一种简便实用的大鼠Kupffer细胞的分离与鉴定方法

目的：研究一种简便实用的大鼠Kupffer细胞（KCs）的分离与鉴定方法.方法：原位两步灌流法对大鼠肝脏进行冲洗消化;利用Percoll液进行不连续密度梯度离心分离KCs;;选择性贴壁纯化KCs;台盼蓝染色法鉴定细胞存活率;吞噬实验鉴定细胞功能;ED1单克隆抗体免疫荧光细胞化学鉴定KCs;显微镜下观察KCs形态变化.结果：获取的KCs数量为（2.41±0.32）×107/只,其中活细胞数量占（92.3±2.12）％;吞噬实验显示（95.2±2.58）％的细胞内存在碳素颗粒;免疫荧光化学检测证明KCs纯度为（96.3±1.46）％;在显微镜下观察KCs形态,36h细胞形态变得不规则,3d后呈星形或多角形,体外培养可以存活7～10d.结论：此种KCs分离方法操作相对简便,获取的细胞数量、活性功能、纯度等方面均能达到进一步的实验要求,值得推广.     

DC活化的特异性CTL对裸鼠胃癌移植瘤的杀伤效应

用人胃癌细胞抗原致敏成熟树突状细胞（DC）。将DC活化的特异性细胞毒性T细胞（CTL）注射到胃癌裸鼠体内。用流式细胞术（FCM）检测移植瘤细胞C0／G1、S、G2／M期细胞凋亡情况。结果DC活化的特异性CTL作用于裸鼠皮下移植瘤，可显著抑制其生长，瘤细胞出现不同程度的坏死、变性。特异性CTL作用后，裸鼠皮下移植瘤细胞的增殖指数（PI）为（24.39±2.46）％，显著低于非抗原特异CTL作用后组的（31.24±3.85）％和对照组的（32.78±4.17）％；凋亡细胞比率为（15.83±2.77）％，显著高于非抗原特异CTL组的（7.28±2.26）％和对照组的（9.15±1.33）％，P均〈0.05。认为胃癌细胞抗原致敏DCs活化的CTL在体内可特异性的抑制裸鼠移植瘤细胞生长、增殖，促进瘤细胞凋亡，有效预防裸鼠移植瘤的发生。     

不同预处理对去细胞瓣细胞黏附率的影响

目的:探讨不同预处理对去细胞瓣细胞黏附率的影响。方法:取新鲜猪主动脉瓣,用胰蛋白酶加TritonX100去除细胞,分别给予磷酸缓冲液(PBS)、多聚赖氨酸(PLL)和未灭活胎牛血清(FBS)包被处理瓣膜。然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测瓣膜细胞黏附率,并苏木精-伊红染色和扫描电镜形态学观察。结果:FBS处理组的细胞黏附率高于其他两组,光镜和扫描电镜显示肌成纤维细胞在去细胞瓣表面形成连续的细胞层。结论:FBS预处理能较好地改善去细胞瓣的细胞黏附。     

可溶性人TRAIL基因表达载体的构建及其诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的 构建可溶性肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体TRAIL基因表达载体并研究其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法 采用重叠延伸PCR法克隆含有TNF-α信号肽的人TRAIL基因，并将其连入pUCm-1载体。测序正确后克隆入表达载体pcDNA3．1中。采用Gene-Companion^TM非脂质体型聚阳离子转染试剂体外瞬时转染人膀胱癌EJ细胞，RT—PCR法检测目的基因mRNA水平的表达，Western blot检测细胞培养上清中目的基因的表达，流式细胞术检测细胞凋亡，克隆形成实验检测细胞存活。结果 成功构建了可分泌表达的人可溶性TRAIL表达载体，体外转染TRAIL的EJ细胞凋亡率均显著高于未转染细胞及转染空载体细胞的凋亡率，并明显抑制细胞存活，细胞存活率为51.34％，明显低于末转染细胞及转染空载体的细胞存活率。结论 所构建的可溶性TRAIL表达载体转染肿瘤细胞可诱导细胞凋亡及抑制肿瘤细胞的生长存活。     

肝癌细胞流变特性及其与细胞骨架结构的相关性研究

目的：研究正常肝细胞和肝癌细胞流变特性与细胞骨架结构的相关性。方法：以微管吸吮技术测定两种细胞的粘弹性系数和细胞在2ug/mlIV 型胶原／1．25ug/ml层连蛋白（laminin,LN )复合裱衬表面上的粘附力,以秋水仙素（colchicine,Col）和细胞松弛素D（cytochlasin,CD)处理细胞研究其对细胞粘性系数和粘附力的影响,结果：在质量浓度为1－60mg/L的Col作用下,肝细胞弹性系数及粘附力总体上明显增高或趋于增高,而肝癌细胞弹性系数及粘附力明显降低,在质量浓度为0．25－5．00mg/L的CD作用下,两种细胞焯弹性系数及粘附力均明显降低,肝癌细胞弹性系数K1,K2值及粘附力的下降幅度明显大于肝细胞相应值的下降幅度,细胞在IV型胶原／LN复合裱衬表面附力与细胞粘弹性系数呈相同的变化趋势,肝癌细胞粘附力变化与细胞弹性系数K1,K2的变化呈度正相关（P＜0．01）。结论：在CD和Col作用下肝细胞和肝癌细胞的流变特性呈不同的效应方式或强度,反映了肝细胞和肝癌细胞骨架结构和机能状态的差异。     

体外诱导白血病源性树突状细胞及其对T细胞杀伤活性影响的研究

目的 :探讨体外培养白血病源性树突状细胞 (DC)及其对T细胞杀伤活性的影响。方法 :从慢性髓细胞性白血病 (CML)患者外周血中分离单个核细胞 ,加入 1× 10 6U/L粒 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)、1×10 6U/L白细胞介素 (IL) 4和 5 0× 10 3 U/L肿瘤坏死因子 (TNF α) ,每 3～ 4天换液 1次 ,连续培养 14天 ,获得DC。取外周血单个核细胞加入 5 0 0× 10 3 U/LIL 2 ,培养至第 7天 ,把细胞分成两组 ,其中一组加入培养的DC ,两组细胞继续培养 3～ 4天 ,然后测定T细胞杀伤活性。结果 :DC具有典型的树状突起 ,高表达CD1a,具有慢粒特异性染色体t(9;2 2 ) ,能增强T细胞对白血病细胞的杀伤活性。结论 :在体外利用细胞因子可以把CML细胞诱导分化成具有刺激T细胞产生细胞毒性反应的白血病源性DC。     

壁细胞的淘洗分离与应用

本文联合应用细胞淘洗与连续密度梯度分离技术，将有用胶原酶消化分离得到胃粘膜细胞进行分类，建立了壁细胞分离方法，壁细胞纯度达到８０％，存活率达９５％以上。保存细胞活性，提高细胞纯度是细胞分离纯化过程中至关重要的两个环节。该方法为深入研究壁细胞生理及胃肠激素对壁细胞功能的调节提供了实验工具。     

Dissociation, culture and morphologic changes of interstitial cells of Cajal in vitro

AIM: To study the method of dissociation, culture and investigate its morphologic changes in vitro of interstitial cells of Cajal (ICC). METHODS: Enzymatic digestion and Ficoll density centrifugation were used to dissociate ICC from the ileal segment of mice. Factors including contamination, Ca~(2+), Mg~(2+) and collagenase, and stem cell factor, etc., were investigated. ACK2, the antibody of c-kit, was used to identify the cultured ICC. Both light microscope and fluorescence microscope were used to observe the changes of ICC in vitro. RESULTS: The method for dissociation and culture of ICC in vitro was successfully established. After 24 h, cultured ICC exhibited a few axis-cylinders, and longer axis-cylinders were observed to form synapse of each other after 3 d. More widespread connections formed within 7 d in vitro. The changes of its morphologic character were obvious within 7 d; however, there were no obvious morphologic changes after 30 d. CONCLUSION: Many factors can influence the dissociation and culture of ICC.     

骨髓单核细胞与心肌样细胞移植对兔心肌梗死面积影响的对比研究

目的评价骨髓单核细胞与心肌样细胞移植对心肌梗死面积影响是否具有差异。方法提取、分离、培养骨髓单个核细胞,向心肌样细胞定向诱导分化。心肌梗死模型制作2周后沿梗死周边区域注射100!l培养基或骨髓单个核细胞、心肌样细胞各3×108/100!l。移植前、后4周心脏超声检查,TTC染色评价梗死面积。结果①诱导后骨髓基质细胞(MSC)呈现心肌样细胞超微结构特征,PCR检查表达心肌收缩、舒张特异性蛋白肌球蛋白重链(β-MHC)、受磷蛋白(PHO)、心房颗粒(ANP)。②与对照组相比,细胞移植能降低梗死面积,心肌样细胞移植组效果更好[(35.17±1.76)%、(28.61±1.24)%和(22.82±3.12)%,P<0.05]。结论MSC可定向分化心肌样细胞,心肌样细胞移植在改善心肌细胞坏死,降低梗死面积方面效果优于骨髓单个核细胞移植。     

肺癌的细胞免疫治疗

免疫治疗是肺癌综合治疗的主要手段之一,细胞免疫治疗通过给荷瘤机体输注抗肿瘤免疫效应细胞的方法来达到治疗肿瘤的目的.本文就目前用于肺癌临床研究的细胞免疫治疗的主要抗肿瘤效应细胞的临床应用情况作一简要概述,主要有LAK细胞、TIL细胞、AKM细胞和CIK细胞.     

溃疡性结肠炎肠上皮细胞的凋亡和增殖

目的探讨溃疡性结肠炎(UC)上皮细胞凋亡与增殖的失调在UC上皮屏障破坏中所起的作用.方法选取35例UC患者和15例对照者,经肠镜取活检,作组织学检查以明确诊断和有无异型增生.分别采用M30Cttideath和Ki-67两种单抗,通过免疫组织化学SP法检测上皮细胞凋亡和增殖.结果UC上皮细胞凋亡指数(M30)及凋亡增殖比与对照组相比增高,差异有非常显著意义(P＜0.01),而增殖指数(Ki-67)与对照组相比无统计学意义(P＞0.05);UC的M30阳性凋亡细胞不仅呈灶性分布于肠腔表面,而且隐窝底部及闭锁的腺腔内也有上皮细胞提前凋亡;UC的Ki-67阳性增殖细胞可超越隐窝下1/3的正常范围而达上1/3甚至隐窝顶部.结论UC上皮细胞提前凋亡以及凋亡和增殖比的失调也许是导致上皮屏障缺失的一个重要原因.     

肝细胞水化状态对细胞凋亡的影响

目的　探讨肝细胞水化状态 ,即容积改变时对肝细胞凋亡的影响。方法　动态观察不等渗培养条件下大鼠肝细胞凋亡数 ,[3 H]亮氨酸、[3 H]TdR掺入量 ,及同期培养大鼠肝细胞上清液中ALT、AST、LDH活性。结果　各培养组肝细胞凋亡数随培养时间延长有增高趋势 ,以高渗组较明显 ,于培养 12 0min平均达到了 10 .17个 /每低倍镜视野 ,但与另两组相比无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;低渗组肝细胞凋亡增加数与 [3 H]亮氨酸和 [3 H]TdR掺入抑制量之间均无平行关系 ,R值分别为 0 .2 765和 0 .65 68(P >0 .0 5 ) ;高渗组两者间有明显的平行关系 ,R值分别为 0 .93 0 7(P <0 .0 5 )和 0 .9988(P <0 .0 0 1)。培养上清液ALT、AST、LDH活性在正常范围内波动。结论　高渗状态可能诱发肝细胞凋亡 ,但仍是肝细胞对环境变化的生理反应之一。     

丙型肝炎肝硬化CD56+T细胞和NK细胞数量及抗肿瘤活性

目的:研究CD56 T细胞和NK细胞在丙型肝炎肝硬化时的数量及抗肿瘤细胞活性变化．方法:丙型肝炎肝硬化患者18例,快速肝穿获得肝组织,分离肝脏单个核细胞(MNC),流式细胞仪分析CD56 T细胞及NK细胞数量,肝脏 MNC和外周血单个核细胞(PBMC)分别与IL-2 混合培养,检测IFN-γ含量及抗肿瘤细胞活性．结果:健康志愿者、慢性丙型肝炎患者、丙型肝炎肝硬化患者肝脏MNC中CD56 T细胞数量百分比分别是20．4％±6．2％,11．2％±3．1％和5．0％±1．6％;NK细胞比例分别是 31．1％±9．7％,31．6％±8．3％和18．3％±5．4％: 肝脏MNC的IFN-γ产量分别是7．4±2．4,3．2± 1．8和1．9±0．5 μg／L;抗肿瘤细胞的细胞毒性分别是61．1％±17．1％,59．2％±14．6％,26．7％± 8．5％．以上四组数据均以肝炎肝硬化患者变化最为显著(P<0．05)．结论:丙型肝炎肝硬化时肝脏CD56 T细胞和 NK细胞数量及抗肿瘤细胞活性分别下降．     

体外转染canstatin核糖核酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的研究

目的 :研究体外转染canstatin核糖核酸 (RNA)对培养的兔血管平滑肌细胞 (VSMC)凋亡的影响。方法 :在无菌条件下取新西兰白兔胸主动脉 ,采用阳离子脂质体介导的基因转染方法 ,将外源性canstatinRNA转入VSMC中 ,应用流式细胞仪 (FCM )、TUNEL及电镜观察canstatinRNA转染细胞的凋亡。实验共分对照组、DOSPER组和canstatin组。结果 :阳离子脂质体介导的canstatinRNA成功转入VSMC并表达 ,流式细胞仪检测表明 ,canstatinRNA转染细胞的细胞周期发生细胞生长期 (G1期 )阻滞 ,G1期细胞 ( 5 8 93± 2 17) %较对照组 ( 4 9 13± 2 0 7) %及DOSPER组 ( 4 9 99± 1 45 ) %增加 ,有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,脱氧核糖核酸合成期 (S期 )细胞 ( 19 88± 2 2 8) %较对照组 ( 2 8 0 6± 3 77) %及DOSPER组( 2 8 5 0± 4 41) %减少 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。canstatin组RNA转染细胞的凋亡率 ( 17 74± 3 93) %高于对照组 ( 4 89± 3 5 9) %及DOSPER组 ( 4 0 6± 1 80 ) % ,有极显著性差异 (P <0 0 1) ,而对照组及DOSPER组无显著性差异 (P >0 0 5 )。TUNEL检测显示 ,canstatin基因转染细胞凋亡明显增加 ,电镜下观察到转染细胞出现典型凋亡特征性改变。结论 :阳离子脂质体介导的canstatinRNA成功转染VSMC并能显著     

α-半乳糖酰基鞘氨醇与肝脏疾病关系的研究进展

-α半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)是一种从海绵体中提取由CDld递呈的糖酯,由亲水性的碳酸化合物部分与疏水性的酰基鞘氨醇部分通过α连接形成.α-GalCer是NKT细胞的配体,在体内外均能有效激活NKT细胞,活化的NKT细胞在机体的自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤以及移植排斥等方面发挥着重要的作用.     

一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法

目的观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞(KCs)分离方法获取KCs的效果。方法参照Akira提供的方法进行以下改进:①前灌注液在体灌注,Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;②Percoll分离液不连续密度梯度离心;③台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞。结果肝脏KCs的获得量为(3±1.5)×105/g鼠肝,细胞活度>92%;光镜下细胞呈圆形,培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力,DAB染色呈"煎蛋"样,荧光显微镜下>99%为KCs。结论改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs,简捷经济,值得推广。     

Treg和Th17细胞在老年原发性非小细胞肺癌患者外周血中的失衡表达及临床意义

目的探讨外周血中Treg、Th17的表达与老年原发性非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展的关系。方法应用四色免疫荧光标记流式细胞术对65例老年NSCLC患者(老年肺癌组)外周血中Treg、Th17的表达量进行检测,并分别与老年良性病变组(老年非癌组)、老年健康组以及年轻健康组对比,并研究其与老年肺癌临床病理特征之间的关系。结果老年肺癌组Treg、Th17的表达量显著高于其余各组(P0.05),两者在老年非癌组中表达与老年健康组比较差异均不显著(P0.05);老年健康组Treg的表达量显著高于年轻健康组(P0.05),而Th17的表达量在老年健康组与年轻健康组间无统计学差异(P0.05);两者表达水平与老年肺癌的临床TNM分期、细胞分化程度以及淋巴结转移状态密切相关(P0.05或P0.01),而与病理类型无关(P0.05)。结论 Treg、Th17细胞的失衡表达在老年原发性NSCLC的形成和演变过程中发挥着重要作用。     

心肌M细胞的认识及其临床进展

人心肌细胞电生理研究,始于60年代。当时由于标本难得,分离心肌细胞技术上存在困难,而影响了心肌细胞电生理学的研究。80年代,由于膜片钳技术的应用、心脏外科和心脏移植手术的开展,人心肌细胞电生理学研究得到了飞速的发展。90年代以来,随着心肌细胞电生理学特别是心肌细胞离子流(离子通道)学研究不断深入,Drouin等在动物实验的基础上证实了人类心肌中存在M细胞,从而为心律失常的发生机制及抗心律失常药物的作用开拓了新的理论。     

负载MB49肿瘤细胞抗原的DC疫苗对膀胱癌的抑制效应及机制

目的探讨负载MB49肿瘤细胞抗原的树突状细胞疫苗（DC疫苗）治疗膀胱癌的可行性及机制。方法采用反复冻融法提取MB49抗原并用其致敏DC2.4,制备DC疫苗。将24只膀胱癌荷瘤小鼠随机分为两组各12只。DC组皮下注射DC疫苗,对照组注射PBS。注射3周观察两组肿瘤体积变化,计算肿瘤抑制率;分离两组脾脏T淋巴细胞进行培养,MTT法检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对MB49的杀伤率;ELISA法检测培养上清中IFN-γ水平。结果 DC组肿瘤抑制率及细胞杀伤率均明显高于对照组,P〈0.01;IFN-γ水平亦明显高于对照组,P〈0.01。结论以DC2.4为基础的DC疫苗体内具有抑制肿瘤细胞MB49增长的作用;其机制可能为激活T淋巴细胞。