IL⁃17A对小鼠实验性牙周炎骨破坏作用研究

目的：通过构建白介素?17A（interleukin?17A,IL?17A）基因敲除小鼠实验性牙周炎模型,初探IL?17A参与调控牙周炎骨破坏的机制。方法：选用雄性IL?17A基因敲除（knock out,KO）的C57BL/6小鼠和相同基因背景的野生型（wild type,WT）C57BL/6小鼠,通过结扎和喂菌诱导小鼠实验性牙周炎,WT小鼠及KO小鼠均分为正常对照组和牙周炎组。确认结扎4周后处死小鼠收集上颌骨,进行Micro?CT断层成像、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phosphatase,TRAP）染色、免疫组化和组织病理学分析。结果：在喂菌和结扎诱导的小鼠实验性牙周炎模型中,在Micro?CT的三维重建及近远中向截面上,KO小鼠较WT小鼠牙槽骨吸收减少,KO小鼠上颌第二磨牙牙槽嵴顶到釉牙骨质界的近中线性距离为（0.51 ± 0.11）mm,远中为（0.45 ± 0.04）mm,显著低于WT小鼠的近中（0.61 ± 0.09）mm和远中（0.65 ± 0.08）mm（P < 0.05）;KO小鼠骨体积分数比为41.88 ± 1.82,显著高于WT小鼠的36.55 ± 2.08（P < 0.05）;KO小鼠骨密度为84.39 ± 2.11,显著高于WT小鼠的76.90 ± 2.55（P < 0.05）;HE染色中可见牙槽骨吸收减少;TRAP染色中可见TRAP染色阳性细胞减少;免疫组化结果显示牙周组织核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL）的表达降低。结论：牙周炎中IL?17A可能有促进牙周炎发生发展及促进牙槽骨吸收的作用。     

实验性牙周炎对小鼠骨髓活性氧生成影响的实验研究

目的：研究实验性牙周炎对小鼠骨髓活性氧（reactive oxygen species ROS）生成的影响,初步探讨ROS在牙周炎中的作用。方法：选用8周龄C57BL/6雌性小鼠20只,采用丝线结扎法建立实验性牙周炎动物模型,在术后4周取材,对小鼠上颌骨进行micro?CT扫描、HE染色及TRAP染色;取小鼠四肢骨髓,通过流式细胞仪检测骨髓中ROS含量水平。结果：实验组术后4周,上颌第二磨牙从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离增大,近远中及根分叉处牙槽骨吸收明显,成骨细胞减少;单位长度破骨细胞数显著增多（P < 0.001）;小鼠骨髓中ROS平均荧光强度显著高于对照组（P < 0.001）。结论：ROS含量在实验性牙周炎小鼠骨髓中增加,可能影响成骨和破骨细胞的分化,参与牙周炎骨吸收。     

雌激素缺乏对牙周炎大鼠牙槽骨骨保护素表达的影响

目的 研究雌激素缺乏对牙周炎大鼠牙槽骨中骨保护素(OPG)表达的影响,探讨雌激素调节牙槽骨改建的机制.方法 采用切除双侧卵巢及牙周结扎的方法建立雌激素缺乏的大鼠牙周炎动物模型,观察大鼠牙周组织病理改变,应用免疫组织化学技术观察OPG在牙槽骨的表达,比较卵巢切除(OVX,n=18)、假手术(Sham,n=17)及雌二醇治疗(OVX+E2,n=18)3组大鼠牙槽骨OPG表达吸光度(A)值的差异.结果 各组大鼠组织学观察均显示牙槽骨骨小梁稀疏,牙槽骨表面可见破骨细胞及骨吸收陷窝,OVX组更为显著.Sham组、OVX组及OVX+E2组的牙槽骨OPG阳性表达A值分别为38 799±6228、27 854±5246和37 146±6394,OVX组吸光度低于Sham组和OVX+E2组(均P＜0.05),而Sham组和OVX+E2组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 雌激素缺乏降低牙槽骨中骨保护素的表达,促进实验性牙周炎大鼠牙槽骨的吸收.     

重组人骨保护素对牙周炎大鼠牙槽骨RANKL 、OPG蛋白表达的影响

目的：探讨重组人骨保护素（rhOPG）对牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表达的影响,为rhOPG应用于牙周炎的治疗提供实验依据。方法选择22只Wistar大鼠,采用随机数字表法选择2只健康大鼠作为健康组;其余20只作为实验组,建立牙周炎大鼠模型,再将其分为实验对照组（n＝10）和rhOPG组（n＝10）,rhOPG组大鼠于上颌第2磨牙牙周袋间隙局部注入10 mg／kg rhOPG治疗。实验对照组大鼠于相同部位注射等体积灭菌注射用水。采用链霉素抗生物素蛋白‐过氧化物酶（SP）检测牙槽骨RANKL、OPG蛋白的表达。结果与健康组比较,实验组大鼠牙槽骨OPG表达水平较低,差异有统计学意义（P＜0．05）,而RANKL表达水平两组差异无统计学意义（P＞0．05）。与实验对照组比较,rhOPG组大鼠牙槽骨组织OPG蛋白的表达水平明显上调,而RANKL蛋白的表达明显下调（P＜0．05）。治疗后rhOPG组大鼠牙槽骨中OPG表达水平明显高于治疗前,而RANKL表达水平明显低于治疗前,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 rhOPG能调节牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG的表达。     

体外应用不同方法培养破骨细胞的实验对比研究

目的:研究体外应用不同培养方法对所生成的破骨细胞数量及功能的影响?方法:体外采用3种方法培养破骨细胞:A组小鼠骨髓细胞中加入10 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)培养24 h,未贴壁细胞30 ng/ml M-CSF预诱导3 d后,50 ng/ml M-CSF + 100 ng/ml核因子κB受体活化因子配体(RANKL)继续诱导;B组小鼠骨髓细胞与小鼠颅骨成骨细胞以10∶1的比例混合培养,加入1 × 10-6 mol/L 前列腺素E2(PGE2)和1 × 10-8 mol/L 维生素D3(VitD3);C组小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中加入100 ng/ml RANKL诱导培养?检测每组细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色情况及牙本质磨片吸收陷窝情况,Real-time PCR检测各组破骨细胞NFATc1?c-Fos表达情况?结果:各组细胞均有TRAP阳性多核破骨细胞生成,并在牙本质磨片上形成吸收陷窝?B组所形成的破骨细胞数量最多,C组次之,A组最少;B组骨吸收陷窝数目最多,陷窝总面积最大,A组其次,C组最差;B组NFATc1?c-Fos表达高于C组及A组,A组表达最差?结论:3种培养破骨细胞的方法相比较,B组在破骨细胞分化和吸收功能方面优于A?C组?A?C组相比较,A组培养的破骨细胞骨吸收功能更强,C组所培养的破骨细胞分化更佳?     

实验性牙槽骨吸收动物模型的建立

目的探讨建立实验性大鼠牙槽骨吸收模型的方法.方法 20只SD大鼠随机分为2组,每组10只.实验组SD大鼠局部注射大肠杆菌(E.coli,E)内毒素即脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(E-LPS),对照组在相同时间注射等量生理盐水.检测实验牙位牙体-牙周联合标本骨密度(Bone Mineraldensity, BMD)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色破骨细胞计数、HE染色组织病理学检查,评价实验性牙槽骨吸收模型的建立是否成功.结果 实验组大鼠实验牙位牙槽骨BMD(0.220±0.026)低于对照组(0.328±0.023)(P＜0.05),破骨细胞数目(7.800±2.683)高于对照组(0.334±0.200)(P＜0.05).实验组大鼠牙槽骨表面出现Howship陷窝,陷窝内可见破骨细胞.对照组大鼠牙槽骨表面光滑完整,未见明显破骨活动.结论 局部注射E-LPS能制备稳定、可靠的实验性大鼠牙槽骨吸收模型.     

p38 MAPK在钛颗粒诱导的破骨细胞形成中的作用

目的：探讨p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）在钛颗粒诱导的破骨细胞形成中的作用。方法：提取小鼠骨髓细胞,接种于24孔板后分为3组：①空白对照组;②核因子κB受体活化因子配体（receptor ac－tivator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）组：每孔加入50 ng/ml RANKL;③钛颗粒+RANKL组：每孔加入0.01%钛颗粒悬液（0.1 mg/ml）及RANKL 50 ng/ml,抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色鉴定和计数破骨细胞。Western blot检测p38、磷酸化p38的表达水平,通过腺病毒介导的p38 siRNA沉默p38的表达后,观察破骨细胞数目及相关蛋白RANK的变化情况。结果：各组破骨细胞计数结果分别为：空白对照组2.0±0.8,RANKL组62.8±5.6,钛颗粒+RANKL组93.0±8.8（F=235.193,P=0.000）。RANKL组高于空白对照组（P=0.000）,钛颗粒+RANKL组明显高于RANKL组（P=0.000）。Western blot结果显示钛颗粒能明显提高p38的磷酸化水平（p-p38/p38相对值： 空白对照组0.29±0.05,RANKL组0.64±0.05,钛颗粒+RANKL组 0.87±0.05,F=106.491,P=0.000,钛颗粒+RANKL组高于空白对照组和RANKL组P1=0.000,P2=0.001）。转染腺病毒介导的p38 siRNA后,Ad-sip38干扰组RANK蛋白的表达水平低于对照组和Ad-RFP组,破骨细胞数目也明显低于对照组和Ad-RFP组（破骨细胞计数：对照组99.8±13.5,Ad-RFP组95.8±7.1,Ad-sip38组3.8±2.5,F=148.654,P=0.000,对照组与Ad-RFP组无明显差异P=0.541,Ad-sip38处理组与对照组和空白病毒组比较均P=0.000）。结论：p38 MAPK在钛颗粒诱导的破骨细胞形成中起重要的作用。     

β-隐黄素对大鼠牙槽骨吸收的影响

目的 评估β-隐黄素对大鼠牙槽骨吸收的影响并探讨其在体内的作用机制.方法 30只雄性SD大鼠随机分为三组:正常组(N组)、牙周炎组(P组)、β-隐黄素干预组(E组).P组、E组双侧上颌磨牙用结扎加注射内毒素的方法诱导牙周炎模型.E组用β-隐黄素(12 μg/大鼠)进行干预,每48 h注射一次,共3次.动物在第8天被处死,取双侧上颌骨.右侧样本进行形态学分析,测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离.左侧样本进行组织学和免疫组织化学分析,检测牙槽嵴顶附近核因子kB受体活化因子配体(RANKL),骨保护素(OPG)的表达.用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测破骨细胞(OC).结果 E组与P组相比牙槽骨丧失(ABL)减少,炎症细胞浸润减少,RANKL免疫标记细胞及 TRAP阳性多核细胞减少(P＜0.05), OPG表达增加(P＜ 0. 05).而E组与N组相比,ABL值和OC数目差异无统计学意义.结论 β-隐黄素可通过上调OPG/RANKL的比值,减少成熟OC的数目从而预防牙槽骨的吸收.     

葛根素对牙周炎大鼠Th17/Treg细胞免疫平衡及相关转录因子表达的影响

  目的  探究葛根素对牙周炎大鼠辅助性 T 细胞 17（ T helper cell 17,Th17） /调节性 T 细胞 （Regulatory T cell, Treg） 免疫平衡及相关转录因子的影响。  方法  采用分离牙龈、丝线结扎配合龈下注射大肠杆菌内毒素（E-LPS）法建立大鼠牙周炎模型。将大鼠随机分为正常对照组（A组）、牙周炎模型组（B组）、200 mg/（kg·d）葛根素组（C组）。HE 染色观察牙周组织病理形态学变化。通过Micro-CT对骨生物学参数定量分析牙槽骨吸收情况。流式细胞术、免疫印迹法（western blot,WB） 分别检测牙周组织中 Th17、Treg 细胞比例、白介素-17（ IL-17） 、视黄酸相关孤儿受体（ RORγt） 、IL-10、叉头状转录因子-3（ Foxp3） 蛋白表达。  结果  HE染色中葛根素组大鼠牙根部可见明显新生骨细胞增生,牙周膜可见少量炎症细胞聚集,牙槽骨结构较整齐。Micro-CT显示治疗组大鼠牙槽骨较模型组骨量略有下降,骨质量及强度有所上升。流式细胞术检测全血细胞发现葛根素组的TH17、Treg细胞比例均下降,且TH17/Treg的细胞比例也下降。 IL-10、Foxp3在葛根素组蛋白表达量上调,而IL-17、RORγt在葛根素组蛋白表达量下调,差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  葛根素可缓解牙周炎大鼠牙周组织炎性反应、牙槽骨吸收,通过调节Th17 /Treg 细胞及相关转录因子的表达,使Th17 /Treg 细胞免疫平衡轴往有利于牙周组织愈合方向发展,其作用机制可能与葛根素有效调节Th17 /Treg细胞免疫平衡轴有关。     

miRNA-200c/SOX2轴在实验性牙周炎牙槽骨吸收中的作用研究

目的：探讨miRNA-200c/转录因子Y框蛋白2(SOX2)轴在实验性牙周炎牙槽骨吸收中的作用。方法：将C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、miRNA-200c组和联合组。模型组、miRNA-200c组和联合组小鼠分别给予慢病毒空载体、miRNA-200c慢病毒过表达载体及miRNA-200c和SOX2慢病毒过表达载体。以牙龈卟啉单胞菌涂抹模型组、miRNA-200c组和联合组小鼠口腔建立慢性牙周炎模型。检测各组牙周组织miRNA-200c和SOX2表达水平、牙龈指数、釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶(ABC)距离。HE染色分析小鼠牙周组织病理形态学变化。qPCR检测小鼠牙周组织中miRNA-200c和SOX2表达水平。Western blotting检测小鼠牙周组织中骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、核因子κB受体因子(RANK)蛋白表达水平。结果：与空白组相比，模型组小鼠牙周组织中miRNA-200c表达水平降低(P<0.05),SOX2表达水平升高(P<0.05);miRNA-200c组牙周组织中miRNA-200c表达水平高于空白组...