羟基喜树碱对人肝癌细胞增殖影响及凋亡诱导

目的 探讨羟基喜树碱对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响及其诱导凋亡的作用。方法 以不同浓度的羟基喜树碱在体外作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用MTT法检测细胞增殖;化学荧光法检测Bcl-2的细胞表达;电镜观察、流式细胞仪与原位末端标记方法检测细胞凋亡情况。结果 与空白对照组比较,羟基喜树碱浓度在3.125μg/mL～100μg/mL组,对肿瘤细胞的增殖抑制率显著增高(P<0.01);在0.05mg/mL组出现细胞早期凋亡现象,Bcl-2表达明显减少;在0.1mg/mL组形成凋亡小体;细胞凋亡比例随羟基喜树碱浓度增加而增高。结论 羟基喜树碱在体外可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖,其作用机制可能系通过抑制Bcl-2表达诱导细胞凋亡。     

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后线粒体蛋白质组表达差异的定量分析

目的 对羟基喜树碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡前后的线粒体进行定量蛋白质组学研究.方法 用羟基喜树碱诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡,提取线粒体并鉴定其纯度;用可裂解的同位素标记的亲和标签技术标记线粒体蛋白质,利用二维液相色谱串联质谱分析鉴定蛋白质.结果 获得了羟基喜树碱诱导细胞凋亡前后的高纯度线粒体;分析鉴定了细胞凋亡前后,相对表达量差异有统计学意义的蛋白质74种,其中42种线粒体蛋白质在细胞凋亡后的表达量下调,32种蛋白质的表达量在凋亡细胞中上调.这些差异蛋白的分子功能主要表现为能量代谢和核酸的翻译、转录、复制以及细胞骨架等.结论 获得了羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体差异蛋白信息,将促进对癌细胞凋亡机制及羟基喜树碱药理作用的深入理解,同时,实验所采用的整合技术平台将有助于亚细胞定量蛋白质组学研究.     

survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响.方法 人工合成survivin基因ASODN和正义ODN(SODN),并行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径转染SMMC-7721;分别用RT-PCR和Western blot检测survivin mRNA和蛋白表达;用MTT法检测ASODN对SMMC-7721增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形态变化.结果 SMMC-7721可强表达survivin mRNA和蛋白;ASODN呈浓度依赖性抑制survivin mRNA和蛋白表达及SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期.SODN对survivin mRNA和蛋白及SMMC-7721的增殖、细胞周期无明显抑制作用.结论 脂质体介导转染survivin ASODN可抑制细胞增殖、使细胞阻滞于G2/M期,从而促进细胞凋亡.     

熊果酸诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的：观察熊果酸（UA）对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制及诱导其凋亡作用。方法：MTT法检测5、10、20、30、40、50μmol/L UA对SMMC-7721细胞生长的抑制作用,吖啶橙（AO）荧光染色、电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：UA能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性。35.2μmol/L UA作用SMMC-7721细胞48小时后AO染色,荧光显微镜下可见细胞出现体积缩小,核碎裂,染色质凝集等凋亡形态改变;电镜下SMMC-7721细胞出现明显的细胞凋亡的形态学改变,细胞核染色质出现边聚和中聚,细胞内部分线粒体肿胀;SMMC-7721细胞凋亡率为（67.91±5.24）%,与对照组（2.95±0.56）%比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：UA通过诱导SMMC-7721细胞凋亡抑制其生长。     

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞线粒体跨膜电位耗散的蛋白质组分析

目的比较蛋白质组,分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质表达谱。方法用羟基喜树碱诱导肝癌SMMC-7721细胞发生线粒体跨膜电位耗散,提取线粒体并用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定；用二维凝胶电泳分离溶解度不同的3种蛋白质组分并对蛋白质进行银染色；利用PDQuest图像分析软件分析比较凝胶结果,获得差异蛋白质；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western blot法对部分差异蛋白质进行进一步的鉴定。结果羟基喜树碱成功地诱导线粒体发生跨膜电位耗散,并获得纯度很高的线粒体；通过PDQuest图像分析软件发现,线粒体发生跨膜电位耗散前后比较约有39个蛋白质点表达有差异,对其中28个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出20种可能的蛋白质。结论获得了羟基喜树碱诱导线粒体凋亡前后差异蛋白的相关信息,为从蛋白质水平进一步研究羟基喜树碱诱导癌细胞发生凋亡的机制奠定了基础。     

人颗粒溶素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位及细胞色素C释放的影响

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并研究其表达后对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位与细胞色素C转位的影响. 方法 将RT PCR扩增出的人GLS编码基因克隆入pBudCE4.1载体中构建真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并将其转染肝癌细胞株SMMC-7721,用RT-PCR、免疫细胞化学检测GLS的表达;用Hoechst法及电镜检测细胞的凋亡状况;用荧光染料MitocaptureTM检测线粒体跨膜电位,用Western blot法检测细胞色素C从线粒体的释放. 结果 成功构建了携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS,在转染的肝癌细胞株SMMC-7721中,从转录和翻译水半都检测到了目标基因GLS的表达产物;重组质粒转染SMMC-7721细胞后,细胞核染色质固缩,旱致密浓染的凋亡状态,线粒体膜跨电位下降并伴随有细胞色素C从线粒体至细胞质的释放. 结论携带人GLS的真核表达质粒在肝癌细胞SMMC-7721中表达后有致细胞凋亡作用,引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一.     

金雀异黄素诱导人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的 探讨金雀异黄素(Genistein,Gen)对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡调控的作用.方法将Gen分为5.0、10.0、20.0 μg/ml 三个浓度处理组和对照组(未加金雀异黄素),作用SMMC-7721细胞不同时间后,透射电镜观察细胞超微结构变化;免疫组化法检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白的表达水平.结果 与对照组比较,Gen处理组可使细胞核内异染色质呈块状凝集、胞质内线粒体肿胀空化,随着作用浓度增加,细胞核呈固缩状,核内异染色质趋边凝集,细胞质空化明显;免疫组化显示,随着Gen浓度增加,Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,并呈剂量依赖性(P＜0.01).结论 金雀异黄素可以诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡.上调Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达可能是其诱导细胞凋亡的作用机制.     

三氧化二砷诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及对OPN表达的影响

目的探讨三氧化二砷（As2O3）治疗肝癌的可行性及机制。方法将一定浓度梯度的As2O3与人肝癌细胞株SMMC-7721孵育后,采用MTT法、荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡变化,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝癌细胞株中骨桥蛋白基因（OPN mRNA）表达水平。结果As2O3作用后SMMC-7721细胞生长明显受抑,且呈时间-浓度依赖性;荧光显微镜下细胞呈典型的凋亡形态学改变;在流式细胞仪上可见“凋亡峰”,细胞周期阻滞于G2／M期;细胞OPN mRNA表达阳性,OPN mRNA表达水平明显下调。结论As2O3体外能有效抑制肝癌细胞株生长;其机制可能为诱导细胞凋亡、下调OPN mRNA表达。     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

目的 研究X-染色体相关凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）对肝癌细胞增殖和凋亡的影凋亡响。方法 构建正义pcDNA3-XAF1和反义pcDNA3-XAF1-AS质粒，通过脂质体转染技术将质粒DNA转入SMMC7721肝癌细胞株并建立稳定高表达XAF1的肝癌细胞克隆。应用MTT、流式细胞仪、TUNEL法检测肝癌细胞的增殖和凋亡；应用RT-PCR和Western印迹法检测基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果 XAF1在SMMC7721肝癌细胞株中有表达，但低于正常肝脏细胞水平。稳定高表达XAF1基因可抑制肝癌细胞的增殖和诱导，并能增加其对化疗药物5-氟尿嘧啶和羟基喜树碱的敏感性。结论 XAF1能抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

奥曲肽诱导人肝癌细胞凋亡的研究

应用光镜、电镜及Western blot法系统地观察了1μg/ml奥曲肽对有人肝癌细胞株SMMC－7721的形态及其内Caspase-3的表达的影响。结果发现奥曲肽能引起SMMC－7721细胞形态改变,出现核浓缩、线粒体空泡化、微绒毛减少等变化,而且能促进Caspase-3的表达并使其激活,从而诱导肝癌细胞凋亡。     

全反式维甲酸联合奥沙利铂对人SMMC-7721肝癌细胞株的作用

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)联合奥沙利铂(L-OHP)对人SMMC-7721肝癌细胞增殖及凋亡的影响.方法:选用ATRA(10-5mol/L)及不同浓度的L-OHP(10mg/L、20mg/L、40mg/L),并选用10-5mol/L的ATRA分别联合L-OHP(10mg/L、20mg/L、40mg/L)作用于SMMC-7721肝癌细胞24h、48h、72h;采用MTT比色法观察其对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用,倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用流式细胞术分析药物作用48h时SMMC-7721细胞的周期分布和凋亡的情况.结果:ATRA及不同浓度L-OHP单药及联合均可显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长,细胞形态改变,凋亡比例增加,并呈剂量-时间依赖性;两药联合较单药相比作用明显增强(P<0.01);ATRA联合20mg/LL-OHP与ATRA联合40mg/LL-OHP相比,作用细胞48h及72h时,对细胞生长抑制作用无统计学差异;两药联合较单药相比,细胞凋亡率明显增加,细胞阻滞S期增强(P<0.01).结论:ATRA可抑制肝癌SMMC-7721细胞的生长并诱导细胞凋亡,与L-OHP联用后作用增强并可减少奥沙利铂用量,具有协同作用.     

肿瘤坏死因子相关配体与阿司匹林合用对肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的 观察肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与阿司匹林合用对肝癌SMMC-772l细胞的作用。方法 氨甲喋呤法检测SMMC-772l细胞存活分数；流式细胞仪检测SMMC-772l细胞的凋亡率和细胞周期；WesternBlot法检测凋亡相关基因的表达。结果 单用300ng／ml TRAIL、3、10mmol／L阿司匹林SMMC-772l细胞存活分数分别为82．76％、81．34％和71．29％，合用的存活分数分别为43．5％、37．8％。3、l0mmol／L阿司匹林与300ng／ml TRAIL合用诱导的细胞凋亡率明显大于单用两药诱导的细胞凋亡率之和(单用300ng／ml TRAIL、3mmol／L和10mmol／L阿司匹林凋亡率分别为21．25％、1．89％和6．08％，合用的凋亡率分别34．76％，38．56％)并使G0/Gl期细胞增加l3、10mmol／L的阿司匹林使SMMC-772l细胞Bcl-2的表达明显减弱，但对Bax的表达无影响。结论 TRAlL与阿司匹林合用对肝癌SMMC-772l细胞有明显的协同杀伤作用，其机制可能与阿司匹林抑制Bcl-2的表达有关。     

Mitochondria to nucleus translocation of AIF in mice lacking Hsp70 during ischemia/reperfusion

Heat shock protein 70 (Hsp70) has been shown to have an anti-apoptotic function, but its mechanism is not clear in heart. In this study, we examined the effect of Hsp70 deletion on AIF-induced apoptosis during ischemia/reperfusion (I/R) in vivo. Although Hsp70 KO and WT mice demonstrated similar amounts of AIF released from mitochondria after I/R surgery, Hsp70 KO mice showed a significantly greater increase in apoptosis, larger infarct size, and decreased cardiac output. There was also a significant fourfold increase in the nuclear accumulation of AIF in Hsp70 KO mice compared with WT mice. Treatment with 4-AN (4-amino-1,8-napthalimide, 3 mg/kg), a potent inhibitor of PARP-1, which is a critical regulator of AIF-induced apoptosis, significantly blocked the release of AIF from mitochondria and the translocation of AIF into the nuclei after I/R in both WT and Hsp70 KO mice. In addition, 4-AN treatment resulted in a significant inhibition of apoptosis, a reduction of infarct size, and attenuated cardiac dysfunction in both WT and Hsp70 KO mice after I/R. The anti-apoptotic function of Hsp70 occurs through the inhibition of AIF-induced apoptosis by blocking the mitochondria to nucleus translocation of AIF. PARP-1 inhibition improves cardiac function by blocking AIF-induced apoptosis.     

腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)的表达与肝癌的关系,并构建表达人COX-2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组织化学法探讨34例肝癌组织COX-2 的表达与肝癌病理特征的关系。采用基因重组法把人COX-2的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码COX-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2。经聚合酶链反应法鉴定为阳性克隆者大量扩增、纯化,转染人肝癌细胞株SMMC-7402和SMMC-7721,采用免疫细胞化学、细胞集落形成率及流式细胞术检测其对肝癌细胞生长、凋亡及细胞周期分布的影响。结果34例肝癌组织中有28例COX-2高度表达,阳性率达82.4%; COX-2的表达水平与肝癌的病理分级有关,与甲胎蛋白、细胞类型、有无肝内转移无关。成功构建、扩增、纯化得到编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度达1.06×1012PFU/ml;Ad-AShcox- 2转染两种肝癌细胞株后,发现高度表达COX-2的SMMC-7402 COX-2表达水平明显降低,细胞凋亡率明显增加,出现G1期阻滞,与Ad-LacZ组及空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而不表达COX- 2的SMMC-7721变化不明显。细胞集落形成实验显示SMMC-7402细胞集落形成率较低(2.7%±0.94%); 而SMMC-7721     

人端粒酶逆转录酶干扰对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰对肝癌．HepG2、SMMC-7221细胞生物学形为的影响和对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡的影响。方法将HepG2细胞和SMMC-7721细胞分为转染组 (转染重组质粒真核表达载体)、对照组(转染空载体质粒)和未转染组。采用聚合酶链反应方法检测hTERT干扰序列, 逆转录聚合酶链反应方法检测hTERT表达,HE染色、生长曲线和流式细胞术方法分别检测细胞形态、增殖情况和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色方法检测细胞状态,Armexin V／PI染色流式细胞术检测细胞凋亡。结果转染组细胞内均存在hTERT干扰序列,HepG2和SMMC 7221细胞hTERT干扰率分别为100％和43．3％;与未转染组细胞相比, 转染细胞核质比明显缩小,增殖率下降差异有统计学意义(P<0．05),老化细胞和G2-M期细胞明显增加(P<0．05)。细胞老化率分别由未转染组的0增加到转染组的20．4％,由3．60%,增加到10．O％;G2-M期分别由未转染组的7．1％、6．9％增加到转染组的10．6％、7．9％。hTERT干扰显著增加肝癌细胞凋亡和TRAIL诱导凋亡敏感性(P<0．05)。两株肝癌细胞凋亡率分别由未转染组的3．5％、4．8％增至转染组的5．2%、7．9％;100 ng／ml TRAIL作用24 h后两株肝癌细胞凋亡率分别由未转染组的5．3％、13．9％增加到转染组的10．4％、77．2％,而对照组细胞各指标均无显著变化。结论 hTERT干扰明显影响肝癌细胞的生物学行为,显著增加细胞凋亡和TRAIL诱导凋亡的敏感性。     

三氧化二砷对肝癌细胞表达PTTG1和VEGF的影响及其意义

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对人肝癌细胞株BEL-7402和SMMC-7721的作用及其可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测As2O3对两种细胞的生长活性;用流式细胞仪测定经不同浓度As2O3溶液处理后的两种细胞的周期变化,并用Annexin V-FITC与PI双染法检测细胞凋亡;用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测As2O3对两种细胞垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响;用蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测As2O3对两种细胞PTTG1和VEGF蛋白表达的影响.结果 As2O3可显著抑制BEL-7402和SMMC-7721细胞的生长,并呈量效关系(r=0.973,P<0.01;r=0.985,P<0.01),半数抑制浓度(IC50)分别为4.38 μmol/L和5.16 μmol/L.BEL-7402和SMMC-7721经As2O3处理后均发生显著凋亡(P<0.01).As2O3能显著下调两种细胞PTTG1和VEGF mRNA及蛋白的表达(P<0.01),并使细胞周期阻滞在G2/M期.结论 As2O3可有效抑制人肝癌细胞的生长增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期及下调PTTG1和VEGF的表达有关.     

Subcellular daunorubicin distribution and its relation to multidrug resistance phenotype in drug—resistant cell line SMMC—7721／R

AIM：To investigate the correlation between subcellular daunorubicin distribution and the multidrug resistance phenotype in drug-resistant cell line SMMC-7721/R.METHODS:The multidrug resistant cell line SMMC-7721/R,a human hepatocellular carcinoma cell line,was established.Antisenes oligonucleotides(AS-ODN)were used to obtain different multidrug resistance phenotypes by inhibiting the expression of mdr1 gene and/or multidrug resistance-related protein gene(mrp)using Lipofectamine as delivery agent.Expression of mdr1 and mrp genes was evaluated by RT-PCRand Western blotting.Intracellular daunorubicn(DNR)concentration was measured by flow cytometry.Subcellular DNR distribution was analyzed by confocal laser scanning microscopy.Adriamycin(ADM)and DNR sensitivity was examined by MTTmethod.RESULTS:Low level expression of mdr1 and mrpmRNAs and no expression of P-Glycoprotein(P-gp)and multidrug resistance-related protein(P190)were detected in parental sensitive cells SMMC-7721/S,but over-expression of these two genes was observed in drug-resistant cell SMMC-7721/R,The expression of mdr1 and mrp genes in SMMC-7721/Rcells was down-regulated to the level in the SMMC-7721/Scells by AS-ODN.Intracellular DNAconcentration in SMMC-7721/Scells was 10times higher than that in SMMC-7721/Rcells.In SMMC7721/Scells intracellular DNA distributed evenly in the nucleus and cytoplasm.while in SMMC-7721/Rcells DNR distributed in a punctate pattern in the cytoplasm and was reduced in the nucleus.DNR concentration in SMMC-7721/Rcells co-transfected with AS-ODNs targeting to mdr1and rpmRNAs recovered to 25percent of that in SMMC7721/Scells.Intracellular DNA distribution pattern in drug-resistant cells treated by AS-ODN was similar to drug-sensitive cell.and the cells resistance index(RI)to DNA and AMD decreased at most from 88.0and 116.0to4.0and 2.3,repectively.Co-Transfection of two AS-ODNs showed a stronger synergistic effect than separate transfection.CONCLUSIONS:P-gp and P190are two members mediatingMDR in cellline SMMC7721/R,Intracellular drug concentration increase and subcellular distribution change are two important factos in multidrug resistance(MDR)formation.The second facto,drugs transport by P-gp andP190from cell nucleus to organell in cytoplasm,may play a more important role.     

生存素反义核酸诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和增加其对抗肿瘤药物敏感性的研究

背景：生存素是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，生存素基因有可能成为肿瘤反义基因治疗的理想靶基因。目的：研究生存素反义核酸诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡和增加其对常用抗肿瘤药物敏感性的作用，探讨生存素反义核酸用于肿瘤基因治疗的可能性。方法：应用基因重组技术构建pEGFP-C1-生存素反义核酸重组质粒，以脂质体转染法转染SMMC．7721细胞，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测生存素mRNA的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。将生存素反义核酸分别与7种常用抗肿瘤药物共同作用于SMMC-7721细胞，用四唑蓝(MTT)比色法测定细胞杀伤率。结果：生存素反义核酸可抑制SMMC-7721细胞中生存素mRNA的表达，从而导致细胞凋亡增加，其作用呈剂量依赖性。生存素反义核酸可增加SMMC-7721细胞对7种常用抗肿瘤药物的敏感性，明显增强药物的杀伤作用。结论：生存素反义核酸能靶向抑制野生型生存素基因的表达，提高肝癌细胞对常用抗肿瘤药物的敏感性，有可能成为肿瘤基因治疗的新方法。