基因芯片技术研究肝纤维化相关基因

目的通过对大鼠肝纤维化发生过程中基因表达差异性的分析，探讨肝纤维化的发生机制。方法采用四氯化碳((CC14)诱导大鼠肝纤维化，于用药2周、4周、6周、8周分别取肝组织提取总RNA，分离纯化poly(A)^ RNA，逆转录并用[α-^33P]dATP制备探针，与含1176个基因的大鼠cDNA微阵列杂交及洗涤，信号检测，微阵列图像分析和计算机软件处理数据。结果用药4周时，筛选出的166条差异表达基因中，上调基因156条，主要为细胞骨架和动力蛋白基因、激素受体基因、细胞内蛋白磷酸化酶基因和ras相关蛋白基因等；下调基因主要为P450相关基因、核糖体蛋白基因、脂肪酸结合蛋白基因和生长因子受体基因等。用药8周时，筛选出差异表达基因中上调基因246条，主要为细胞外信息传导基因、生长因子相关基因、细胞周期相关基因、凋亡相关蛋白基因和激素受体基因等；下调基因主要为脂质代谢基因、激素受体基因和氨基酸受体基因等。其中部分差异表达基因用RT—PCR和Northern印迹法加以证实。结论肝纤维化形成过程中存在多个表达水平不同的基因，涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，同一基因在不同时期表达水平也不一样，值得进一步研究。     

cDNA微阵列对不同时期胶原诱导性关节炎大鼠PBMC基因表达谱的初步研究

目的 研究胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠不同时期外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）基因表达谱，寻找与疾病炎症相关的特异表达基因，初步探讨类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发病机制。方法 以含有96个基因的功能基因组芯片研究CIA大鼠发病早期、高峰期和后期及正常大鼠的PBMC基因表达谱。结果 cDNA微阵列检测结果显示，CIA早期差异表达基因（〉2或〈0．5）有19个，高峰期25个，后期17个以及三个时期持续表达的上调基因有10个。差异表达基因主要涉及白细胞介素及其受体、趋化因子及其受体、转化生长因子配体及受体等。结论 CIA不同时期基因的差异表达可能与RA病情的持续进展有关，为进一步探讨细胞因子在RA的作用提供理论依据。     

急性主动脉夹层与正常对照主动脉组织基因的差异表达

目的通过组织芯片技术分析急性主动脉夹层患者主动脉组织差异表达基因探讨主动脉夹层发病的分子机制。方法取急性主动脉夹层患者及健康对照（各4例）的主动脉组织,通过组织芯片筛选急性主动脉夹层患者和健康对照差异表达的基因。利用生物信息学技术分析差异表达的基因参与的信号通路。结果实主动脉组织芯片分析结果显示,急性主动脉夹层患者与正常对照差异表达大于2倍的基因有129个,其中83个基因表达下调,46个基因表达上调。差异表达的基因主要编码与细胞、细胞外基质粘附相关的蛋白。信号通路分析显示,主动脉夹层中受影响最大的两条通路是粘附斑和肌动蛋白骨架调节相关通路。结论通过组织芯片分析筛选到的急性主动脉夹层差异表达基因可能参与了主动脉夹层的病理过程,为研究其致病机制奠定了荩础。     

大鼠胚胎肝干细胞标记物的筛选

目的筛选大鼠胚胎肝脏组织特异性表达的mRNA,寻找肝干细胞的特异性标记物。方法取成年大鼠肝脏2个、2周胚龄大鼠胚胎肝脏2个作为标本。提取标本的RNA,反转录合成cDNA,再体外转录合成cRNA,同时进行标记。将cRNA纯化后进行杂交、洗涤、染色,对芯片进行扫描。将基因芯片数据进行处理与分析,筛选出目的基因。免疫组化方法检测各相关蛋白在胚胎肝脏组织中的表达。结果筛选出787个在大鼠胚胎肝脏组织中高表达的差异表达基因,涉及8个类别。免疫组化检测发现,高迁移率族蛋白A1(HMGA1)在2周胚龄多数胚肝胎细胞中表达阳性,阳性信号多分布于细胞质。结论大鼠胚胎肝脏组织发育相关的差异表达基因筛选可采用基因芯片,HMGA1是大鼠胚胎肝干细胞特异性标记物。     

雷帕霉素对急性肝功能衰竭大鼠Toll样受体-4表达的影响

目的 探讨雷帕霉素抑制Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)通路对急性肝功能衰竭大鼠Toll样受体(TLR)-4基因表达的影响.方法采用腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)800 mg/kg和脂多糖(LPS)8 μg/只,建立急性肝功能衰竭大鼠模型,分别在注射D-GalN和LPS后2、6、12、24、48 h 5个时间点留取大鼠血及肝脏标本.SD大鼠分为对照组(n=6)、急性肝功能衰竭模型组(n=30)、STAT抑制剂雷帕霉素(RPM)干预组(n=30),在各不同时间点检测ALT、AST.ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平,RT-PCR法检测大鼠肝组织TLR-4 mRNA表达.数据行t检验.结果急性肝功能衰竭组大鼠在造模后2 h TNF-α、IL-6水平均显著升高,6 h达峰值,RPM可明显抑制TNF-α、IL-6水平.急性肝功能衰竭组大鼠6、12、24、48 h肝组织中TLR-4 mRNA分别为0.745±0.135、1.092±0.175、1.115±0.152和0.812±0.130,RPM干预后分别为0.545±0.118、0.798±0.124、0.857±0.109和0.595±0.152,各时间点两组比较,差异均有统计学意义(t值分别为2.726、3.349、3.382和2.567,均P＜0.05).TLR-4 mRNA表达与ALT、AST均呈正相关(r值分别为0.722、0.712,均P＜0.01).结论抑制JAK/STAT通路可明显下调急性肝功能衰竭大鼠肝组织TLR-4表达,JAK/STAT通路可能参与急性肝功能衰竭过程中TLR-4mRNA表达的调控.     

HGF及其受体c-met在肝衰竭与部分肝切除模型中表达差异性研究

目的研究HGF及其受体c-met在肝衰竭和部分肝切除两种动物模型肝组织的表达差异。方法分别采用D-GalN/LPS腹腔注射和70%肝脏外科切除术建立肝衰竭和部分肝切除模型,同时以健康大鼠作为对照组。采用ELISA法检测血清HGF水平,采用Real-time PCR和Western-blot法分别检测肝组织c-met基因和蛋白的表达水平。结果与对照组比,部分肝切除模型大鼠血清HGF及其受体c-met表达水平均有明显升高（P〈0.01）,而在肝衰竭模型大鼠血清HGF水平虽有升高,但c-met蛋白表达水平却明显降低（P〈0.01）。结论肝细胞c-met表达水平的降低是D-GalN/LPS诱导肝衰竭大鼠肝细胞再生障碍的主要原因。     

筛选转化生长因子β1刺激肝星状细胞差异表达基因的研究

目的 筛选转化生长因子β 1(TGF β 1)刺激大鼠肝星状细胞(Hsc)的差异表达基因,以揭示TGF β1介导肝纤维化的分子发病机制. 方法分别用Trizol法抽提TGF β1刺激的HSC及磷酸盐缓冲液刺激为对照的HSC总RNA,逆转录合成双链cDNA,制备掺入生物素标记的cDNA探针,与人基因表达谱芯片杂交,用Agilent扫描仪对芯片结果进行扫描,利用软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 从13824条目的 基因中筛选出177条差异表达基因,其中123条基因表达上调,其中包括:结缔组织生长因子,微管蛋白ε 1,V型胶原α2,连环蛋白6 2,钙粘蛋白6,2型,Smad3,丝裂源活化蛋白激酶4,生长因子受体结合蛋白7,丝裂原活化蛋白激酶相互作用/丝氨酸/苏氨酸激酶1等;54条基因表达下调,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子4,干扰素调节因子7,干扰素诱生蛋白p78,骨形态发生蛋白7,基质gLa蛋白,人类丝氨酸蛋白酶抑制剂进化支B成员8,干扰素刺激基因2.0×104,死亡相关蛋白6,金属硫蛋白1H,超氧化物歧化酶2等;同时筛选到8个未知功能蛋白. 结论 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了TGF β 1刺激HSC的差异表达基因,初步揭示了TGF β1致肝纤维化的分子机制是诸多因素共同作用的结果,为进一步寻找新的基因治疗靶点奠定了基础.     

微小RNA在肿瘤坏死因子α介导的急性肝功能衰竭小鼠体内的表达谱及其作用

目的 了解微小RNA(miRNA)在急性肝功能衰竭小鼠模型中的表达谱及对其发病机制的调控作用.方法 将BALB/c小鼠85只分为4组,模型组40只用D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)腹腔注射建立肝功能衰竭模型,D-GalN单药组20只、LPS单药组20只和对照组5只分别予D-GalN、LPS和0.9%NaCl溶液腹腔注射.在给药后0、5和7 h观察小鼠肝脏组织学变化,0、1、3、5、7和9 h留取小鼠血清和肝脏组织标本.采用实时定量PCR方法检测小鼠血清及肝组织中炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)表达水平;采用miRNA微阵列(microarray)检测小鼠肝脏中miRNA的表达谱,实时定量PCR验证其表达.体外LPS诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7活化,诱导不同时间点收集细胞检测细胞miRNA的表达情况.组间均数比较用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson和Spearman相关分析.结果 miRNA微阵列发现小鼠急性肝功能衰竭发病过程中miRNA的表达谱发生了明显变化,与对照组相比,模型组有97个miRNA表达变化显著(P＜0.01),其中21个miRNA在给药后5 h和7 h均表达上调,27个miRNA均表达下调,进一步PCR验证得到miR-146a和miR-155随给药时间延长表现为持续性上调,且miR-155表达与TNF-α和IL-6表达均具有良好的相关性.体外实验进一步发现miR-146a和miR-155在活化的巨噬细胞中表达上调.结论 在小鼠急性肝功能衰竭发病过程中,伴随着miRNA表达谱的变化,炎性反应相关miR-146a和miR-155明显上调,可能在急性肝功能衰竭的免疫发病机制中发挥重要的调控作用.     

非特异性间质性肺炎相关基因筛选和生物信息学分析

目的通过生物信息学的方法筛选非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia, NSIP)的致病基因,为进一步研究提供靶点。 方法从GEO数据库下载基因芯片数据集GSE110147、GSE21369、GSE40839,使用limma包分析工具筛选正常组织与NSIP的差异表达基因。通过clusterProfiler包对差异表达基因进行GO分析和KEGG通路富集分析,找到NSIP发病过程中差异表达基因主要参与的生物功能及其集中的信号通路。利用STRING数据库和CYTOSCAPE软件构建蛋白相互作用网络,使用MCODE软件提取蛋白相互作用网络中的子网络模块。 结果3个数据集的差异表达基因做韦恩图得到3个共同差异表达基因。GO富集分析表明NSIP中上调的差异表达基因主要影响RNA剪接、抗病毒感染、对肽的细胞反应等相关的生物过程,富集的分子主要参与细胞组分的囊腔合成分泌、剪接复合体,富集的分子功能主要参与ATP酶活性,受体配体活性及DNA结合转录激活因子活性。NSIP中下调的蛋白主要涉及转移酶活性调节的生物过程。KEGG通路分析表明NSIP中上调的差异表达基因主要参与PI3K-Akt、人类乳头瘤病毒感染及MAPK等信号通路。 结论利用生物信息学筛选出差异表达基因,可能是NSIP发病机制的新靶点,对诊断治疗NSIP具有临床意义。     

肝癌相关差异基因的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法对肝癌差异表达基因进行基因功能和信号通路分析,为临床筛选肝癌发生、发展的相关分子标志物及药物靶点提供理论基础。方法从公共数据库(GEO)中获取18例肝癌组织和18例癌旁组织的基因表达阵列数据进行生物信息学分析,筛选差异表达基因。利用DAVID和STRING数据库对差异表达基因进行基因功能、信号通路和蛋白相互作用分析。结果通过对两组数据的差异表达基因筛选,共获得1 108个差异表达基因,其中上调基因605个、下调基因503个。差异表达基因主要涉及细胞周期、DNA复制、癌通路、p53信号通路、黏附、补体途径、三大营养物质代谢及性激素代谢等。通过STRING数据库分析列出位于前20位蛋白互作网络的中心节点蛋白。结论本研究采用生物信息学方法对肝癌基因芯片数据进行挖掘,从基因水平探讨肝癌发生发展的物质基础、分子功能和生物学过程,为肝癌发生的机制研究、肿瘤标志物的筛选及药物靶点选择提供参考。     

DNA微阵矩技术研究肝纤维化差异基因表达谱变化

应用DNA微阵矩技术研究乙型肝炎肝硬化组织差异基因表达谱改变,以寻找肝纤维化相关基因,探讨肝纤维化的发病机理。抽提正常肝组织和肝硬化组织中的mRNA来制备探针,经杂交、洗涤后,通过计算机扫描分析正常肝组织和肝硬化组织基因表达谱的差异情况。在10000个候选基因中,筛选出99条差异表达基因,表达上调的有45条,表达下调的有54条。其中未知基因9条。因此基于DNA微阵矩技术的肝纤维化基因表达谱分析能够高通量筛选与肝纤维化发生发展相关的基因。     

聚合酶链反应芯片筛选5-氟尿嘧啶对乳鼠心肌细胞心脏毒性差异表达基因的作用

目的应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）芯片技术观察5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对乳鼠心肌细胞心脏毒性相关基因表达的调控作用。方法利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌细胞．分为对照组和5一FU刺激组。提取并纯化细胞RNA,紫外分光光度计检测RNA提取物浓度、变性琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性。选择包含84个已知心脏毒性相关基因的PCR芯片,采用比较阈值（△△Ct）法分析两组基因的表达差异。以表达差异（即上调或下调）大于2倍的基因为有意义的差异基因。结果共有48条基因出现差异表达,其中5条基因表达上调,43条基因表达下调。结论利用PCR芯片技术筛选相关基因,为深入阐明5-FU心脏毒性的作用机制提供了新思路。     

Identification of differentially expressed genes in rheumatoid arthritis by a combination of complementary DNA array and RNA arbitrarily primed-polymerase chain reaction

OBJECTIVE: There is increasing evidence that T cell-independent pathways, such as the up-regulation of protooncogenes and the production of growth factors and matrix-degrading enzymes, lead to progressive destruction of affected joints. Therefore, identification of differentially regulated genes restricted to rheumatoid arthritis (RA) synovial fibroblasts is essential. A combination of RNA arbitrarily primed-polymerase chain reaction (RAP-PCR) and complementary DNA (cDNA) array with defined genes was used for a highly sensitive differential screening using small amounts of RNA. METHODS: RNA was extracted from cultured synovial fibroblasts obtained from 6 patients with RA and 6 patients with osteoarthritis (OA). RAP-PCR was performed using different arbitrary primers for first- and second-strand synthesis. PCRs were hybridized to cDNA array membranes. RA samples were compared with OA samples for differentially expressed genes. RESULTS: In contrast to standard cDNA array, the identification of 12 differentially expressed genes in RA compared with OA (approximately 6%) was possible. Differentially expressed genes of interest were confirmed using semiquantitative RT-PCR and in situ hybridization. CONCLUSION: Numerous variants of the differential display method and continuous improvements, including RAP-PCR, have proven to be both efficient and reliable for examining differentially regulated genes. Our results show that RAP-PCR combined with cDNA arrays is a suitable method for identifying differentially expressed genes in rheumatoid synovial fibroblasts, using very small amounts of RNA.     

Identification of differentially expressed miRNAs and key genes involved in the progression of alcoholic fatty liver disease using rat models

BackgroundAlcoholic fatty liver disease (AFLD) is a liver disease caused by prolonged heavy drinking and has a poor prognosis in the clinic. This study aimed to explore the differential miRNAs expression profiles in the AFLD rat model.MethodsThe rat model of AFLD was established by ethanol intragastric administration and was used to explore the differential miRNAs expression profiles. We further analyzed the potential target mRNAs using the bioinformatics technique. GO and KEGG pathway enrichment analyses were carried out to better understand the biological function of differential expression genes (DEGs). We used the human Gene Expression Omnibus (GEO) dataset GSE28619 to further screen the key differentially expressed genes. The integration between the differentially expressed genes from the AFLD model and GEO was conducted and the key genes were identified.ResultsThe serum ALT, AST, TG, and TC levels in the AFLD model group were significantly higher than those in the normal control group. There are 45 miRNAs with significant changes including 26 upregulated and 19 down-regulated miRNAs. GO and KEGG enrichment showed various metabolic processes and signaling pathways were enriched in the progression of AFLD. After integrating the results of GSE28619 and DEGs, we observed that there are 12 genes with significant changes in two data sets, including PSAT1, TKFC, PTTG1, LCN2, CXCL1, NR4A1, RGS1, VCAN, FOS, CXCL10, ATF3, and CYP1A1.ConclusionAFLD showed differentially expressed miRNAs, which may be involved in the occurrence and progression of AFLD. Meanwhile, some signal metabolic pathways may be related to the pathogenesis of AFLD.     

基因芯片在肝细胞癌相关基因筛选中的初步研究

目的探讨基因表达谱芯片技术在筛查肝细胞癌相关基因群表达中的作用。方法采用美国Affymetrix公司的U133A2．0基因表达谱芯片，按一步法抽提肝细胞癌及正常肝脏组织总RNA，分离纯化两种组织的mRNA；经逆转录合成掺人生物素标记的cDNA合成探针，与芯片杂交和严格洗片后，用荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像，分析肝细胞癌及正常肝组织中差异表达的基因。结果在18400条基因中，肝细胞癌组织与正常肝脏组织间有2756条（14．98％）存在差异表达的基因，其中上调基因1772条和下调基因984条，对2756条差异表达基因作了初步功能分类，这些基因与肝细胞癌的发病机制存在相关性。结论基因表达谱芯片技术可以筛选出肝细胞癌表达异常的相关基因群，对其进一步研究有助于认识肝细胞癌的发病机制。