成熟心肌细胞培养技术及其应用进展

未成熟心肌细胞 ( ECM)培养虽有 40年的历史 ,但 ECM与成熟心肌细胞 ( ACM)相比无论在功能还是结构等方面均存在着差异 ,因此 ,利用 ECM培养模型研究心肌细胞生理存在着一定的局限性。随着心血管研究领域中分子生物学技术应用的进展 ,ACM培养正成为一种越来越重要的技术。自 1 977年 Jacobson首次成功培养出 ACM以后 ,1 982年Piper等又建立了另一种 ACM培养模型。近 1 0年来 ,通过改进培养技术维持培养心肌细胞在体特性已取得显著进展 ,使得一些转基因技术可以用ACM培养模型来研究。现将 ACM培养的技术方法和应用进展作一简要综…     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

成熟心肌细胞培养的历史回顾及进展

本文简述成熟心肌细胞培养的历史发展、基本方法及运用分子生物学技术培养心肌细胞的最新进展。     

miRNA调控心肌梗死后心肌细胞凋亡的研究进展

miRNA是长度为21～23个核苷酸的非编码单链RNA小分子，可调节目标mRNA的稳定性和转录的效率，参与调控心肌梗死(MI)后心肌细胞凋亡的分子机制。成熟心肌细胞不可再生的特殊性，决定了抑制心肌细胞凋亡是治疗心血管疾病的重要突破口。本文依据miRNA转录后抑制多种心肌细胞的mRNA生物学特性，综述了miRNA与心肌细胞凋亡通路的关系，阐明miRNA在调控MI后心肌细胞凋亡的分子网络中的作用，为今后心血管疾病的诊治提供新思路和方法。     

高葡萄糖在正常氧及缺氧条件下对乳鼠心肌细胞存活与凋亡的不同影响

目的探讨高葡萄糖在正常氧及缺氧条件下对乳鼠心肌细胞存活与凋亡的影响。方法原代培养乳鼠心肌细胞,予33mmol/L葡萄糖培养基分别在正常氧及缺氧培养条件培养,同时以5.5mmol/L葡萄糖培养基培养作为对照,氯化钴模拟缺氧环境,台盼兰染色检测细胞存活力,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术和AnnexinV-PI双染法流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。结果正常氧条件下,33mmol/L葡萄糖时较5.5mmol/L葡萄糖时乳鼠心肌细胞存活率低(P<0.01),细胞凋亡率高(P<0.01);缺氧条件下,与5.5mmol/L葡萄糖浓度时比较,33mmol/L葡萄糖浓度时,心肌细胞存活率增高(P<0.01),凋亡率降低(P<0.05)。结论在正常氧条件下,高葡萄糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡。氯化钴模拟缺氧条件下,高葡萄糖在乳鼠心肌细胞凋亡损伤中发挥保护作用。     

锰对培养心肌细胞的抗氧化作用

用含80%的 DMEM 培养基加20%小牛血清培养新生 wistar 大鼠心室肌细胞。向培养基中加入0.42×10~(-3)M 黄嘌呤与5.3×10~(-8)M 黄嘌呤氧化酶,使心肌细胞的自由基含量增高;心肌细胞动作电位 APA、OS、MDP、TP、Vmax、APD_(90)等均减小;心肌细胞输入阻抗降低;并呈现以肌丝、线粒体损伤为主的心肌细胞超微结构改变。向培养基中添加0.1ppm Mn,可以抵销黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶(X—XOD)对细胞的损伤作用。这可能是 X—XOD 诱发(?)导致心肌细胞的自由基损伤,而 Mn 通过 SOD 实现其清除自由基作用,从而对抗心肌细胞的自由基损伤。     

左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞乳酸脱氢酶和肌钙蛋白的影响

目的　探讨钙离子拮抗剂左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞损伤标记物及细胞内游离钙离子浓度的影响。方法　在离体乳鼠心肌细胞培养基础上制备心肌细胞缺氧模型 ,随机分为正常对照组、缺氧损伤组和钙拮抗剂干预缺氧损伤组。分别测定各组心肌培养基中乳酸脱氢酶、肌钙蛋白的含量 ,心肌细胞内游离钙离子的浓度 (荧光探针法 )。结果　缺氧损伤组心肌培养基中乳酸脱氢酶和肌钙蛋白的含量及心肌细胞内游离钙离子浓度较正常对照组明显增加 (P均 <0 .0 1) ;经左旋氨氯地平干预后细胞培养基中乳酸脱氢酶和肌钙蛋白的含量及心肌细胞内游离钙离子浓度较缺氧损伤组明显降低 (P均 <0 .0 1)。结论　左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞具有保护作用 ,其机理可能与减轻心肌细胞内钙超负荷有关     

EMRE对高糖高脂诱导心肌细胞凋亡的影响

目的 研究EMRE分子在高糖/高脂（high glucose and high fat,HGHF）培养的大鼠胚胎心肌细胞H9C2中的表达变化及其在HGHF诱导的心肌细胞凋亡中的作用。方法 H9C2细胞培养分为4组:即正常+siCtrl组（培养基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和siCtrl,培养24 h）、正常+si-EMRE组（培养基中含5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇和si-EMRE,培养24 h）、HGHF+siCtrl组（培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸钠和siCtrl,培养24 h）及HGHF+si-EMRE组（培养基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L软脂酸钠和si-EMRE,培养24 h）。用qRT-PCR及Western blot检测EMRE在各组细胞中的表达;用流式细胞术（FCM）分析各组心肌细胞的凋亡;用Western blot检测caspase3与caspase9表达;用荧光探针DCFH-DA检测各组心肌细胞内ROS水平。结果 HGHF诱导心肌细胞EMRE表达升高（mRNA及蛋白水平）;EMRE促进了HGHF诱导的心肌细胞凋亡及ROS的产生;用si-RNA干涉EMRE表达后,由HGHF诱导的细胞凋亡及ROS产生明显减少。结论 EMRE在HGHF诱导的心肌细胞凋亡中发挥重要的促进作用。     

基于iPSC诱导分化具有电生理活动心肌细胞方法的研究

目的:通过诱导多潜能干细胞i PSC体外定向分化为心肌细胞的方法,已经成为干细胞和心血管领域研究的有效工具,也为临床治疗带来新希望。本文依据胚胎发育的分子调控机制,探索建立体外定向分化心肌的方法。方法:使用干细胞培养基培养i PSCs生长至80%,换成含6μmol/L Chir99021和25μg/L Activin A的基础培养基培养48h,基础培养基为含有2%的B27、64μg/L l-ascorbic acid2-phosphate的RPMI 1640培养基,换为含2μM Wnt-C59的WNT信号抑制剂培养基培养48h,最后换为维持培养基继续培养,每两天换液,约第8天可见心肌开始搏动。结果:i PSC在向成熟心肌分化时,显微镜下可观察到明显的肌丝肌节结构,具有心肌特异性标志物TNNT 2,MLC 2a的强阳性表达,并表现出自发跳动的电生理活动。结论:该方法可以成功诱导i PSC高效分化为具有电生理功能的心肌细胞。     

成熟心肌细胞的培养技术

成熟心肌细胞的培养 ,首先要成功地无菌分离成熟的心肌细胞 ,这比单纯地分离成熟心肌细胞或单纯地培养胚胎期和新生期心肌细胞较困难。一般可作典型的L angandorff装置 ,配合无菌操作要求来得到用于培养的无菌成熟心肌细胞。实验动物等都经消毒灭菌 ,分离仪器保存在分层的通风橱中 ,以免在分离过程上空气传播的污染物污染溶液。其它预防污染的方法有 :1用 70 %酒精彻底清洗分离装置 ,用无菌去离子水冲洗 ,在心脏灌流之前至少要进行两次冲洗 ;2在即将开始分离之前 ,对易于拆卸的装置进行灭菌 ,然后重新装好。分离用灌流液、酶液、保存液及培…     

特定培养基中溶组织内阿米巴的附着与短期保持动力和活力

溶组织内阿米巴以其附着、伸展和运动为基本特性,这些特性在致病过程中是重要的,为了研究这些特性,确定其最低的生理要求,因而作此体外培养观察。实验用的虫株有溶组织内阿米巴的HM-1株、200:NIH株和HK-9株。作者设计一种保存培养基(MM-1培养基)以保持     

骨髓间充质干细胞对多柔比星致心肌细胞凋亡的影响及机制

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对多柔比星(DOX)致心肌细胞凋亡的影响,并探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)、Caspase-9在其中的作用。方法取原代培养的大鼠心肌细胞,设3组。A组用含2μmol/L DOX的DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清)处理4 h后,更换为正常培养基;B组用含2μmol/L DOX的DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清)处理4 h后,更换为正常培养基,并插入接种有MSCs的Millicell装置,共培养48 h;C组用含2μmol/L DOX的DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清)处理4 h后,更换为含50 nmol/L TGF-β1受体特异性抑制剂LY364947的DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清),并插入接种有MSCs的Millicell装置,共培养48 h。用ELISA法检测各组心肌细胞培养液上清液中的TGF-β1,用流式细胞术AnnexinⅤ/PI双染法检测各组心肌细胞凋亡率,Western blot法检测各组心肌细胞Caspase-9蛋白表达。结果实验结束时心肌细胞凋亡率和Caspase-9表达量A组>B组>C组,P均<0.05。心肌细胞培养液上清液TGF-β1水平B组高于A、C组,P均<0.05;A、C组心肌细胞培养液上清液TGF-β1水平差异无统计学意义。结论 MSCs共培养可抑制DOX引起的心肌细胞凋亡,其机制可能与Caspase-9有关。MSCs旁分泌的细胞因子TGF-β1对DOX诱导的心肌细胞凋亡起促进作用。     

硒,锰在培养大鼠心肌细胞上的抗氧化损伤作用

向培养基中加入黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XOD),诱发超氧阴离子自由基,造成心肌细胞的自由基损伤:心肌细胞的自由基含量增高;动作电位及膜输入阻抗呈膜损伤性表现;超微结构呈现以肌丝、线粒体损伤为主的克山病样病理改变。向培养基中添加硒、锰,能对抗X-XOD所致的氧化性损伤。     

源于右室流出道的室性心律失常的电生理机制研究

目的探讨右室流出道(RVOT)室性心律失常的发生机制。方法采用全细胞膜片钳技术记录RVOT和右室(RV)心肌细胞的动作电位及离子流,对比分析动作电位及离子流的特性。结果RVOT心肌细胞动作电位表现出复极离散度较RV大。在单细胞电流的记录中,RVOT心肌细胞的瞬时外向钾电流离散度较RV心肌细胞大。在稳态电流中,RVOT心肌细胞的非特异性阳离子流(NSCC)小于RV心肌细胞的NSCC,甚至某些RVOT心肌细胞缺乏NSCC,与之对应的是心肌细胞较长的动作电位时程(APD)并记录到早期后除极(EAD)。当激活NSCC后,可使RVOT心肌细胞较长的APD缩短。激活的NSCC可以消除在RVOT记录到的EAD。结论RVOT心肌细胞的复极离散度和APD的离散大,此易导致折返性心律失常的发生。NSCC较小或缺如是RVOT心肌细胞APD延长,并且产生EAD的原因。     

心肌细胞裂解成分诱导骨髓间充质干细胞分化的超微结构观察

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在心肌细胞裂解成分作用下超微结构改变,了解心肌细胞裂解成分对MSCs分化的诱导作用。 方法:分离并裂解新生大鼠的心肌细胞;自成年大鼠骨髓中分离MSCs;将分离的MSCs分3组培养:仅用普通培养基培养(对照组);5-氮杂胞苷(5-aza)诱导后用普通培养基培养(5-aza诱导组);含有心肌细胞裂解成分的培养基培养(心肌细胞裂解成分培养组)。培养1周,观察细胞形态及超微结构的改变,对培养的细胞进行抗心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)及抗分化决定簇31(CD31)细胞免疫化学染色,并分析各组细胞的增殖情况。 结果:对照组MSCs无明显的肌样细胞或内皮样细胞形成,抗cTnT和抗CD31染色阴性。5-aza诱导组部分MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见大量细胞器空化,抗cTnT染色阳性,但细胞增殖缓慢。心肌细胞裂解成分培养组的MSCs分化为肌样细胞,电镜下可见肌丝样结构,抗cTnT染色阳性,细胞增殖旺盛,另见部分MSCs分化为内皮样细胞,形成内皮细胞特有的胞质突起和质膜小泡等超微结构,且抗CD31染色阳性。 结论:含有心肌细胞裂解成分的培养基可以诱导MSCs向心肌样细胞和内皮样细胞方向分化。     

大鼠心肌冷冻疤痕中胚胎心肌细胞移植物的观察

目的：观察胚胎心肌细胞移植物在大鼠冷冻心肌疤痕中存活的可行性。方法：以冷冻损伤造成１６只大鼠左室游离壁心肌疤痕。于损伤后１０天，将培养的胚胎心肌细胞或培养基注入心股疤痕组织，５只动物冷冻后２０天处死（疤痕对照组），细胞移植组织７只，培养基对照组４只，移植后１０天死动物，取出心脏。结果：疤痕组和培养基对照组动物左室壁损伤局部组织变薄，细胞移植组室壁依然厚实。横纹肌α＾－肌动蛋白免疫组化染色证实，细胞     

心肌细胞电活动的离子流基础

心肌细胞电活动是心肌电生理特性——自动节律性、兴奋性和传导性的基础。这些特性的改变往往是心律失常重要的发病机理,因此心肌细胞电活动成为基础和临床医学工作者共同关心的课题之一。本文拟从离子流的角度,对心肌细胞电活动近年来的研究进展作一个简要的回顾。一、研究技术的进展从五十年代开始用细胞内微电极记录心肌细胞电活动以来,在研究技术上的进展大致可以分成四个阶段。1.常规细胞内微电极阶段从五十年代开始,采用尖端小于1μm的玻管微电极插入心肌细胞内记录跨膜电位。玻管内灌以3M KCl溶液,经Ag-AgCl电极、微电极放大器引导到示波器,进行观察和摄影记录。采用本技术可以观察心肌细胞跨膜电位在安静、兴奋和起搏过程中的电位变化(静息电位、动作电位和起搏电位)。     

新生自发性高血压大鼠心肌细胞与成纤维细胞的相互作用

为研究自发性高血压大鼠心肌细胞与成纤维细胞在体外培养下的相互作用。收集上述细胞的24h培养上清液作为这两种细胞的条件培养基，观察血管紧张素Ⅱ 1型受体拮抗剂洛沙坦或酪氨酸蛋白抑制剂金雀异黄素对细胞^3H-TdR和^3H-Leu掺入率的影响。结果发现，心肌成纤维细胞培养基可明显促进这两种细胞的生长，该作用不能被洛沙坦抑制，而可被金雀异黄素抑制。心肌细胞培养基无促进这两种细胞生长作用。结果提示，成纤维细胞可能分泌经酪氨酸蛋白激酶介导的促生长因子，调控心肌细胞和心肌成纤维细胞的生长。     

门冬氨酸钾镁减轻阿霉素性心肌损害的实验研究

<正> 心肌损害是阿霉素的主要副作用。我们分别采用体外心肌细胞培养和在体动物模型,观察门冬氨酸钾镁对阿霉素性心肌损伤的影响。以2～3天龄Wistas大鼠的心肌细胞为原料,取培养三天的心肌细胞19瓶,随机分成阿霉素组(n=10)和门冬氨酸钾镁加阿霉素组(n=9)(门冬氨酸钾镁系上海海普药厂产品,含钾10mg/ml,镁4mg/ml)。经阿霉素1mg/L、40mg/L的无血清含药培养基培养4小时后,用日立A220型双光束紫外分光光度计测定二组培养基中反映心肌细胞损伤程     

辛伐他汀对高浓度葡萄糖诱导心肌细胞炎症反应的干预作用及机制研究

目的 （1）观察高浓度葡萄糖对心肌细胞的作用,探讨高浓度葡萄糖损伤心肌的可能机制;（2）观察辛伐他汀对高浓度葡萄糖刺激下心肌细胞炎症因子表达的影响,并探讨其可能机制。方法 （1）取SD乳鼠心肌细胞做原代培养。（2）阴性对照组（blank）:培养基中不加任何刺激物,培养72小时。（3）阳性对照组（positive control）:培养基中加入终浓度为25 mmol/L的高浓度葡萄糖刺激乳鼠心肌细胞,培养72小时。（4）甲羟戊酸对照组（MVA）:培养基中加入终浓度为25 mmol/L的高浓度葡萄糖和终浓度为200 umol/L的甲羟戊酸,培养72小时。（5）辛伐他汀干预组（Sim）:培养基内加入终浓度为25 mmol/L的高浓度葡萄糖,同时分为三组并分别加入浓度为10^-5 mol/L、10^-6mol/L、10^-7mol/L辛伐他汀培养72小时。（6）辛伐他汀+甲羟戊酸干预组（Sim+MVA）:培养基中加入终浓度为25mmol/L的高浓度葡萄糖,终浓度为10-5 mol/L的辛伐他汀和终浓度为200 umol/L的甲羟戊酸,培养72小时。（7）收集各组心肌细胞培养基上清液,用ELISA法测各组TNF-α、ICAM-1、MCP-1的表达;收集各组心肌细胞,用MTT法测定心肌细胞活力,RT-PCR法测心肌细胞AT1RmRNA、AT2R mRNA表达。结果 （1）与空白对照组比较,阳性对照组、MVA组心肌细胞活力显著下降（P<0.01）,TNF-α、ICAM-1、MCP-1表达均明显增加（P<0.01）。（2）与阳性对照组比较,辛伐他汀组心肌细胞活力明显提高（P<0.01）,TNF-oα、ICAM-1、MCP-1表达明显降低（P<0.05或P<0.01）,且呈浓度依赖性;加入甲羟戊酸后（Sim+MVA组）,上述指标与阳性对照组比较无统计学差异。（3）与阳性对照组比较,辛伐他汀组[Sim(10^-5mol/L)组和Sim(10^-6mol/L)组]心肌细胞AT1R mRNA表达显著降低（P<0.05）,AT2R mRNA表达轻度增加（P<0.05）。（4）AT1RmRNA表达与TNF-α表达呈正相?