给药后各时间点的PwT值均显著高于Ⅱ组(P值均<0.05).Ⅳ组在T1和T2时间点、Ⅲ和Ⅴ组在给药后各时间点的脊髓EAAs含量均显著低于Ⅱ组(P值均<0.05);除T1时间点外,Ⅴ组在给药后各时间点的PWT值均显著高于Ⅲ组(P值均<0.05).Ⅳ组在T3～T5时间点的脊髓GLU、ASP含量均显著高于Ⅲ组(P值均<0.05)、Ⅴ组的T1和T2时间点脊髓EAAs含量均显著低于Ⅲ组(P值均<0.05),Ⅴ组在给药后各时间点PWT值均显著低于Ⅳ组(P值均<0.05).Ⅴ组在T1、T2时间点的脊髓GLU、ASP含量均显著低于其他4组(P值均<0.05).Ⅴ组在给药后各时间点脊髓EAAs含量均显著低于Ⅳ组(P值均<0.05).结论 在大鼠切口痛模型中,鞘内注射吗啡联合巴氯芬可减轻大鼠急性切口痛,其机制可能与其降低大鼠脊髓EAAs含量有关.     

炎性痛大鼠脊髓和背根节P2X_3受体的表达变化

目的观察足底皮下注射角叉菜胶致炎后大鼠行为学及脊髓背角和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)P2X3受体表达的变化。方法通过热辐射刺激法及von Frey纤维丝测定大鼠痛阈,应用免疫组化技术观察足底皮下注射角叉菜胶后不同时间其相应节段(L4～L6)脊髓及背根神经节P2X3受体表达的变化。结果足底皮下注射角叉菜胶后动物出现热痛敏和机械性痛敏,热痛阈和机械痛阈均下降,于12 h达最低,72 h后恢复至正常水平。免疫组化显示相应节段(L4～L6)脊髓背角P2X3受体免疫反应在注射角叉菜胶24 h后明显增强(P<0.01),72 h表达强度最高,168 h恢复至正常,并且相应节段背根神经节P2X3受体阳性神经元数12 h开始明显增加(P<0.01),持续至72 h,168 h恢复至正常。结论角叉菜胶所致炎性痛大鼠,脊髓背角和背根神经节P2X3受体活化,表达明显上调,表明P2X3受体在炎性痛的发生、发展中起重要作用。