桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析.方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序.结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87％以上.结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白(actin)基因进行克隆及序列分析.方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78％以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90％以上.结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

芍药肌动蛋白基因的克隆及表达分析

目的 克隆芍药肌动蛋白(Actin)基因并应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况.方法 根据近缘物种Actin基因的保守序列设计一对PCR扩增引物,以“桃花飞雪”芍药根部总RNA反转录而成的cDNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出芍药Actin cDNA全长并克隆至pMD 18-T载体上,阳性克隆经菌落PCR、质粒PCR及酶切鉴定后进行测序.基于测序结果设计特异性PCR引物,应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药根、茎、花、叶不同组织中的表达情况.结果 测序结果表明芍药Actin基因全长l 134 bp序列,共编码377个氨基酸,GenBank登录号为JX310002;序列分析表明芍药Actin蛋白中存在3种肌动蛋白特征信号序列,与其他植物肌动蛋白氨基酸同源性达99％;基于同源模建预测的3D结构中含有4个结构域;生物信息学软件预测芍药肌动蛋白的相对分子质量为4.17×104,等电点(pI)为5.31,是一个定位于胞液、不含跨膜域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白;半定量RT-PCR技术分析表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花组织中的表达量保持恒定.结论 首次从芍药中克隆了Actin基因,半定量RT-PCR表达分析结果表明Actin基因适合作为芍药功能基因表达分析的内标基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

浙贝母肌动蛋白基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆浙贝母Fritillaria thunbergii Miq.肌动蛋白(Actin)基因,并进行生物信息学分析。方法提取浙贝母根、茎、叶、花、鳞茎总RNA,设计合成简并引物。以叶片总RNA为模板,通过RT-PCR和Ta克隆技术克隆Actin基因保守区序列片段。以该基因为内参基因,对3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因进行组织特异性表达分析。结果经RT-PCR扩增和Ta克隆,得到1段基因序列(463 bp)。浙贝母Actin基因与岷江百合、郁金香、虎眼万年青、铁皮石斛、柿子、光皮桦、玉米相似度较高(84%~98%),其氨基酸序列与阿帝露茅膏菜、甘蓝型油菜、香草兰、岷江百合、麻疯树、枸杞、红海榄的同源性均在89%以上,并且其Actin蛋白与百脉根、岷江百合、郁金香亲缘关系较近。HMGR基因在该植物各部位表达有显著差异,依次为鳞茎花叶茎根。结论首次从浙贝母中克隆出Actin基因(命名为Ft Actin),可为其有效利用奠定基础。     

刺五加Actin 基因cDNA 全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin 基因保守序列设计引物,利用套式PCR 进行3' 和5'RACE 扩增,得到Actin 基因的3' 和5' 端cDNA 序列片段,拼接获得cDNA 全长。将该序列进行BLAST 比对、相似度分析,并对刺五加Actin1 蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin 基因全长1 507 bp,命名为ESActin1,注册号KC469585 。该基因开放阅读框（ORF）长1 134 bp,编码377 个氨基酸,5' 端非编码区长140 bp,3' 端非编码区长233 bp。ESActin1 与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上,蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶(CHS)基因进行克隆及序列分析.方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD 18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9％以上.结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

刺五加Actin基因cDNA全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Aetin基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。方法i以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin基因保守序列设计引物,利用套式PCR进行3’和5＇RACE扩增,得到Aetin基因的3’和5’端cDNA序列片段,拼接获得cDNA全长。将该序列进行BLAST比对、相似度分析,并对刺五加Aetinl蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Aetin基因全长1507bp,命名为ESActinl,注册号KC469585。该基因开放阅读框（ORF）长1134bp,编码377个氨基酸,5’端非编码区长140bp,3’端非编码区长233bp。ESAetin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75％以上,蛋白质序列的相似性在94％以上。结论：首次报道了刺五加Actin基因的全长cDNA序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

人参多向耐药性转运蛋白基因保守区序列的克隆及分析

目的 对人参多向耐药性(PDR)转运蛋白基因进行克隆及序列分析.方法 利用其他植物PDR基因的保守区域设计简并引物,以人参根总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增人参PDR基因片段并连接至pGEM-T Easy载体上,阳性克隆经PCR检测后测序.结果 得到一段长693 bp的基因序列,序列分析表明,该片段编码231个氨基酸,与植物PDR基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在76％和80％以上.分析表明该序列属于PDR转运蛋白的核苷酸结合域,具有PDR转运蛋白的C端Walker A、ABC标签模体和C端walker B 3个保守功能域.结论 首次从人参中克隆出PDR转运蛋白基因,为研究人参次生代谢产物的转运和积累机制奠定了基础.     

太子参3个肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

目的克隆太子参肌动蛋白(Actin)基因片段并进行序列分析。方法利用植物Actin基因的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和抑制PCR扩增太子参Actin基因核心片段。利用半定量RT-PCR分析太子参Actin基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果通过RT-PCR获得3条太子参Actin基因的核心片段,长度均为760 bp,依次命名为PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制PCR及序列拼接后3条核心片段依次延长至1 008、1 008、975 bp,分别编码336、336、325个氨基酸残基。半定量RT-PCR分析表明PhACT2和PhACT3基因在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达量基本恒定,PhACT1基因存在一定的差异。结论首次从太子参中克隆得到3条太子参Actin基因序列,并确定PhACT2基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。     

刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析

目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42％、98.83％、98.54％.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.     

茅苍术DXS基因的克隆与分析

目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析。方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长c DNA序列。运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量。结果:克隆得到的DXS基因全长c DNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号KY659208)。氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量最高,其次为花,而在根茎和根中表达很低。结论:获得了茅苍术DXS基因的全长c DNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。     

三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增法,以三七根总RNA为模板扩增出三七FPS基因。结果序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长1 409 bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基,推测的氨基酸序列与积雪草、灰白银胶菊、黄花蒿的FPS的氨基酸序列同源性最高,分别达95%、87%、86%。结论首次分离并报道了三七FPS cDNA克隆,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。