去泛素化酶与肿瘤相关性的研究进展

泛素-蛋白酶体途径是大多数细胞内蛋白质降解的主要方式,去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes,DUBs）可以逆转这一过程,对其进行反向调节.此外,去泛素化酶可以稳定抑癌基因,从而抑制了肿瘤的发生.对去泛素化酶及其抑制剂的深入研究,为抗肿瘤药物的靶向治疗提供理论依据.本文将重点对去泛素化酶及其在肿瘤中的作用进行综述.     

基于RLR信号通路的去泛素化酶对EV71感染的调控机制研究

目的 探讨基于维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLR)信号通路的去泛素化酶对肠道病毒71型(EV71)感染的调控机制.方法 将人横纹肌肉瘤细胞A-204分为空白对照组、空载质粒组、去泛素化酶组,空白对照组不作任何处理,空载质粒组转染10 nmol/L空载质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5),去泛素化酶组转染10 nmol/L去泛素化酶USP4过表达质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5).采用RT-PCR检测各组细胞中EV71 mRNA表达,Western blot检测各组细胞USP4、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、LGP2蛋白表达.结果 空载质粒组细胞USP4蛋白表达明显低于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞USP4蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P＜0.05).空载质粒组和去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显高于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组(P＜0.05).空载质粒组细胞RIGⅠ、MDA5、LGP 2蛋白表达明显低于空白对照组(P＜0.05),去泛素化酶组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P＜0.05).结论 去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用.     

肿瘤抑制因子CYLD与泛素化及相关疾病研究进展

泛素化是泛素分子在一系列酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,维持细胞对受组成型调节和环境刺激产生的蛋白质水平.去泛素化则相反,将泛素分子在蛋白质上移除,对其进行负向调节.细胞内蛋白质泛素化和去泛素化调节的动态平衡参与多种细胞病理生理过程.肿瘤抑制因子Cylindromatosis （CYLD）是一种在体内广泛分布的去泛素酶,通过去泛素化信号分子,从而调控细胞内蛋白质泛素化和去泛素化的动态平衡.本文就近年来CYLD与泛素化及相关疾病的研究进展作一综述.     

指环蛋白31对表皮生长因子受体表达的调控作用及其机制

目的 探讨指环蛋白31（RNF31）对表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响,并分析RNF31对EGFR的调控机制。 方法 采用免疫共沉淀（Co-IP）法验证RNF31蛋白与EGFR蛋白的相互作用。HEK293T细胞分为空载体组（转染pcDNA3.1空载体）和RNF31组（转染RNF31-Flag质粒）,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测细胞中EGFR mRNA和蛋白表达水平。RNF31的泛素连接酶功能位点（RNF31^C699/702S）和去泛素化酶结合位点（RNF31^{N84A Y93A}）突变后,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR蛋白表达水平。HEK293细胞分为空载体组、RNF31组（转染RNF31-Flag质粒）、RNF31+EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）组和RNF31+EGFR抑制剂厄洛替尼（Erlotinib）组,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR及其下游信号通路蛋白表达水平。 结果 Co-IP 法检测,RNF31蛋白与EGFR蛋白存在相互作用。与空载体组比较,RNF31组细胞中EGFR mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。与空载体组比较,转染RNF31^C699/702S组和野生型RNF31组细胞中EGFR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与RNF31组比较,转染RNF31^{N84A Y93A}组细胞中EGFR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与空载体组比较,RNF31组细胞中EGFR及其下游信号通路中核因子κB（NF-κB）、磷酸化信号传导与转录激活因子3（p-STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸化MAPK（p-MAPK）蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,RNF31+Gefitinib组和RNF31+Erlotinib组细胞中蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、STAT3和MAPK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。 结论 RNF31通过去泛素化酶结合结构域发挥去泛素化的作用,降低EGFR蛋白分子表面的泛素化水平,使EGFR蛋白降解速率减慢,同时高表达的EGFR可以激活其下游与细胞增殖和分裂相关蛋白的表达。     

蛋白酶体功能障碍对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤

目的探讨蛋白酶体抑制剂lactacystin对多巴胺能PC12细胞的特异性损伤.方法不同浓度的lactacystin(1、5、10、15和20μmoL/L)分别处理多巴胺能PC12细胞和胶质瘤U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;50 μmol/L的lactacystin处理U251细胞24 h,MTT法检测细胞活力;10、20 μmol/L lactacystin处理PC12细胞,Western Blot检测细胞内多泛素化蛋白含量;单胺氧化酶B抑制剂selegiline(500μmol/L)和特异性酪氨酸羟化酶抑制剂α-MT(1 mmol/L)提前4 h预处理PC12细胞,再与10 μmol/Llactacystin共同作用24 h,MTT法检测细胞活力,Western Blot检测多泛素化蛋白含量.结果Lactacystin呈剂量依赖性损伤多巴胺能PC12细胞,其对胶质瘤U251细胞无毒性作用,而且其毒性与细胞内多泛素化蛋白生成增加相关.用以增加细胞内多巴胺含量的selegiline和用以减少细胞内多巴胺含量的α-MT都导致lactacystin毒性增强.结论蛋白酶体功能障碍特异性损伤多巴胺能细胞,而其特征性的神经递质多巴胺在其易感性中的作用复杂.     

靶向敲减Ras癌蛋白融合型泛素连接酶E3的构建

目的应用蛋白质敲减技术原理,构建理论上能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合型泛素连接酶E3的真核表达载体。方法选取Raf-1、PI3K、RalGDS中能够与Ras蛋白相互作用的结合结构域和具有泛素连接酶活性的F-Box及U-Box作为功能结构域,采用分子克隆技术依次将其连入pcDNA3.1中构建融合蛋白表达载体,双酶切、PCR和测序技术检测连入核苷酸片段的正确性,Western blot检测融合蛋白表达载体在真核细胞内表达的正确性和作用有效性。结果成功获得6个融合蛋白E3表达载体,5个能够在真核细胞内有效表达,其中(RBD+CRD)Raf-1-U-Box-pcDNA3.1能够敲减人胰腺癌细胞系PANC-1细胞中Ras蛋白。结论成功构建能够靶向敲减Ras癌蛋白的融合蛋白表达载体,为下一步应用蛋白质敲减技术奠定了实验基础。     

USP14调控OSBPL2蛋白去泛素化作用的实验研究

目的：研究泛素特异性蛋白酶14（ubiquitin?specific peptidase 14,USP14）通过调控氧化固醇结合样蛋白2（oxysterol binding protein?like 2,OSBPL2）的泛素化水平稳定OSBPL2表达的分子机制。方法：以HeLa细胞为工具细胞,通过对USP14过表达、敲降以及活性抑制,检测OSBPL2的表达水平;采用体外过表达实验考察USP14对OSBPL2的泛素信号和泛素化水平的调控;采用免疫共沉淀（co?immunoprecipitation,Co?IP）阐明USP14与OSBPL2相互作用的具体结构域、不同结构域在蛋白相互作用中的作用以及OSBPL2的关键泛素化位点。结果：USP14与OSBPL2存在相互作用关系并稳定OSBPL2的表达而不改变其转录水平;体外过表达和Co?IP实验结果表明,USP14催化（catalytic,CAT）结构域与OSBPL2氧固醇结合蛋白相关结构域（OSBP?related domain,ORD）的相互作用降低OSBPL2的泛素化水平;类泛素（ubiquitin?like,UBL）结构域在USP14与OSBPL2相互作用中起到了促进作用;Lys209和Lys361是OSBPL2泛素化和去泛素化的关键位点。结论：USP14通过调控OSBPL2蛋白Lys209和Lys361两个位点的泛素化进而调控其泛素化水平,稳定OSBPL2蛋白的表达。     

去泛素化酶USP10RNAi慢病毒载体的构建及其对PC12细胞增殖的影响

目的:构建大鼠去泛素化酶USP10 siRNA重组慢病毒载体,为探讨USP10对神经元的调控作用提供体外模型。方法:设计并合成3对特异性大鼠USP10基因的RNAi靶序列,聚合酶链反应(PCR)扩增后,用AgeⅠ及EcoRⅠ双酶切及连接酶构建线性化的GV208慢病毒载体;转化感受态细胞,经Amp抗性筛选阳性克隆,PCR鉴定阳性克隆载体并测序;病毒包装并转染至293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,荧光法检测滴度。用重组慢病毒感染PC12细胞,Western Blot检测USP10蛋白的表达,CCK-8法检测PC12细胞增殖。结果:经测序鉴定成功构建了3对USP10 RNAi慢病毒载体,感染PC12细胞后,USP10蛋白的表达显著被抑制,PC12细胞的增殖能力明显减弱。结论:成功构建能高效、稳定抑制USP10表达的PC12细胞株,并明显抑制PC12细胞增殖能力,为探讨USP10对神经元的调控作用提供基础。     

单纯疱疹病毒2型泛素化新型DNA疫苗构建

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)早期表达蛋白感染细胞蛋白(ICP)27强制泛素化的DNA疫苗表达质粒。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从人基因组DNA和HSV-2基因组中分别扩增出泛素全长基因和HSV-2、ICP27 377-459,PCR鉴定后酶切连接获得融合基因片段,插入真核表达质粒pcDNA3．1载体中,构建出重组真核表达质粒Ub-ICP-pcDNA3．1,并对其进行测序鉴定。结果构建的重组质粒Ub-ICP-pcDNA3．1克隆基因插入方向正确,与预期序列完全一致。结论成功构建了HSV-2早期表达蛋白ICP27强制泛素化DNA疫苗。     

蛋白质泛素化、去泛素化与肿瘤发生的关系

泛素-蛋白水解酶体途径（Ubiquitin proteasome pathway，UPP）是细胞质和核内蛋白ATP依赖性的非溶酶体降解途径，高效并高度选择性地进行细胞内蛋白转换，还参与某些重要蛋白质的编译后修饰和改造。因此，对维持细胞正常生理功能具有十分重要的意义。但随着对UPP研究的深入，发现蛋白泛素化调节是一个可逆的过程。细胞内同时还存在一些特异的去泛素化蛋白酶进行负向调节。