骨代谢分子信号通路研究进展

骨代谢异常可引起骨质疏松、佩吉特症、骨硬化症、骨折等疾病;其病因复杂,机理不明。骨代谢过程包括骨形成及骨吸收,其具体的分子调节通路不明。现代研究表明,在骨代谢过程中至少存在WNT/β-连环蛋白通路、NFAT通路、胰岛素信号通路、Sema4D-Plexin-B1通路、PI3K-AKT通路及MAPK通路等。通过分子信号通路,可有效促进骨代谢研究,并开发具有治疗骨代谢异常疾病的新药。     

基于网络药理学及分子对接研究三七总皂苷治疗肾纤维化的作用机制

目的:本研究利用网络药理学及分子对接技术预测三七总皂苷入血成分的抗纤维化作用机制,探讨其药效物质基础及作用途径。方法:检测并确定三七总皂苷的主要入血成分为潜在活性成分,采用PharmMapper系统,结合CooLGeN及GeneCards服务器筛选成分的潜在靶点;通过DAVID平台进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析;采用STRING数据库和Cytoscape软件绘制蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络及“入血成分-靶点-通路-疾病”网络;使用Autodock Vina软件对入血成分与潜在关键靶点进行分子对接。结果:确认三七总皂苷入血成分20个,得到入血成分治疗肾纤维化的潜在靶点31个,涉及细胞内信号转导、凋亡、增殖、基质分解等生物过程和PI3K-AKT、Rap1、HIF-1、FoxO等8个显著相关信号通路。网络分析表明,AKT1、SRC、CASP3、NOS2、EGFR等是抗肾纤维化的关键靶点。分子对接结果显示,入血成分人参皂苷Rh2、丙二酰人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3等与主要靶点AKT1、SRC、CASP3、NOS2的结合活性较强。结论:初步揭示三七总皂苷治疗肾纤维化多成分、多靶点、多通路的作用机制,为后续的药理研究及临床开发提供新思路和科学依据。     

基于网络药理学的三七传统功效作用机制研究

目的探索三七活血止血、消肿止痛传统功效的网络调控机制。方法选取三七药材中12个入血成分为研究对象,依据反向分子对接的方法预测化合物靶点,借助String 10数据库与Omicsbean在线分析软件对靶点进行信号通路分析、基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析,利用Cytoscape软件构建网络。结果 12个化合物(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rh_1、人参皂苷Rg_2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷F_2、人参皂苷Rg_3、人参皂苷Rk_1、三七素、槲皮素)可通过65个相关靶点作用于65条信号通路,主要涉及抑制血栓生成、纤溶、血管新生、舒张血管、凝血、抗炎以及镇痛等方面,进一步得到三七"化合物-靶点-通路-药理作用-功效"的网络药理图。结论三七通过作用于F2、F10、PLAT、VEGFA、NOS2、IL6、PTGES、OPRD1等关键蛋白干预了多个与活血止血、消肿止痛相关的生物过程,初步揭示了其传统功效的作用机制。     

平乐三七接骨丸对桡骨骨折兔模型转化生长因子-β/骨形态发生蛋白信号通路表达的影响

目的:观察平乐三七接骨丸对兔桡骨骨折血清及骨折端骨痂转化生长因子(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMPs)表达的影响。方法:取72只普通级新西兰兔建立骨折模型,随机分为三组后分别给予平乐三七接骨丸混悬液、骨肽片混悬液及0.9%氯化钠溶液灌胃。于术后第1、2、4、8周检测血清TGF-β1、BMP-2水平及骨痂组织TGF-β1、BMP-2 mRNA和蛋白表达水平。结果:术后第1、2、4、8周,中药实验组血清及骨组织TGF-β1、BMP-2表达水平均高于空白对照组(均P<0.05)。中药实验组BMP-2表达在术后2周达到峰值,早于空白对照组。结论:平乐三七接骨丸可能通过激活TGF-β/BMPs信号通路,诱导TGF-β1、BMP-2早期表达,并增加其表达量,促进兔桡骨骨折愈合。     

三七总皂苷对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的保护作用

目的:探讨三七总皂苷对脂多糖(LPS)刺激所致BV2小胶质细胞炎症反应的保护作用及其机制。方法:MTT比色法检测不同浓度三七总皂苷对BV2小胶质细胞活性的影响;免疫荧光法检测IL-1β、NF-κB的定位及表达;PCR法检测IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表达;Western blot法检测IL-1β、TNF-α、COX-2蛋白表达。结果:三七总皂苷在6.25～50μg/mL对BV2小胶质细胞生长无明显影响。与LPS模型组比较,各浓度(6.25、12.5、25、50μg/mL)三七总皂苷均能不同程度抑制IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA和IL-1β、TNF-α、COX-2蛋白表达;50μg/mL三七总皂苷能有效抑制NF-κB的核转移及IL-1β在胞浆内的表达。结论:三七总皂苷对LPS刺激所致的BV2小胶质细胞炎症反应有保护作用,其机制可能与抑制NF-κB通路激活有关。     

三七花总皂苷水凝胶促进大鼠急性皮肤创伤愈合作用研究

目的探讨三七花总皂苷水凝胶对皮肤创伤修复作用。方法切除大鼠全层皮肤,形成急性机械损伤动物模型。重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)凝胶做为阳性对照组,三七花总皂苷水凝胶(10 g/L、25 g/L、50 g/L)涂布创伤表面,每日1次,连续10日,比较不同处理方式对创面愈合时间、创面愈合率、创面血管形成、创面组织学的影响。结果三七花总皂苷水凝胶组(10 g/L、25 g/L、50 g/L)随时间和剂量的增加确实有提高创面愈合率和降低感染创面感染反应的作用,病理结果显示三七花总皂苷水凝胶明显促进创面炎性渗出物吸收、肉芽组织形成和表皮增生。结论三七花总皂苷水凝胶能够促进大鼠皮肤创伤的修复。     

异构信息网络驱动的恒古骨伤愈合剂“异病同治”4种骨伤疾病的作用机制

目的 通过整合异构信息网络挖掘与实验验证，阐释恒古骨伤愈合剂“异病同治”骨折、股骨头坏死、骨性关节炎和腰椎间盘突出症的作用机制。方法 依托疾病相关数据库和转录组表达谱数据集，以及中医药百科全书数据库，通过生物信息学数据整合与分析，获得4种目标疾病相关基因集和恒古骨伤愈合剂候选靶标谱，进而构建“疾病-证候-方药-靶点-通路-效应”异构信息网络，整合功能富集分析，筛选恒古骨伤愈合剂干预4种骨伤疾病失衡网络的核心靶标，及其参与的生物学通路和对应的临床症状，并加以动物实验验证。结果 异构信息网络挖掘表明，恒古骨伤愈合剂矫正骨折、股骨头坏死、骨性关节炎、腰椎间盘突出症失衡网络的共性机制是，通过调控相关核心候选靶标如蛋白激酶B（Akt1）、连环蛋白β1（CTNNB1）、表皮生长因子受体（EGFR）、热休克蛋白90-α（HSP90AA1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α亚型（PI3KCA）等，及相关生物学通路如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、Janus激酶/信号换能器和转录激活剂（JAK/STAT）、肿瘤坏死因子（TNF）、核转录因子-κB（NF-κB）、Toll样受体等，发挥其调节细胞功能与活性、抑制炎症反应、减少骨质破坏、提高机体免疫功能的药理作用；在个性机制方面，恒古骨伤愈合剂可通过调节疾病靶位的血液循环而改善骨折断端血供；通过调控激素相关通路而维持骨代谢平衡，促进骨折愈合；通过靶向调控脂质相关通路纠正脂代谢紊乱，加速骨形成和骨修复，延缓股骨头坏死的病情进展；通过作用于神经功能调节通路减轻骨性关节炎与腰椎间盘突出症患者病变局部的痛觉刺激，缓解患者疼痛的症状。进一步发现，PI3K/Akt信号通路是该方干预4种疾病关键网络靶标最显著富集的通路，且该方候选靶标与骨折相关基因的网络关联性最强，故选择骨折作为目标疾病进行实验验证，结果表明该方可通过抑制PI3K/Akt信号轴的活化而发挥其加速骨形成、促进骨折愈合的作用。结论 恒古骨伤愈合剂“异病同治”4种骨伤疾病的主要机制涉及细胞功能调节和免疫炎症相关信号通路，其中，PI3K/Akt信号轴可能是该方促进骨再生、骨重建，维持骨代谢平衡的关键作用通路之一。     

丹皮酚联合三七总皂苷对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响

目的探讨丹皮酚联合三七总皂苷应用对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大鼠的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖及TGF-β/Smads信号通路的影响。方法采用胰酶消化法分离培养的CFs随机分为6组:正常对照组,模型组,三七总皂苷组,丹皮酚组,丹皮酚与三七总皂苷联合用药大、小剂量组。采用MTT比色法测定各组培养液中CFs增殖情况,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平,RTPCR法检测转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,Tgfb1)的mRNA表达水平,Western blot法检测TGF-β1、磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)的蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠CFs增殖明显增高,Tgfb1的mRNA表达显著增加,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著增加;与模型组比较,丹皮酚组、三七总皂苷组、联合用药的大剂量和小剂量组均可抑制由AngⅡ诱导的CFs的增殖,Tgfb1的mRNA表达显著减少,α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达显著减少;与丹皮酚组、三七总皂苷组比较,联合用药大、小剂量组在抑制CFs增殖的作用上显著增强,抑制Tgfb1的mRNA表达效果显著增强,抑制α-SMA及TGF-β1、p-Smad2/3的蛋白表达效果显著增强;与联合用药小剂量组比较,联合用药大剂量组对以上指标的抑制效果更佳,显示一定的剂量依赖性。结论丹皮酚与三七总皂苷联合应用对抑制CFs增殖,呈现明显的协同作用。其作用机制与抑制TGF-β/Smads信号通路的传导有关。     

基于VEGF/VEGFR-2信号通路探讨穿山龙总皂苷促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果

目的基于血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)信号通路观察穿山龙总皂苷促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果。方法 SD雌性大鼠50只,根据体质量随机分为骨折对照组、模型组、地塞米松组(10 mg/kg)、穿山龙总皂苷低剂量组(20 mg/kg)和穿山龙总皂苷高剂量组(40 mg/kg)。模型组、地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组经戊巴比妥钠(0.3 m L/100 g)腹腔注射麻醉,切除双侧卵巢,建立去势骨折模型,骨折对照组只建立股骨的简单横向闭合性骨折。建模成功后,地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组给予相应药物灌胃,模型组、骨折对照组给予等体积的0.9%氯化钠注射液。实验结束后,制作股骨折后骨痂处骨结构病理切片,对股骨折后骨痂处行骨密度、血管数量测定,RT-PCR、Western blotting法对股骨折后骨痂处VEGF、VEGFR-2基因和蛋白水平测定。结果与骨折对照组比较,模型组骨痂处骨密度、血管数量、VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P 0.05);与模型组比较,地塞米松组、穿山龙总皂苷低剂量组、穿山龙总皂苷高剂量组骨痂处骨密度、血管数量、VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P 0.05),且穿山龙总皂苷高剂量组骨痂处骨密度、血管数量、VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平高于穿山龙总皂苷低剂量组(P 0.05);与地塞米松组比较,穿山龙总皂苷低剂量组骨痂处骨密度、血管数量、VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P 0.05),穿山龙总皂苷高剂量组骨痂处骨密度、血管数量、VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P0.05)。结论穿山龙总皂苷可促进去势大鼠骨折血管形成和骨折愈合;其机制与穿山龙总皂苷可促进去势大鼠骨折骨痂处VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表达水平,进而激活VEGF/VEGFR-2信号通路有关。     

三七总皂苷对肝纤维化小鼠血清中转化生长因子-β1及白介素-1的影响

目的观察三七总皂苷对肝纤维化小鼠血清中TGF-β1及IL-1的影响,探讨三七总皂苷抗肝纤维化可能的免疫学机理。方法用CC l4复制小鼠中毒性肝纤维化模型,同时给与三七总皂苷治疗,酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定血清中TGF-β1及IL-1的水平,并行肝脏病理组织切片检测。结果三七总皂苷能显著降低肝纤维化小鼠血清中TGF-βl及IL-1的水平,减轻肝纤维化程度。结论三七总皂苷具有抗肝纤维化作用,其机理可能与降低血清中TGβ-p1及IL-1的水平有关。     

基于Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路探讨三七总皂苷对自身免疫性心肌炎模型大鼠心肌凋亡影响的研究

目的:探讨三七总皂苷通过B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)/ Bcl-2相关x蛋白(Bax)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)信号通路对自身免疫性心肌炎(EAM)模型大鼠心肌凋亡的影响。方法:55只Lewis大鼠被分成对照组(n=11)和造模组(n=44)。造模组采用猪心肌肌球蛋白乳浊液后足垫皮下注射建立EAM模型,对照组大鼠给予等体积完全弗氏佐剂后足垫皮下注射。成功建立EAM模型的大鼠被分成模型组、三七总皂苷低、高剂量组和甲氨蝶呤组各11只。模型组、对照组通过灌胃给予蒸馏水10 ml/kg,每日1次; 三七总皂苷低、高剂量组分别灌胃给予10、20 mg/ml三七总皂苷溶液10 ml/kg,每日1次; 甲氨蝶呤组灌胃给予0.1 mg/ml甲氨蝶呤混悬液10 ml/kg,每周1次。各组大鼠均给药4周。结果:与模型组比较,三七总皂苷低、高剂量组和甲氨蝶呤组大鼠左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)较高,而左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)水平较低,心肌组织病理评分较低,心肌组织细胞凋亡率较低,心肌组织Bcl-2表达水平较高,Bax、Caspase-3表达水平较低(均P<0.05),且三七总皂苷干预组呈现一定量效关系。结论:三七总皂苷能剂量依赖性的改善EAM大鼠心功能,减轻心肌炎症病理变化,抑制细胞凋亡,其作用可能与调节Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路中凋亡相关蛋白表达有关。     

三七不同炮制品中皂苷类成分的含量比较

目的:建立一种RP-HPLC同时测定三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1、Re含量的分析方法,并比较不同炮制品中这4种成分含量的异同。方法:采用高效液相色谱法。色谱条件:色谱柱:Ultimate XB-C18(250mm×4.6 mm,5μm);柱温:25℃;流动相:乙腈-水梯度洗脱;检测波长:203nm。.结果:蒸三七中三七皂苷R1的平均含量为0.806%、Rg1为3.18%、Re为1.00%、Rb1为0.998%,高于相应生三七和油炸三七中相应的成分;其中,生三七中上述成分的含量分别为0.747%、3.24%、0.961%、0.977%,油炸三七中分别为0.765%、2.84%、0.860%、0.847%。结论:三七不同炮制品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1、Re的含量存在差异;炮制对三七皂苷类成分的含量有影响。     

三七花总皂苷清除活性氧自由基及抗脂质过氧化作用研究谢云峰谢集照龙盛京邱莉李映新张莹

目的：探讨三七花总皂苷清除活性氧自由基及对抗脂质过氧化作用的影响。方法从三七花盘中提取三七花总皂苷,D-101大孔吸附树脂分离纯化皂苷;采用分光光度法测定其对羟基自由基、DPPH 自由基的作用。用硫代巴比妥分光光度法观察三七花总皂苷对 Fe2＋半胱氨酸诱发肝脂质过氧化作用的影响。结果三七花总皂苷对羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的半数清除率（IC50值）分别为0.035 mg/ml、0.094 mg/ml;对Fe2＋半胱氨酸诱发肝脂质过氧化的最大抑制率为89.31%,具有较强的抑制作用。结论三七花总皂苷具有清除活性氧自由基及抗脂质过氧化作用。     

三七总皂苷肠溶微丸的制备及处方工艺优化

目的:通过工艺优化,制备释放度符合肠溶制剂要求的三七总皂苷微丸.方法:采用挤出滚圆技术,首先制备三七总皂苷载药丸芯,然后采用流化床底喷包衣设备,以丙烯酸树脂类包衣材料Eudragit L30D-55对载药丸芯进行包衣并用中心复合设计优化肠溶包衣处方.结果:所得三七总皂苷肠溶微丸在人工胃液中2 h内累积释放百分数小于5%,在模拟人体胃肠道环境中3 h内累积释放85%以上.结论:制得的三七总皂苷肠溶微丸抗酸性好,具备较理想的肠溶特征,避免了三七总皂苷类成分在胃液中的降解.     

三七总皂苷对大鼠扭体模型的镇痛作用

目的:观测三七总皂苷对大鼠扭体模型的镇痛作用。方法:24只SD大鼠随机分为生理盐水对照组(n=12)、三七总皂苷组(n=12),各组大鼠腹腔给药,12h一次,给药7天。于第8天给药后30min腹腔注射乙酸建立扭体模型,观测给药后15min扭体反应次数。结果:三七总皂苷具有较强的镇痛作用,三七总皂苷组大鼠扭体反应次数明显少于生理盐水对照组(P<0.01)。结论:三七总皂苷对乙酸所致大鼠扭体模型有一定的镇痛作用。     

三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍对成骨细胞的增殖和钙化作用研究

目的:探讨三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍对体外培养成骨细胞的增殖和钙化的影响.方法:取3～5代成骨细胞进行试验,成骨细胞密度为1×105个/mL,三七总皂苷和淫羊藿苷质量浓度为1,10,20,50 mg·L-1,采用MTT法观察单个药物及其配伍对成骨细胞的增殖的影响,采用茜素红钙化结节染色法观察钙化作用.结果:三七总皂苷和淫羊藿苷在质量浓度为10,20,50 mg·L-1时皆能够明显促进成骨细胞增殖.三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍比例为5∶2时,可明显促进成骨细胞增殖并有明显的钙化作用(P＜0.01).结论:从对成骨细胞增殖和钙化作用的角度证实了三七总皂苷和淫羊藿苷组分配伍的合理性.     

离子交换树脂对三七叶总皂苷的脱色精制研究

目的：采用离子交换树脂法脱色，精制大孔吸附树脂吸附分离得到的三七叶总皂苷。方法：静态吸附筛选适用的离子交换树脂，动态吸附流出曲线比较了2种阴离子交换树脂(D296，Dt)的脱色性能；固定床柱操作方式阳离子交换树脂和阴离子交换树脂串联进行平行脱色实验。结果：Dt树脂的循环使用性能好，对三七叶总皂苷的脱色率近90%，获得品质好含量高的三七叶总皂苷产品。结论：离子交换树脂法脱色工艺，适用于精制三七叶总皂苷。     

三七总皂苷对非酒精性脂肪肝大鼠的改善作用及对NO/iNOS/NF-κB通路的影响

目的研究三七总皂苷对非酒精性脂肪肝大鼠的改善作用及对NO/iNOS/NF-κB通路的影响。方法96只雄性SD大鼠随机分为空白组,模型组,辛伐他汀组(2 mg/kg),三七总皂苷低、中、高剂量组(4.5、9、18 mg/kg),每组16只,灌胃给药(10 mL/kg),分别于第8、12周取材,检测2个时间点各组大鼠外周血丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和肝脏NO、iNOS(诱导型一氧化氮合酶);HE染色观察肝组织病理学形态;免疫组化法检测iNOS在肝脏细胞中的表达情况;Western blot法检测NF-κB(核因子-κB)、p-NF-κB(磷酸化核因子-κB)、IKKα(IκB激酶-α)、p-IKKα(磷酸化IκB激酶-α)、IκBa蛋白表达量。结果与模型组比较,给药8周后,大鼠血清各项生化指标均出现了显著下降(P<0.05);给药12周后,与第8周结果比较,模型组血清生化指标显著增加(P<0.05),而给药组增加趋势并不显著,且三七总皂苷给药剂量在抑制非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂质沉积方面存在剂量-效应关系。三七总皂苷可显著下调肝组织中NO、iNOS水平及NF-κB信号通路蛋白的表达量(P<0.05)。结论三七总皂苷可有效降低非酒精性脂肪肝大鼠转氨酶水平及血脂指标,同时可以抑制NO/iNOS/NF-κB信号通路,减少肝损伤,是三七总皂苷降脂护肝、减轻炎症反应的可能机制之一。     

三七总皂苷对海水淹溺兔肺泡巨噬细胞TNF-α mRNA表达的影响

目的观察海水淹溺后家兔肺组织光镜下变化,并探讨三七总皂苷干预对海水淹溺后家兔肺泡巨噬细胞内TNF-αmRNA表达的影响。方法采用气管切开插入塑料导管、向气管内灌海水4mL/kg,双肺自主通气的方法模拟海水淹溺造成急性肺损伤模型,随机分为对照组、海水淹溺组、三七总皂苷治疗组。于淹溺后进行血气分析,采集支气管肺泡灌洗液,分离和培养肺泡巨噬细胞,并采集肺组织进行病理学分析,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺泡巨噬细胞中TNF-αmRNA的表达。结果光镜下,海水淹溺兔肺组织炎症细胞大量浸润,经三七总皂苷治疗后肺组织损伤程度减轻。RT-PCR分析示淹溺后TNF-αmRNA表达显著增高,90min后达最高峰,而三七总皂苷可使之降低。结论海水淹溺急性肺损伤可能与肺泡巨噬细胞内TNF-αmRNA高表达有关。三七总皂苷可降低TNF-αmRNA的高表达,减轻肺损伤程度。