五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较

目的 比较5种国内外HBV DNA定量检测试剂盒的灵敏度、特异度和符合率.方法 分别应用A、B、C、D 4种国产和德国Roche公司生产的荧光定量试剂盒检测国家HBV DNA标准品、7份灵敏度稀释血浆(15.6～1 000 IU/mL)、15份健康献血者和45份慢性乙型肝炎患者血浆.统计学分析采用平行性检验.结果 5种试剂盒对9份阳性和8份阴性国家标准品均能正确检出,并能准确定量标准品中的灵敏度样本;对灵敏度稀释血浆,Roche试剂盒和国产试剂盒C、D均能检出最高稀释度样本(15.6 IU/mL),而试剂盒A和B检测限分别为125 IU/mL和500 IU/mL,Roche试剂盒及C试剂盒的定量检测结果与理论值的符合率高,两者检测结果经平行性检验存在线性相关(r>0.98);检测15份健康献血者血浆,试剂盒D有2份假阳性;检测慢性乙型肝炎患者血浆,Roche试剂盒对1×102～1×108 IU/mL范围的样本检测的变异系数均<15%,而国产试剂盒变异系数较大.4种国产试剂盒与Roche试剂盒的符合率为50%～96 %,其中A为61%,B为50%,C为96%,D为83%,试剂盒C符合率显著高于试剂盒D、A和B(X2=5.62,P<0.05;X2=28.93,P<0.01;X2=44.31,P<0.01).各种试剂盒符合率最高的区段均在1×104～1×108 IU/mL.结论 国产HBV DNA定量试剂盒质量差异较大,试剂盒c与Roche试剂盒定量检测HBV DNA的符合率最高,国产试剂盒质量有待进一步提高.     

实时荧光定量PCR检测布鲁杆菌方法的应用

目的 探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)用于布鲁杆菌检测的可行性.方法 根据布鲁杆菌BCSP31基因设计合成1对引物和TaqMan探针,以克隆有布鲁杆菌基因片段的PMD18-T质粒作为标准品DNA模板,进行FQ-PCR检测,绘制标准曲线;对所应用的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析;并对临床血液标本进行FQ-PCR,与临床诊断进行比较.结果 用标准品DNA建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);FQ-PCR检测的灵敏度拷贝数为5个/μl,普通PCR为5×102个/μl,FQ-PCR是普通PCR的100倍;用FQ-PCR检测6株布鲁杆菌菌株及5株非布鲁杆菌菌株,布鲁杆菌均检出较强荧光信号,非布鲁杆菌未检出;5×103个拷贝/μl标准品DNA检测后,Ct值批内变异系数(CV)为0.71%,批间CV为7.23%;用FQ-PCR检测临床确诊阳性血标本24份,检出阳性19份,符合率为79%(19/24),阴性对照血标本31份,全部阴性,阴性符合率为100%(31/31),临床症状可疑标本30份,检出阳性2份.结论 用FQ-PCR方法检测布鲁杆菌具有高度敏感性、特异性及良好的重复性,与临床阳性及阴性标本的符合率较高,可用于快速检测各种样本中的微量布鲁杆菌以及作为布鲁杆菌感染的实验室检测方法.     

结核抗原检测试剂国家参考品的研制

目的:建立结核抗原检测试剂的国家参考品。方法:结核抗原国家参考品经原料复核、分散稀释、分装和组装等步骤制备而成，并使用结核分枝杆菌核酸检测试剂盒进行拷贝数标定。使用两家不同企业的胶体金法进行协作标定研究，最终确定其质量标准要求。同时对参考品的均匀性和稳定性进行考察。结果:两家公司的试剂对阳性参考品候选样本(5/5)和阴性参考品候选样本(5/5)均能正确检出；对于倍比稀释后的参考品(编号Rv),两家公司均可检出32倍阳性，64倍阴性。根据协作标定结果，参考品由5份阴性参考品、5份阳性参考品、1份最低检出限/精密度参考品(P0)组成。参考品的质量标准确定为：阴性参考品符合率应为5/5;阳性参考品符合率应为5/5;最低检出限参考品P0进行倍比稀释至64倍，其中16倍稀释的检测结果应为阳性；精密度参考品P0进行8倍稀释后平行检测10次，检测结果应均为阳性，且显色条带均一。结论:本研究首次建立了一套能够满足胶体金免疫层析法结核抗原检测试剂盒的质量评价和控制要求的国家参考品。     

布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法。方法 使用以布鲁氏菌bscp31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果。结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探针浓度分别为0.8 μmol/L和0.4 μmol/L;最佳扩增条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,循环40次;98 ℃酶失活10 min。布鲁氏菌核酸DNA为0.96 ng/反应~3.68 fg/反应时,ddPCR检出靶标基因拷贝数为2.00×10⁵拷贝/反应~1拷贝/反应,ddPCR测得值的对数值与DNA浓度的对数值有线性关系。在疫情相关血液标本DNA的检测中,ddPCR阳性率远高于培养法和试管凝集法;16份人血液标本中靶标基因浓度为5~65拷贝/mL血液(平均29拷贝/mL血液),5份羊血液标本中靶标基因浓度为25~245拷贝/mL血液(平均98拷贝/mL血液)。结论 ddPCR灵敏性高,可检测微量核酸DNA,适合临床血液标本的检测以及布病病原体的分子流行病学调查。     

病原菌多重核酸检测试剂盒分析性能质量评价研究

[摘要]　目的　了解我国病原菌多重核酸检测试剂盒分析性能的现状，特别是检出限性能的基本情况，为相关研发企业和医疗机构使用者提供参考。 方法　根据体外诊断试剂行业标准《细菌和真菌感染多重核酸检测试剂盒（标准号YY∕T 1725-2020）》，使用“34种细菌和真菌感染多重核酸检测试剂国家参考品（批号370026-201801）”对10种不同检测技术原理的病原菌多重核酸检测试剂盒的分析性能进行评估，包括阳性符合率、阴性符合率、重复性及检出限等，并按照国家参考品的质量标准对评价结果进行统计分析。 结果　10款试剂盒中包括4款呼吸道感染试剂盒、3款中枢神经系统感染试剂盒及3款血流感染试剂盒，检测范围或病原谱覆盖8种革兰阳性细菌、14种革兰阴性细菌及10种真菌和非典型病原体。各试剂盒的阳性符合率、阴性符合率、重复性及检出限等分析性能均符合国家参考品的质量标准。呼吸道、中枢神经系统及血流感染试剂盒病原菌谱及检出限性能差异较大，检出限的中位数分别为5×103 CFU/ml、1×103 CFU/ml及1×106 CFU/ml；各试剂盒病原菌谱中分布和出现频率较高的6种病原菌检出限中位值分别为5×102 CFU/ml（肺炎链球菌）、3×103 CFU/ml（金黄色葡萄球菌的）、1×103 CFU/ml（流感嗜血杆菌）、5×104 CFU/ml（铜绿假单胞菌）、3×106 CFU/ml（鲍曼不动杆菌）及5×104 CFU/ml（大肠埃希菌）。结论　我国已经进入体外诊断试剂注册阶段的病原菌多重核酸检测试剂盒均具有较好的准确性、特异性及重复性。同时，研发企业应注意结合临床具体的需求，设计合理的试剂盒病原菌谱，并持续优化检出限性能。     

血清学联合核酸检测在献血者血液筛查中的互补性

目的对温州地区无偿献血者的血液标本进行血清学与核酸联合检测,全面评估血清学与核酸检测(NAT)在降低输血相关传染性疾病中的互补性。方法对2014年10月至2015年6月,温州市中心血站采集的无偿献血者的血液标本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)对血液传染性指标乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)抗体、艾滋病病毒(HIV)抗体、苍白球螺旋体(TP)抗体进行检测,丙氨酸转氨酶(ALT)采用速率法,同时采用核酸检测技术对乙型肝炎病毒(HBV)DNA、HCV RNA、HIV RNA进行6人份三项目联合检测,并对检测结果进行分析。结果 33 736份血液标本中,ELISA(+)NAT(+)95份,其中HBsAg(+)NAT(+)72份,符合率60.5%;HCV抗体(+)NAT(+)13份,符合率11.2%;HIV抗体(+)NAT(+)10份,符合率30.3%。41份ELISA(-)核酸(+)样本,且均为HBV DNA阳性。ELISA(+)NAT(-)173份。ELISA双试剂阳性样本中,HBV、HCV、HIV S/CO≥5的样本组的核酸阳性符合率高于S/CO5的样本组。结论核酸检测能有效地降低输血传播疾病的发生,但也存在漏检的可能,不能完全取代血清学检测,只有两者有机结合才能真正保证血液的安全。     

基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价

目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD)，建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法，并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列，利用Primer Primer 5软件结合手工辅助，设计特异性引物和探针并进行筛选，建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10~5、10~4、10~3、10~2、10~1、10~0、10^-1拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA，评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板，评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康...     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

nested-PCR试剂盒检测牛精液中的布鲁氏菌DNA

目的布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌,能够在吞噬细胞内长期存活并繁殖,引起家畜流产和人的波浪热。根据病原性和感染宿主的不同将布鲁氏菌分为六个种,能否快速、有效地从各种病料中检出布鲁氏菌,对及时控制布鲁氏菌在家畜中的传播和预防对人的感染十分重要。方法2006年6月,宁夏某公司奶牛场工作人员送检3份奶牛冻干精液,用巢式PCR检测出其中的2份为布鲁氏菌感染阳性,这年8月,重复取这2头种公牛的冻精、鲜精复查。结果用本方法检测全部为布鲁氏菌感染阳性。结论这是国内首次用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)试剂盒从送检的牛精液中检出了布鲁氏菌DNA片段。     

快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM抗体的研究

目的　研制一种检测弓形虫病Ig M抗体的快速胶体染料试纸条法(DDIA) ,与国外进口试剂盒进行比较,以评价其临床应用价值。方法　以本实验室筛选的胶体染料D- 1标记兔抗人Ig M,以此标记物与弓形虫病人血清中的抗弓形虫Ig M抗体结合,用点有弓形虫可溶性抗原的硝酸纤维膜通过层析捕获染料标记兔抗人Ig M与弓形虫Ig M抗体的复合物,采用正交试验确定DDIA的最佳检测条件;对2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清和5 0份正常人血清进行检测;同时对弓形虫病流行病学筛查时的84份血清进行检测并与进口试剂盒的检测结果进行比较。结果　DDIA的最佳检测条件为:弓形虫可溶性抗原的点膜浓度为1mg/ m l,血清用量为10μl和兔抗人Ig M胶体染料检测液作1∶2 0稀释时的检测带清晰且背景较浅;2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清均为阳性,5 0份正常人血清有3份为Ig M抗体阳性;DDIA与进口试剂盒的总符合率为97.6 % ,其中阳性和阴性符合率分别为10 0 .0 % (35 / 35 )和95 .9% (47/ 4 9)。结论　DDIA简便快速,有较好的敏感性和特异性,同时与进口试剂盒有较高的符合率,表明该法具有较高的弓形虫病诊断价值。     

两种国产乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂的检测效能评价

比较两种国产不同核酸提取方法定量检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸试剂的检测效能。方法选择经抗病毒治疗且HBV DNA 载量在﹤1×10^4 IU/ml的乙型肝炎患者血清标本36份,采用两种国产HBV核酸定量检测试剂盒平行检测HBV DNA,对阳性血清进行梯度稀释后再检测,从定量线性范围、准确性、灵敏度、特异性等方面比较两种试剂的差异。结果在36例临床血清中,14份经科华试剂检测的结果为﹤500 IU/ml,而圣湘试剂检测的结果仍﹥1.00×10^3 IU/ml;对其中获得检测数据的31份标本进行两种试剂检测结果的相关性分析,发现一致性较好（r=0.817,P﹤0.05）;两种方法检测乙型肝炎患者血清HBV DNA的阳性率分别为55.6％和94.4％,差异具有统计学意义（x2=12.07,P=0.000）;对强阳性血清进行梯度稀释后定量检测显示,两种试剂检测水平的平均值与理论水平的线性相关性较好（湖南圣湘r=0.999,上海科华r=0.992）,但圣湘所有检测的相对偏差均在±0.3logIU/ml之内,而科华有两次检测的相对偏差超出了±0.3logIU/ml范围,提示圣湘试剂检测结果更稳定,使用纳米磁珠核酸提取法的检测结果较煮沸法更加准确。结论以纳米磁珠为提取核酸方法不仅具有更广的线性范围,同时可显著提高国产HBV DNA检测试剂的灵敏度和准确性。     

布鲁菌病血清DNA定量检测的临床意义

目的：分析布鲁菌病血清DNA定量检测与布鲁菌病临床表现的相关性,从而探讨其对布鲁菌病的诊断价值。方法选择2010年5月-2011年6月内蒙古自治区100例布鲁菌血清凝集试验阳性（玻片凝集试验＋~＋＋＋＋）的患者。采用荧光定量PCR法测定血清布鲁菌DNA含量,分析血清布鲁菌DNA检测结果与临床表现的相关性。结果100例布鲁菌血清凝集试验阳性患者中,23例有明显的临床症状,包括发热（91.3%）、全身关节疼痛（78.3%）、乏力（87.0%）、多汗（65.2%）等全身不适症状,其中的20例血清布鲁菌DNA定量值明显升高[范围（1.30～9.27）×106 copies/ml,平均（2.00±7.87）×106 copies/ml],检测时间仅3 h,灵敏度、特异度和准确度分别达到86.96%、97.40%和95.00%。结论血清布鲁菌DNA定量检测可以为布鲁菌病的诊断提供准确、快速和可靠的实验室确诊依据,用以区分布鲁菌现症感染和既往感染,为布鲁菌病的及时治疗提供客观依据。     

基于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法的建立

目的 本文建立一种基于样品检测的特异性好、灵敏性高的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。方法 以哺乳动物beta-actin基因和外源重组质粒为内参,针对布鲁氏菌属特异性基因IS711,建立用于样品检测的布鲁氏菌荧光定量PCR方法,并验证其敏感性、特异性及稳定性,绘制标准曲线。将该方法用于哺乳动物样品检测,并与细菌分离培养检测结果比较。结果 荧光定量PCR方法对布鲁氏菌检测有良好的特异性,3对引物对阴性对照菌均无非特异性扩增;该方法用于样品检测的最低检测限为17拷贝;内外源内参同时存在条件下,布鲁氏菌荧光定量PCR的标准曲线相关系数为R²=0.997(Y=-3.12X+40.9)。将该方法直接用于181份动物样本的检测,并与分离培养结果相比,荧光定量PCR检测阳性率为11.4%,细菌分离培养检测阳性率为9.9%,且细菌分离培养阳性样品与荧光定量PCR阳性样品中编号基本一致。结论 本文建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高、特异性及稳定性好,可直接应用于样品的检测,检测结果受内参基因质控。     

三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较

目的 比较国内常用商品化ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体的诊断效果。方法 选用3种猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒(Keqian,Lvshiyuan,Tianchen),以微量中和试验为金标准,对90份猪血清进行检测分析。结果 中和试验的阳性检出率为34.4%(31/90),Keqian,Lvshiyuan和Tianchen阳性检出率分别为50.0%(45/90), 47.8%(43/90)和 38.9%(35/90)。灵敏度最高的是Keqian,为90.32%,但其特异度只有71.19%;Tianchen的灵敏度和特异度分别为83.87%和79.66%;Lvshiyuan的灵敏度和特异度分别仅为41.94%和16.95%。与中和试验比较,Tianchen试剂盒的κ系数最高为0.63,其次是Keqian为0.57,Lvshiyuan仅为0.04。显示3种试剂盒具稳定性。结论 目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大,与中和试验相比存在较高的假阴性,质量有待提高。     

2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较

目的 探讨国产与进口人肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能差异. 方法 采用国产和进口ELISA试剂盒分别检测50例HFRS疫苗接种者血清样本中抗人HFRS IgG抗体含量,分析比较2种ELISA试剂盒的一致性、灵敏性、精密度以及方法学等的差异. 结果 2种ELISA试剂盒的精密度良好,批内变异系数均<5%;2种试剂阳性一致率为100%,阴性一致率为20%,相似率为60%;灵敏性检测结果显示,2种ELISA试剂盒的灵敏性差异较大(P<0.05),国产ELISA试剂盒的灵敏度约是进口ELISA试剂盒的5倍. 结论 国产人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒灵敏性好,进口ELISA试剂盒特异性好,国产和进口ELISA试剂盒的精密度均良好,在实际应用中应根据具体情况合理选用.     

Detection of West Nile virus RNA (lineages 1 and 2) in an external quality assessment programme for laboratories screening blood and blood components for West Nile virus by nucleic acid amplification testing

Background

A second Italian External Quality Assessment Programme was run in 2011 to assess the performance of Blood Transfusion Centres in detecting West Nile virus RNA in plasma.

Materials and methods.

Each participant received two panels containing negative samples and samples positive for West Nile virus lineages 1 and 2, some of which with a viral concentration close to or below the 95% limit of detection of the respective commercial nucleic acid amplification test assay: the PROCLEIX WNV Assay or the Cobas TaqScreen West Nile Virus Test.

Results

Eleven laboratories took part in the External Quality Assessment Programme. All of them correctly identified the positive samples with a viral concentration above the 95% limit of detection. No false positive results or pre-/post-analytical errors were observed.

Discussion.

The External Quality Assessment Programme run in 2011 allowed participants to assess the performance of the nucleic acid amplification test methods applied in their seasonal routine screening of blood donations. The results confirm the 95% limit of detection reported by the test kits’ manufacturers for both West Nile virus lineages.     

用AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的研究

目的寻找一种快速诊断布鲁氏菌病的方法,并且用这种方法鉴别布鲁氏菌的种和部分型。方法根据布鲁氏菌IS711插入序列及相邻单染色体DNA种的不同,设计引物,建立AMOS-PCR方法,用于诊断布鲁氏菌病,并鉴定种。结果在检测的75份样品中,PCR检出14份阳性;细菌分离与PCR诊断的符合率为50%;在SAT为阳性的情况下,PCR检出阳性率为41.18%;有1份样品分菌和SAT检测结果均为阴性,而PCR结果为阳性。结论AMOS-PCR是一种快速、简便、准确的布病诊断方法,并能鉴定布鲁氏菌的种,区分疫苗(S19)株和野毒株。     

Evaluation of commercially available tests for Chlamydia nucleic acid detection in synovial fluid of patients

Since the presence of Chlamydia nucleic acids has been shown in synovial fluid (SF) from some patients with Chlamydia reactive arthritis, we investigated whether commercially available tests, developed to detect Chlamydia nucleic acids in urogenital samples, could also be used for their detection in SF samples. We therefore tested SF samples, found positive with at least two different systems of DNA amplification in a previous study, with three commercially available kits. No positive results were obtained. It is concluded that the commercially available tests Gen-Probe PACE 2, Amplicor (developed by Roche Molecular Systems) and LCx (developed by Abbott Laboratories) do not have sufficient sensitivity to detect reliably Chlamydia RNA or DNA in SF.