十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的制备

目的 :为了提高拉米夫定 (lamivudine ,LA)的疗效 ,降低其毒副作用 ,制备十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒(LAP SLN) .方法 :在二环己基碳二亚胺和 4 二甲氨基吡啶存在时 ,LA与十六酸反应 ,制备十六酸拉米夫定酯 (lamivudylpalmitate,LAP) ,并测定其核磁共振氢谱 .RP HPLC测定其在正辛醇和磷酸盐缓冲液中的分配系数及不同 pH缓冲液和组织匀浆中的稳定性 .采用薄膜分散法制备LAP SLN ;透射电镜研究其形态、粒径及粒径分布 ;RP HPLC测定载药量、包封率 .结果 :LAP在弱酸性溶液中较稳定 ,在弱碱性溶液中水解较快 ;在血清和组织匀浆中易水解 ,在肝匀浆中水解最快 ;LAP分配系数为 5 2 .2 .LAP SLN粒径为 (2 81± 98)nm ,载药量为 9.6 % ,包封率为 97.7% .结论 :LA转化成LAP后亲脂性增加 ;LAP SLN包封率较高 ,粒径分布较均匀     

激光共聚焦显微镜检测紫花地丁水浸出物对HBV的影响

目的通过免疫荧光技术和激光共聚焦技术观察紫花地丁水浸出物对HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的影响。方法以HepG2.2.15细胞作为研究模型,选用拉米夫定作为阳性对照药物,采用LSCM观察紫花地丁水浸出物作用3d后,免疫荧光技术标记的细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg的变化。结果紫花地丁对HepG2.2.15细胞内三种抗原均有抑制作用,且优于拉米夫定。拉米夫定对细胞内HBcAg无明显抑制作用。结论紫花地丁对HepG2.2.15细胞内HBsAg、HBeAg和HBcAg有抑制作用。     

壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究

目的 制备壳聚糖-碳纳米颗粒并研究其理化性质和体外活性。方法 首先，用溶胶法制备出分散性良好的碳纳米粉末，再通过正负电荷相互吸引制备出壳聚糖-碳纳米颗粒；其次，用绿色荧光蛋白（PEGFP-C1）质粒DNA作报告基因，以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA与壳聚糖-碳纳米颗粒结合形成载基因纳米粒；再次，用扫描电镜观察其形态特征，激光粒度分析仪测定其粒度分布及表面电位（Zeta电位），MTT试验检测壳聚糖-碳纳米载体对HepG2细胞和COS7细胞的毒性作用，凝胶阻滞实验确定该基因载体的DNA携带率，DNase Ⅰ保护实验研究其对所携带基因的保护作用，体外纳米粒导入实验定性评价纳米粒进入在体外进入细胞的活性，并用荧光显微镜观察导入效果。结果 壳聚糖-碳纳米粒表面携带正电荷，聚合指数〈0．3；与DNA结合后效率较高，且可保护DNA免受DNase Ⅰ的降解；经FITC标记后能够成功地进入到COS7细胞和HepG2细胞。结论 壳聚糖-碳纳米颗粒能进入到细胞内部，且导入效率较高，可以用作基因递送的非病毒载体系统，值得进一步研究。     

w-3不饱和脂肪酸功能性纳米载体的设计及逆转肝癌多药耐药作用研究

目的设计二十二碳六烯酸（DHA）为代表的ω-3不饱和脂肪酸功能性纳米载体，探究其协同阿霉素（DOX）给药对肝癌多药耐药（MDR）的影响及其作用机制。方法以DHA和DOX为油相，通过高压乳化法制备DOX纳米粒。将DOX或DOX纳米粒与HepG2细胞或HepG2/ADM细胞共培养后，分为HepG2/ADM组、HepG2+DOX组、HepG2+DOX纳米粒组、HepG2/ADM+DOX组、HepG2/ADM+DOX纳米粒组。采用CCK-8法检测并计算细胞存活率，倒置荧光显微镜观察细胞摄取，分光光度法检测细胞内DOX的药物浓度，Westernblot法检测各实验组MDR相关蛋白（MRP）、肺耐药相关蛋白（LRP）、乳腺癌抗药性蛋白（BCRP）、凋亡相关蛋白（Bcl-2）的表达水平。结果与HepG2/ADM组比较，HepG2+DOX组、HepG2+DOX纳米粒组、HepG2/ADM+DOX组、HepG2/ADM+DOX纳米粒组细胞存活率均明显为低（均P＜0.01）；与HepG2/ADM+DOX组比较，HepG2/ADM+DOX纳米粒组细胞存活率低（P＜0.05）。随着药物作用时间的延长，细胞药物摄取能力增强。HepG2/ADM+DOX纳米粒组细胞药物摄取能力最强，HepG2+DOX纳米粒组次之，HepG2+DOX组最弱。随着药物作用时间的延长，HepG2与HepG2/ADM细胞内DOX浓度均持续增长；HepG2+DOX纳米粒组与HepG2+DOX组、HepG2/ADM+DOX纳米粒组与HepG2/ADM+DOX组相比，细胞内DOX浓度高且增长速率较快，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与HepG2/ADM组相比，HepG2+DOX组、HepG2+DOX纳米粒组和HepG2/ADM+DOX纳米粒组细胞中MRP、LRP、BCRP与Bcl-2蛋白表达水平均明显为低（均P＜0.05）。结论基于ω-3不饱和脂肪酸功能性纳米载体的DOX可以在一定程度上逆转肝癌MDR。     

白细胞介素－32对 HepG22．15细胞 HBV表达的影响

目的：探讨白细胞介素－32（IL－32）对HepG22．15细胞HBV表达的影响。方法不同浓度的IL－32（0～0．8μg／mL）蛋白质加入HepG22．15细胞（插入HBV全基因组,持续表达）培养液共培养,48 h后收集培养上清液。用实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量,用ELISA检测HBsAg、HBeAg表达水平。结果 IL－32抑制HepG22．15细胞HBV的复制,抑制HBsAg、HBeAg表达,且其抑制呈剂量依赖性增强。结论 IL－32可以抑制HepG22．15细胞HBV的表达,IL－32具有抗HBV的作用。     

半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒体对外肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的研究半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒在体外对人肝癌细胞系HepG2的杀伤作用.方法应用电镜下的形态学观察,DNA电泳以及MTT法检测杀瘤活性.结果形态出现明显改变,电镜证实出现细胞凋亡;白蛋白磁性阿霉素纳米粒联合磁场(MADM-NP M)组和半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒(Gal-ADM-NP)组抑制率及半数抑制率剂量相似(P＞0.05),半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒(Gal-MADM-NP M)组抑制率明显提高,半数抑制剂量明显降低(P＜0.01).结论实验结果表明,白蛋白磁性阿霉素纳米粒联合磁场、半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒、半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒都具有明显抑制体外培养肝癌细胞生长增殖的作用.半乳糖化白蛋白磁性阿霉素纳米粒对人肝癌细胞杀伤作用较白蛋白磁性阿霉素纳米粒及半乳糖化白蛋白阿霉素纳米粒组为强,作用机制可能与半乳糖配体的特异性介导和人肝癌细胞上半乳糖受体的识别内吞作用及联合外磁场有关.     

壳聚糖纳米基因载体的制备和鉴定

目的 制备载基因壳聚糖纳米粒,研究纳米粒的结构特征以及对细胞的基因转染效率.方法 用表达绿色荧光蛋白的质粒(pGFP)作报告基因,采用复凝聚法制备壳聚糖-pGFP纳米粒.琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖和pDNA的结合能力,通过比色法检测其包封率,用纳米粒度仪和原子力显微镜对纳米粒的形态和粒径分布进行考察;通过荧光显微镜观察壳聚糖纳米粒介导pGFP在体外培养的人结肠腺癌细胞LoVo中的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合,包封率大于90%.制备的壳聚糖-pGFP纳米粒为结构紧密的不规则球形,平均粒径为209 nm,多分散指数为0.15.体外细胞转染的结果表明,壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染LoVo细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白.结论 壳聚糖可以有效凝聚pDNA,采用复凝聚法可制得100～500 nm范围荷正电的纳米粒,有较高的包封率.壳聚糖纳米粒在体外能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达.因此,壳聚糖作为非病毒基因载体具有介导核酸类生物大分子的应用价值.     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca^2 浓度的动力学变化，建立一种定量测量细胞内Ca^2 浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞，用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca^2 浓度的动力学变化；首先在37℃环境下标定Ca^2 探针indo-1的解离常数Kd值，根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca^2 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示．平滑肌细胞[Ca^2 ]i在地塞米松的刺激下显著上升，有时会出现自发钙波的现象，并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca^2 ]i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化，不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

拉米夫定治疗慢性乙肝时出现HBeAg血清转换与其治疗前ALT水平的相关性

目的：探讨慢性乙型肝炎患者用拉米夫定治疗出现HBeAg血清转换与其治疗前ALT水平的相关性。方法：对120例慢性乙型肝炎患者按其ALT水平分为三组，分别为大于正常值上限5－10倍、2－5倍及正常值上限至其2倍之间，用拉米夫定100mg/d治疗1年，观察三组HBeAg血清转换率。结果：三组患者HBeAg血清转换率分别为：47.5%、27.5%、12.5%，三组之间比较，差异有显著性意义（P＜0.01）。结论：慢性乙型肝炎患者用拉米夫定治疗出现HBeAg血清转换与其治疗前ALT水平明显相关。     

拉米夫定等六种药物的体外抗乙型肝炎病毒作用

目的：观察拉米夫定（3TC）等6种药物对抗乙型肝炎病毒（HBV）体外药效评价及不同指标之间的关系。方法：利用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2．2．15细胞,检测细胞培养上清液中的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒e抗原（HBeAg)及乙肝病毒DNA（HBV－DNA）的含量作为药物抗HBV效果的观察指标。结果：（1）6种药物在一定浓度范围内对2．2．15细胞分泌的HBsAg和HBeAg抑制作用很弱或无抑制;（2）HBV－DNA定量检测拉米夫定和2′3′－二脱氧－3－氟鸟苷（FLG）对HBV DN水平有明显抑制作用,其半数有效剂量（IC50）分别为0．31μmol/L,0．53μmol/L,阿昔洛韦（ACV）和α－干扰素（α-IFN）之IC50分别为0．33mmo/L、96．18U／ml,膦甲酸钠（PFA）和利巴韦林（RBV）最大无毒浓度无任何抑制作用。结论：抑制HBsAg与HBeAg的病毒蛋白表达活性与抑制HBV DNA活性无一致相关性,以HBV DNA指标更能反映化合物的抑制作用。     

免疫印记和免疫荧光技术检测细胞中过表达的ABCA1蛋白表达及定位

目的：研究含有ABCA1基因的真核表达载体pcDNA3.1/ABCA1转染HeLa细胞后,在细胞中的表达及定位情况。方法：由脂质体介导将pcDNA3.1/ABCA1转入Hela细胞中,用免疫荧光法结合LSCM对细胞中ABCA1蛋白表达及定位进行检测,用蛋白质免疫印记法（Western）方法验证ABCA1蛋白的表达。结果：在LSCM下,可以清晰地观察到ABCA1蛋白在HeLa细胞中呈高表达状态,并且ABCA1蛋白已选择性的定位于细胞膜上。Western结果与之相符。结论：结合应用LSCM和免疫荧光技术能准确检测到ABCA1蛋白在HeLa细胞中的表达及定位。     

稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的中国仓鼠卵巢细胞株的构建

目的:将质粒PAcGFP1-Golgi转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)并进行筛选纯化,得到单一克隆细胞株,从而构建能很好显示高尔基体形态、分布和功能的新模型。方法:将质粒PAcGFP1-Golgi以脂质体法转染CHO细胞,稳定后用G418筛选、平板稀释法克隆细胞;克隆完成后以激光共聚焦显微镜观察高尔基体形态及分布,动态监测荧光表达率,MTT法检测细胞增殖活性。结果:成功获得稳定表达质粒PAcGFP1-Golgi的CHO细胞株,激光共聚焦显微镜下高尔基体显示清晰,荧光表达率高达(99.31±0.26)%且表达稳定,细胞增殖活性与空白CHO细胞无异。结论:稳定表达PAcGFP1-Golgi质粒的CHO细胞株构建成功,为进一步研究高尔基体、COG复合体及其与遗传性糖基化障碍疾病之间的关系打下基础。     

三维重建技术观察1-磷酸鞘氨醇刺激其受体2在内皮细胞的表达

目的应用激光扫描共聚焦显微镜三维重建技术观察1-磷酸鞘氨醇(S1P)刺激下S1P受体2(S1PR2)的表达变化,并探讨共聚焦三维重建技术与普通单层扫描技术在生物组织功能和形态学研究中的应用价值。方法 S1P(10μmol/L)刺激脐静脉内皮细胞(HUVECs)6 h,Western blot检测S1PR2的表达变化;对细胞进行免疫荧光染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜分别进行多层层切扫描和单层扫描,层切扫描之后对图像进行三维重建,比较两种技术的优劣。结果 Western blot结果显示S1P刺激6 h后S1PR2表达显著性增高(P0.05)。荧光图像显示,单层扫描时S1P 6 h组荧光强度与对照组比较差异无统计学意义;而层切之后三维重建图像中,S1P刺激后S1PR2荧光强度显著高于正常对照组和单层扫描所得图像,差异均有统计学意义(P0.05)。结论激光扫描共聚焦显微镜三维重建技术,可以获得三维重构图像,并且具有三维立体及图像信息量更全的特点,更能客观的表现出整个细胞特定分子荧光强度的变化。     

激光扫描共聚焦显微镜观察转基因马铃薯中hIL-12的表达

目的观察外源hIL-12基因在转基因马铃薯的不同组织部位的表达情况。方法采集转基因马铃薯的茎和块茎组织进行研究，以野生马铃薯为阴性对照，用间接荧光免疫标记法、激光共聚焦显微镜观察hIL-12在转基因马铃薯不同组织的表达情况。结果经激光共聚焦显微镜检测，转基因马铃薯茎与块茎中均有hIL-12的表达，而野生马铃薯中无hIL-12的表达。结论本课题组建立的人白介素-12转基因马铃薯表达体系中茎和块茎均能表达hIL-12。     

雌激素受体alpha和肿瘤转移相关因子1在胃癌细胞中的表达和共定位

目的：观察雌激素受体alpha（ERα）和肿瘤转移相关因子1（MTA1）在胃癌细胞中的表达和共定位,探讨胃癌的发病机制。方法：提取BGC823、SGC7901胃癌细胞蛋白,利用Western blotting 法检测内源性ERα和MTA1的表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察2种胃癌细胞中ERα和MTA1的定位情况。结果：Western blotting 法检测,BGC823、SGC7901胃癌细胞均表达ERα和MTA1;共聚焦激光扫描显微镜观察,ERα和MTA1能够共定位于BGC823和SGC7901细胞的细胞核中。结论：胃癌细胞中表达ERα,并且能够与MTA1共定位在细胞核中。     

莱菔硫烷对人肝癌HepG-2细胞Bcl-2与Bax基因转录及蛋白表达的影响

目的：研究莱菔硫烷（Sulforaphane,SFN）在体外对HepG-2细胞Bcl-2、Bax基因转录和蛋白表达的影响,探讨SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制。方法：不同浓度SFN处理体外培养的HepG-2细胞株48 h,采用SRB法测定SFN对HepG-2细胞增殖的影响;激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态;流式细胞仪检测SFN作用后的细胞凋亡率;Western blot法和RT-PCR法检测SFN在蛋白和mRNA水平上对Bcl-2和Bax表达的影响。结果：SFN对HepG-2细胞的GI50为9.40μmol/L,TGI为26.68μmol/L;10、20、40μmol/L的SFN作用于HepG-2细胞48 h后,激光共聚焦显微镜下呈现典型的凋亡细胞形态,细胞凋亡率分别为（27.42±0.43）%、（46.53±0.35）%和（58.92±0.48）%（P〈0.01）;细胞内Bcl-2蛋白和mRNA表达水平均显著降低（P〈0.01）,而20、40μmol/L的SFN作用后细胞内Bax蛋白和mRNA的表达水平均显著升高（P〈0.01）,Bcl-2/Bax和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA均随SFN剂量的增加显著降低（P〈0.01）,且变化趋势均呈一定的剂量依赖关系。结论：SFN能抑制HepG-2细胞的增殖,诱导HepG-2细胞凋亡,可在翻译和转录水平下调Bcl-2、上调Bax的表达,这可能是SFN诱导HepG-2细胞凋亡的主要机制之一。     

激光共聚焦显微镜观察磷酸肌酸促缺氧心肌细胞钙离子通道恢复的作用

目的用激光共聚焦显微术探讨缺氧过程中心肌细胞损伤的离子机制。方法取大鼠心脏分离心肌细胞,实验组和对照组各２０份,分别在含磷酸肌酸和无磷酸肌酸的培养基中孵育２４～７２ｈ,ｆｌｕｏ３ＡＭ染色,４８８ｎｍ激光激发,选择固定视野以３３ｍｓ间隔记录３ｍｉｎ,分析荧光强度变化规律。结果标本荧光呈周期性变化,对照组周期长,且不稳定,实验组明显缩短,周期稳定。结论磷酸肌酸具有对缺氧心肌的保护作用。     

Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

目的：采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法：FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果：共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论：FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。     

PTPIP51、p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达

目的探讨PTPIP51和p-Raf-1及ERK1/2在口腔鳞状细胞癌中的表达及对口腔鳞癌侵袭、转移的影响。方法收集32例口腔鳞状细胞癌及其配对癌旁正常口腔黏膜组织。用免疫荧光组织化学染色激光共聚焦显微镜检测PTPIP51与p-Raf-1蛋白在组织切片内表达及定位;PBS冲洗后对标本进行苏木精-伊红染色,普通光镜对比观察组织结构及细胞形态,同时用免疫组织化学方法(SP法)检测PTPIP51蛋白在组织和细胞内的定位;Rea-ltime PCR检测PT-PIP51与ERK1/2基因mRNA在肿瘤组织及癌旁正常口腔黏膜组织的表达情况。结果 PTPIP51与p-Raf-1蛋白在癌巢周围增殖旺盛的肿瘤细胞、间质免疫细胞及部分脉管壁内皮细胞表达阳性且2种蛋白在细胞中共定位表达。同时发现PTPIP51与ERK1/2基因mRNA在口腔鳞癌组织表达高于配对癌旁正常口腔黏膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05);ERK1/2及PTPIP51基因mRNA表达呈正相关(r=0.641,P<0.05);两者的表达水平与患者的性别、年龄,病理分级无关,与肿瘤的TNM分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 PTPIP51与Raf-1可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程,且2种蛋白与肿瘤的侵袭、转移有密切关系。