抗口蹄疫蛋白疫苗与DNA疫苗混合物的免疫原性研究

目的 研究抗口蹄疫蛋白及DNA疫苗混合物免疫原性。方法 以O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1免疫活性肽基因串连片段取代猪IgG H链基因可变区的CDR3区构成融合基因。然后分别与原核表达载体pET28b及真核表达载体pCDM－8构建抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗PCDM－FH。用蛋白疫苗pET28b-FH和DNA疫苗pCDM-FH及其混合物免疫猪后,用攻毒实验检测其效果。结果 攻毒后,抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单猪免疫能分别使猪发病推迟10天和1天,症状减轻;而混合疫苗免疫效果比阴性对照好而不及这两个疫苗单独免疫效果。结论 抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单独免疫能使猪发病推迟,症状减轻,而混合疫苗免疫效果较差,免疫方法仍需改进。     

preS2S/adw真核表达质粒构建及其表达的初步研究

目的：针对我国乙型肝炎（乙肝）病毒流行的血清型，采用美国药品及食物鉴定委员会承认的应用于疫苗临床使用的载体pVAX1，构建了肝病毒adw血清型核酸疫苗preS2S的真核表达质粒，对其在真核细胞中的表达进行初步研究。方法：采用PCR法扩增preS2S片段，插入pVAX1载体中，测定DNA序列后，转染SP2／0细胞，抽提转染后SP2／0细胞的总RNA，再用RT－PCR法扩增其中的preS2S片段，以检测其表达的基础，结果：测序证实了该片段为乙肝病毒adw型preS2S基因。PCR扩增法检测出的转染细胞中存在preS2S基因，结论：获得了adw血清型乙肝病毒preS2S的真核表达质粒，提示其能够在真核细胞中表达目的基因蛋白。     

SARS病毒Spike蛋白重组腺病毒疫苗的构建及其免疫学分析

目的构建基于sARS病毒Spike（S）蛋白的重组腺病毒,并对该重组腺病毒进行初步鉴定和免疫学探讨。方法通过全基因合成得到全长S蛋白基因,利用Ad5腺病毒系统构建S蛋白基因的重组腺病毒,采用间接免疫荧光（IFA）试验和蛋白免疫印迹法（Western blot）对S蛋白的表达进行鉴定,再用重组腺病毒免疫小鼠,观察小鼠抗体诱生情况,从而对该重组腺病毒的免疫效果进行初步评价。结果PCR扩增重组腺病毒质粒外源片段,大小为800bp,与预期值一致;Western blot和IFA结果表明,重组腺病毒（rAd-S）表达S蛋白能被马抗SARS血清识别;ELISA检测结果显示,rAd-S能刺激小鼠机体产生抗体。结论重组腺病毒系统成功表达了SARS病毒S蛋白,免疫小鼠产生S蛋白特异的抗体。     

人用狂犬病疫苗和被动免疫制剂研发进展

狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(Rabies virus)引起的一种人兽共患病。人一旦发病致死率几乎100%。目前预防狂犬病的人用疫苗为狂犬病毒灭活疫苗。随着基因工程技术的进步,新一代以狂犬病毒G蛋白(Glycoprotein)为免疫原的疫苗在开发中,包括不同表达系统的G蛋白亚单位疫苗,G蛋白DNA疫苗,G蛋白病毒载体疫苗等。同时本文还探讨了未来可能取代狂犬病免疫球蛋白的被动免疫制剂(单克隆抗体)的研发进展。     

2型猪链球菌层粘连蛋白结合蛋白的原核表达及免疫原性检测

目的表达2型猪链球菌（Streptococcus suis2,S.suis2）层粘连蛋白结合蛋白（Lmb）并检测其免疫原性。方法 PCR检测lmb基因在不同血清型S.suis中的分布。将S.suis2中国强毒株05ZYH33的lmb基因克隆至表达载体pET32a,转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导表达,His亲和层析柱纯化重组蛋白。Western blot检测Lmb的免疫原性。结果 lmb基因存在于大多数S.suis血清型中。诱导表达并纯化后获得较高纯度的重组蛋白。重组Lmb能够和感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应。结论 lmb基因在S.suis不同血清型中广泛分布,Lmb在细菌感染宿主过程中表达,可以作为疫苗开发的候选分子。     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S，作为一种高效能HBDNA疫苗的备选对象。方法：以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV—S2S基因片段，克隆至相应载体。再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段，并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAXl，然后扩增目的基因测序，确认无误后，转染SP2／0细胞，并分别检测目的基因mRNA，了解其短暂表达与稳定表达情况。结果：所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符，目的片断IFNα-8-S1S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符。HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变。2处有义突变是703～705位CCG突变为CAG，799～801位ATA突变为ATG。表达质粒转染SP2／0细胞后，均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA。结论；经分析表明，HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质。可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S的构建，并成功检测到目的基因的表达，为制造高效能HBDNA疫苗提供了新的备选对象。     

国产新冠病毒灭活疫苗接种16问(下)

接种新冠疫苗后,进行鼻咽拭子新冠病毒核酸检测时会不会变阳性?回答这个问题前,我们首先要明白核酸检测具体检测的是什么。接种疫苗后再检测,阳性还是阴性,新冠病毒入侵人体后,首先在呼吸道黏膜细胞内繁殖,因此,目前的新冠病毒核酸检测,一般都是在呼吸道的鼻咽部收集样本,即鼻咽拭子检测。     

不同疟区恶性疟原虫地理株谷氨酸富有蛋白基因R2区序列分析及分型

[目的 ]测定云南与海南两省不同疟区恶性疟原虫分离株谷氨酸富有蛋白 (GLURP)基因的部分序列及了解其分型。[方法 ]采用套式PCR方法特异性扩增GLURP基因R2区片段 ,并将该基因片段克隆于T载体 ,用双脱氧末端终止法测定不同长度的阳性克隆核苷酸序列 ,并应用DNAStar软件对云南与海南两省分离株GLURP基因及蛋白序列进行比较和分析。[结果 ]首次发现云南与海南两省恶性疟原虫至少存有 7个大小不同的GLURP等位基因型虫株 ,其基因片段变化范围为 6 0 0～ 15 0 0bp。不同分离株的GLURP基因R2区具高度保守性 ,其由编码 19～ 2 0个氨基酸的碱基的基本重复单位构成 ,该基因具有长度的多态性 ,表现在碱基基本重复单位的数目不同。序列分析结果表明 ,我国不同分离株之间或同一地区不同株之间GLURP基因及氨基酸序列具有高度的同源性 ,无明显的地理差异。 [结论 ]不同分离株GLURP基因结构的高度保守性及碱基重复片段数目的多态性 ,对研究疫苗候选抗原和建立疟原虫基因分型方法具有一定理论价值。     

新型冠状病毒VSV假病毒的 构建及其感染能力的初步研究

摘要]?目的?在二级生物安全实验室条件下,通过构建新型冠状病毒（新冠病毒）VSV假病毒,研究新冠病毒及其流行变异株的侵入特性。方法?通过购买的新冠病毒（Wuhan-Hu-1株）VSV-luc假病毒构建VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒;利用VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒构建新冠病毒VSV假病毒。通过分子克隆对新冠病毒S基因相应位点进行突变,构建新冠病毒不同变异株的刺突蛋白表达质粒,由此包装出新冠病毒各种变异株假病毒。比较新冠病毒Wuhan-Hu-1株与D614G株、Delta株在不同细胞系中的感染能力。 结果?新冠病毒VSV假病毒构建成功。评价新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株、D614G株、Delta株在4种不同细胞系中侵入情况,与Wuhan-Hu-1株相比,D614G株和Delta株的感染水平均明显增加（P均＜ 0.05）,同时在Calu-3和Caco-2细胞系中,Delta株的感染水平明显强于D614G株（P均＜0.05）。利用模拟细胞-细胞间传播的感染试验发现,Delta株感染HEK-293T细胞与Vero细胞的能力明显高于D614G株（P均＜0.05）。 结论?新冠病毒Delta株的感染能力明显强于Wuhan-Hu-1株和D614G株。VSV假病毒系统能够模拟、替代新冠病毒活病毒在侵入细胞的过程中的生理功能,并且安全可靠、易于量化、应用广泛,在新冠病毒研究领域中能够发挥重要作用　　 摘要]?目的?在二级生物安全实验室条件下,通过构建新型冠状病毒（新冠病毒）VSV假病毒,研究新冠病毒及其流行变异株的侵入特性。方法?通过购买的新冠病毒（Wuhan-Hu-1株）VSV-luc假病毒构建VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒;利用VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒构建新冠病毒VSV假病毒。通过分子克隆对新冠病毒S基因相应位点进行突变,构建新冠病毒不同变异株的刺突蛋白表达质粒,由此包装出新冠病毒各种变异株假病毒。比较新冠病毒Wuhan-Hu-1株与D614G株、Delta株在不同细胞系中的感染能力。 结果?新冠病毒VSV假病毒构建成功。评价新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株、D614G株、Delta株在4种不同细胞系中侵入情况,与Wuhan-Hu-1株相比,D614G株和Delta株的感染水平均明显增加（P均＜ 0.05）,同时在Calu-3和Caco-2细胞系中,Delta株的感染水平明显强于D614G株（P均＜0.05）。利用模拟细胞-细胞间传播的感染试验发现,Delta株感染HEK-293T细胞与Vero细胞的能力明显高于D614G株（P均＜0.05）。 结论?新冠病毒Delta株的感染能力明显强于Wuhan-Hu-1株和D614G株。VSV假病毒系统能够模拟、替代新冠病毒活病毒在侵入细胞的过程中的生理功能,并且安全可靠、易于量化、应用广泛,在新冠病毒研究领域中能够发挥重要作用     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

目的为探索血吸虫病疫苗的新路径,对日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定.方法分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的一cDNA片段(Sj338/24)的开读框序列,在其上下游分别设计引物A和B,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后将该片段重组于pGEM-T中并进行DNA测序鉴定及检索.再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX-6P-1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定.结果该目的基因PCR产物全长共487bp,其开读框由459bp组成,编码153个氨基酸残基组成的多肽.DNA序列同源性分析发现,Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源.重组质料pPEX-6P-1/Sj338能高效融合表达,融合蛋白的分子量为43kDa.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性.结论·Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因,重组蛋白有望成为新的疫苗侯选分子.     

弓形虫p35蛋白的基因克隆及其分子特征

目的 探讨p35蛋白作为一个鉴别急性感染的诊断抗原和疫苗候选的应用价值。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,应用弓形虫EST基因库合成扩增p35基因片段引物,结合5'和3'末端cDNA快速扩增法进行p35基因5'和3'末端cDNA的扩增,TA克隆RT－PCR产物及DNA顺序分析;用蛋白质分析软件解析p35基因编码的氨基酸的亲水性和可能存在的T、B细胞的表位。结果 p35基因含有1537个碱基,编码378个氨基酸,其氨基酸的亲水性区域分布在氨基酸的201到225和301到340号,且含有多个T、B细胞的表位。结论 p35蛋白的C端区有高的亲水性,并含有T、B细胞的表位,显示了p35蛋白应用于诊断和疫苗开发的可行性。     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S,作为一种高效能HB DNA疫苗的备选对象.方法以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV-S2S基因片段,克隆至相应载体.再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段,并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAX1,然后扩增目的基因测序,确认无误后,转染SP2/0细胞,并分别检测目的基因mRNA,了解其短暂表达与稳定表达情况.结果所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符,目的片断IFNα-8-S2S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符.HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变.2处有义突变是703-705位CCG突变为CAG,799～801位ATA突变为ATG.表达质粒转染SP2/0细胞后,均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA.结论经分析表明,HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质.可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S的构建,并成功检测到目的基因的表达,为制造高效能HB DNA疫苗提供了新的备选对象.     

结核病DNA疫苗的研究进展

1990年Wolff等［1］报道，他们在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2个月。经与美国Merek公司联合研究，1993年Ulmer等［2］首先报道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不仅可表达蛋白、刺激机体产生特异性免疫应答，还可保护小鼠抵抗异株流感病毒的攻击。从此，核酸疫苗（nucleicacidvaccine）成为世界瞩目的防治传染病的研究新热点。核酸疫苗包括DNA疫苗和HNA疫苗，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导人机体细胞后，并不与福主染色体整合，而是通…     

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。     

病毒样颗粒疫苗的研究进展

病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有病毒的核酸(DNA/RNA),不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力〔1〕。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装,这为病毒的基础研究(基因治疗、药物治疗等)及疫苗的开发提供了便利条件。由于VLPs没有感染性,作为免疫原…     

弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究

目的 构建弓形虫多基因核酸疫苗, 评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白 （HSP70） 基因片段, 克隆到 pcDNA3?ROP2?p30重组质粒中, 构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠, 检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+ 、 CD8+ , 血清、 脾淋巴细胞培养液中IgG、 IgM、 IgA和IFN?γ、 TNF、 IL?2、 IL?4、 IL?12等, 并进行弓形虫攻击感染实验。结果 应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段, 成功构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70重组体, 其中包含 HSP70 蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫, 实验组小鼠血清抗体滴度高, CD4+ 和 CD8+ 均增殖明显, 组间差异有统计学意义（FCD4+ =45.00, FCD8+ =15.01, P均＜0.01）; 其血清及脾细胞培养液中IFN?γ、 IL?2和IL?12含量均明显升高, 尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示, 实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性, 能产生较好的免疫保护作用。     

汉滩病毒S、M基因部分片段嵌合基因原核载体的构建及表达产物的鉴定

目的　将汉滩病毒核蛋白 (NP)主要抗原位点活性片段与囊膜糖蛋白G2进行融合原核表达及鉴定 ,为该融合蛋白的真核表达及汉滩病毒基因工程疫苗研究打基础。方法　构建了汉滩病毒 76 - 118株M基因G2 片段与S基因 5’端70 0bp片段的嵌合片段原核表达载体pGEX - 4T1-G2 S0 7,诱导表达相应的融合蛋白 ,用Westernblotting和ELISA方法进行鉴定。结果　酶切结果显示成功构建了原核表达载体 pGEX - 4T1-G2 S0 7。IPTG诱导表达 4h后 ,Westernblotting显示诱导出分子量约 10 0kD的含GST的融合蛋白 (GST -G2 N0 7)。ELISA结果表明该融合蛋白与抗汉坦病毒NP特异性McAb有较高的结合活性 (P/N值为 0 71/ 0 0 7) ,与抗汉滩病毒糖蛋白特异性McAb也有较弱的结合活性 (P/N值为 0 2 1/ 0 0 8)。结论　S、M基因拼接方式是成功的 ,能够表达出有活性的汉滩病毒G2 糖蛋白与NP片段的融合蛋白。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

HBsAg基因变异及其意义

HBV复制过程中存在逆转录,容易发生基因变异,表面抗原基因变异可能影响临床诊断、病毒复制以及疫苗效果等。从S基因变异的发生机制、生物学及临床意义等方面讨论研究现状和存在的问题。既往大多数研究仅仅限于S基因片段,将来须要更多地从HBV角度对S基因变异进行研究。     

问号钩体外膜蛋白基因特征分析

目的　钩体病是一种人畜共患的 ,由致病性钩体引起的世界范围内广泛流行的传染病 ,至今仍没有高效、广谱疫苗 ,因此预测和研究钩体外膜蛋白基因结构特征 ,有助于研制新疫苗。方法　使用NCBI/Blast,SwissProt/TrEMBL ,ProDom/Blast,Pfam ,ClustW诠释问号钩体赖型赖株全基因组ORF基因 ,对编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果　获得了可能用于防治钩体病高效疫苗的外膜蛋白的基因特征信息 ,并对OmpL1、LipL36、LipL32、Li pL4 1、Qlp4 2进行了详细分析。 结论　本文通过对钩体外膜蛋白基因预测与功能分析 ,认为OmpL1、LipL36、LipL32、LipL4 1、Qlp4 2可作为疫苗开发的靶基因。