和厚朴酚通过上调TRAF3表达对类风湿关节炎滑膜细胞活化的影响

目的 研究和厚朴酚(HNK)对类风湿关节炎滑膜细胞(FLS)活化的抑制作用及其分子机制.方法 将肿瘤坏死因子(TNF)-α处理MH7A细胞建立FLS活化模型,细胞外调节激酶(ERK)抑制剂MK-8353(MK)抑制ERK激活,siRNA干扰抑制肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)表达.采用CCK-8检测细胞增殖,ELISA检测白细胞介素(IL)-6和CXC趋化因子配体10(CXCL10)分泌情况,Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、TRAF3和p-ERK蛋白表达,Real-time PCR检测TRAF3 mRNA表达.结果 TNF+HNK组细胞增殖较CON组和TNF组明显降低,且IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF组明显降低(P<0.05).与CON组和TNF组相比,TNF+HNK组TRAF3 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05).si-TRAF3组TRAF3蛋白表达较si-CON组明显降低(P<0.05),TNF+HNK+si-TRAF3组IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表达较TNF+HNK组明显升高(P<0.05).与CON组和TNF组比较,TNF+HNK组p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05),TNF+HNK+MK组p-ERK1/2、TRAF3蛋白表达明显低于TNF+HNK组(P<0.05).结论 HNK可能通过激活ERK信号通路引起TRAF3表达上调,进而抑制FLS活化.     

戊四氮致痫大鼠中ERK信号通路的研究

目的:研究细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路在癫痫大鼠脑内的表达规律及其意义。方法:建立戊四氮致痫大鼠模型,在痫性发作30 min、1.5 h5、h和8 h应用免疫组织化学和Western印迹法对海马ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白水平的表达进行研究,并加用ERK通路阻断剂PD98059干预。结果:正常大鼠脑内有少量的ERK1和ERK2阳性神经元,未见有p-ERK1/2阳性神经元。戊四氮致痫后30min p-ERK1/2开始表达,ERK1和ERK2表达较对照组开始增强(P<0.05),1.5 h后p-ERK1/2强烈表达(P<0.05),5 h后3者的表达开始减弱。PD98059干预组ERK1/2的活化较癫痫组显著受抑(P<0.05)。Western Blot结果显示,癫痫组大鼠ERK1、ERK2和p-ERK1/2蛋白表达较对照组明显增强(P<0.05),PD98059干预组3种蛋白水平显著低于癫痫组(P<0.05)。1.5 h时点的蛋白表达水平高于其他各时点相应组(P<0.05)。同时PD98059完全抑制了大鼠的痫性发作。结论:ERK信号途径在戊四氮致痫模型中被激活,参与癫痫发作的病理生理过程,并可能具有上游始动发生的作用。     

CXCL16/CXCR6在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及其在滑膜细胞增殖中的作用

目的：探讨趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）中的表达及其对FLS增殖的作用。方法:纳入RA 8例、骨关节炎（osteoarthritis,OA）7例、健康对照3例,采用组织块贴壁方法体外分离培养人膝关节FLS,第3~5代细胞用于后续研究。Western blot方法检测CXCL16及其受体CXCR6在3组FLS的表达水平;不同浓度的重组人CXCL16(0、10、50、100、200 μg/L)刺激3组FLS后,细胞活性检测试剂盒-8（cell counting kit,CCK-8）检测FLS增殖水平;Western blot方法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS中pAKT/AKT水平;ELISA法检测重组人CXCL16刺激后RA-FLS培养上清中TNF-ɑ、IL-6、MMP-3、RANKL水平。结果: RA-FLS中CXCL16、CXCR6蛋白表达水平均明显高于OA组和对照组（P<0.05）,OA组和对照组间差异无统计学意义;重组人CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后RA-FLS增殖能力明显高于非刺激组（P均<0.05）,OA组和对照组FLS经CXCL16刺激后细胞增殖水平无明显变化（P>0.05）;200 μg/L CXCL16刺激后,RA-FLS表达pAKT/AKT明显增高;CXCL16（50、100、200 μg/L）刺激后,RA-FLS培养上清中IL-6和RANKL表达明显增加（P < 0.05）,而MMP-3、TNF-ɑ水平无明显变化。结论:CXCL16及其受体在RA-FLS中表达增高,重组人CXCL16可促进RA-FLS增殖活化、分泌炎性因子增加,提示CXCL16参与了RA的滑膜炎症。     

重组人生长激素对THP1单核细胞中活化蛋白1转录因子的影响

目的研究重组人生长激素(rhGH)对THP1单核细胞中活化蛋白1(AP-1)转录因子的影响。方法应用荧光素酶报告基因和凝胶电泳迁移率实验检测AP-1在rhGH诱导的单核细胞中的活化程度,用蛋白免疫印迹实验检测细胞外信号调控激酶(ERK)和磷酸化的ERK(p-ERK)的表达。结果与空白对照组比较,LPS组和rhGH组AP-1的转录活性升高(P<0.01);rhGH+脂多糖(LPS)组AP-1的转录活性较LPS组有明显下降(P<0.01)。同时,rhGH和LPS的预处理对ERK无显著影响,但均能促进p-ERK蛋白的表达,rhGH的预处理则能减弱LPS刺激p-ERK蛋白表达。结论 rhGH可通过双向调节ERK的磷酸化而影响THP-1单核细胞中AP-1的转录活性。     

ERK1/2信号通路介导PDGF-CC诱导的鼠心肌纤维化及其机制

目的 研究ERK1/2通路在血小板源性生长因子(PDGF)-CC诱导的鼠心肌纤维化中的作用及其可能的机制.方法 取SD大鼠乳鼠心脏组织,差速贴壁法分离并纯化心肌成纤维细胞.按不同药物处理随机分成对照组(CON组)、PDGF-CC(P组)、PDGF-CC+ERK1/2抑制剂U0126(PU组).MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖,qRT-PCR法检测mRNA含量,Western blot法分析蛋白表达量.结果 MTT法显示P组细胞数较CON组显著增加(P＜0.01),而PU组细胞数较P组明显减少(P＜0.01).qRT-PCR法显示P组中PDGF-α受体(PDGFR-α)、ERK1、ERK2、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅰ、ColⅢ)的mRNA表达水平均明显高于CON组(P ＜0.001),PDGFR-β的mRNA表达量在P组与CON组间差异无统计学意义.与P组相比,PU组中PDG-FR-α、ERK1、ERK2、Col Ⅰ和ColⅢmRNA表达均明显下降(P＜0.01).Western blot法显示P组中磷酸化PDGFR-α(p-PDGFR-α)、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ的表达量均明显高于CON组(P ＜0.001),PU组中p-PDGFR-α、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白表达量均显著低于P组(P＜0.001).结论 PDGF-CC可能通过结合PDGFR-α激活ERK 1/2信号通路,诱导鼠心肌成纤维细胞过量增殖伴胶原蛋白的合成,参与心肌纤维化的发生.     

ERK1/2在姜黄素对肺癌A549细胞增殖抑制中的作用

目的: 探讨姜黄素在抑制肺癌A549细胞增殖过程中,对ERK1/2丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响。方法: 不同浓度的姜黄素作用于A549细胞24 h后,采用MTT法检测姜黄素对A549肺癌细胞增殖的抑制作用;应用Westernblot分别检测ERK/2、p-ERK/2蛋白及其下游相关基因基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)的表达。结果: 姜黄素对A549细胞增殖有明显的抑制作用,且具有剂量依赖性(P<0.01)。姜黄素抑制A549细胞p-ERK蛋白的表达(P<0.05),但不影响总ERK1/2蛋白的表达;姜黄素可促进TIMP-1蛋白表达(P<0.05),但抑制MMP-9的表达(P<0.01)。结论: 姜黄素影响ERK1/2MAPK信号转导通路,调节凋亡相关蛋白表达是其抑制A549细胞细胞增殖的作用之一。     

促性腺激素释放激素激动剂通过ERK MAPK途径调控大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA表达

目的:促性腺激素释放激素(GnRH)是下丘脑分泌的10肽激素,通过刺激促性腺激素释放激素的合成和分泌,调节性激素的合成.GnRH对睾丸间质细胞也具有直接的刺激作用.文中研究GnRH激动剂(GnRHa)对大鼠睾丸间质细胞ERK MAPK信号通路和3β-HSD mRNA表达的影响. 方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48 h后,血清饥饿2 h.GnRHa(10-7 mol/L)和ERK抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激细胞后Western blot检测磷酸化ERK(p-ERK)、总ERK(t-ERK)的蛋白表达,荧光实时定量PCR检测3β-HSD mRNA表达. 结果:结果显示GnRHa刺激间质细胞0、5、10、30、60和90min后,p-ERK水平在5min时达到最高,与对照组比较升高了约3.5倍(P<0.05);10min时开始下降,但与对照组相比较仍显著升高2.2倍(P<0.05);90min时恢复到正常水平.加入ERK选择性抑制剂PD98059后,p-ERK水平显著下降50%(P<0.05);再用GnRHa刺激细胞5min,p-ERK水平仍无法恢复正常水平.用PD98059处理细胞后,再加入GnRHa培养24h,3β-HSD mRNA水平也显著下降(与GnRHa组相比,P<0.05). 结论:GnRH激动剂可能通过ERK MAPK信号通路来调控大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA的表达,进而调控睾酮的分泌.     

阿魏酸钠对慢性脑低灌注大鼠认知功能及对磷酸化ERK、CREB和BDNF表达的影响

目的:观察阿魏酸钠对慢性脑低灌注大鼠空间学习记忆能力及对海马细胞外信号调节激酶(ERK 1/2)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化(p-ERK及p-CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为3组,假手术组(SHAM+NS)、慢性脑低灌注组(2VO+NS)、阿魏酸钠治疗组(2VO+SF)。采用新奇物体识别试验、Morris水迷宫检测3组大鼠的认知;用Western Blot检测3组大鼠海马中的p-ERK、p-CREB、BDNF的表达。结果:通过行为学检测,模型组大鼠识别新物体能力下降,阿魏酸钠可以缓解这种下降趋势(P<0.05)。模型组大鼠Morris水迷宫中逃避潜伏期延长,空间探索时间明显减少;阿魏酸钠治疗组可以缩短大鼠的逃避潜伏期(P<0.05),空间探索时间明显增加(P<0.05)。模型组p-ERK、p-CREB、BDNF的表达较假手术组明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),治疗组p-ERK、BDNF的表达较模型组显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论:阿魏酸钠能改善慢性脑低灌注大鼠空间学习记忆能力,其作用机制可能与介导了海马中p-ERK、p-CREB、BDNF的表达水平升高有关。     

幽门螺旋杆菌毒力因子CagA介导的ERK信号通路活化对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨幽门螺旋杆菌毒力因子细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）对细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路的作用,阐明CagA的致癌机制。方法：构建pcDNA3.1/CagA真核表达载体,将胃癌AGS细胞分为空白对照组（空载体转染）、CagA转染组（GZ7/CagA转染）和CagA+ERKi组（ERK1/2抑制剂预处理+GZ7/CagA转染）,采用Western blotting法测定各组细胞中CagA、磷酸化ERK（p-ERK）、总ERK（T-ERK）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和激活型caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白表达水平,采用CCK-8法检测各组胃癌AGS细胞活性,采用流式细胞术检测胃癌AGS细胞凋亡率。结果：与空白对照组比较,CagA转染组胃癌细胞中CagA、p-ERK和Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组胃癌细胞中p-ERK和Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组各时间点胃癌细胞活性明显降低（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组胃癌细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。结论：幽门螺旋杆菌毒力因子CagA可抑制胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞增殖,其机制可能与CagA活化ERK信号通路有关。     

内脏脂肪素对巨噬细胞MMP-9的作用及其机制探讨

目的 研究内脏脂肪素(visfatin)对巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用及其机制.方法 体外诱导THP-1单核细胞转化为巨噬细胞.为明确visfatin对MMP-9的作用,细胞分为两组:①巨噬细胞+visfatin 12 h组;②巨噬细胞+visfatin 24 h组,两组的visfatin的质量浓度均为:0(对照组)、50、100、200、400 ng/mL.采用RT-PCR和Western blotting测定MMP-9基因和蛋白表达,明胶酶谱法检测MMP-9的活性.为明确visfatin对MMP-9的作用机制,细胞分为五组:①巨噬细胞未加刺激组(对照组);②巨噬细胞+ MAPK p38、ERK1/2、JNK信号通路抑制剂预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组;③巨噬细胞+过氧化物酶体增殖剂活化受体(PPARγ)天然及人工配体/ RXR配体预处理1 h后加visfatin(200 ng/mL)24 h组;④巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)24 h组(Vis200组);⑤巨噬细胞+visfatin(200 ng/mL)刺激不同时间组(5、10、15、30、60 min).Western blotting检测MMP-9蛋白和PPARγ蛋白表达及visfatin刺激下巨噬细胞p38、ERK1/2、JNK MAPK磷酸化水平.结果 Visfatin能促进MMP-9基因及蛋白表达(P<0.05,P<0.01),同时增强了MMP-9的活性(P<0.01).p38 MAPK、ERK1/2 MAPK通路抑制剂及RXR配体抑制visfatin对MMP-9表达具有上调作用;visfatin能促进p38 MAPK和ERK1/2 MAPK的磷酸化,但不影响PPARγ蛋白的表达.结论 Visfatin增加了巨噬细胞炎症因子的表达,该作用与p38 MAPK和ERK1/2 MAPK信号通路有关;RXR可能参与了该过程.