VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力研究

目的探究VEG株弓形虫卵囊对中国昆明小鼠的致病性。方法分别选择1个,100个~108个的VEG株弓形虫卵囊灌胃昆明小鼠,采用MAT、HE和IHC方法研究小鼠对弓形虫的感染情况,并分析小鼠感染率,生存率及其大脑内的弓形虫包囊数量。结果≥10~2个VEG株弓形虫卵囊可引起小鼠100%感染,最低致死剂量为10~2个卵囊,100%致死剂量为108个卵囊,急性期死亡时间为7DPI~14DPI,弓形虫的成囊率是32.14%(9/28),包囊数量为9~857个/只小鼠大脑,感染小鼠生存率为67.44%(29/43),最长存活时间≥390DPI。结论 VEG株弓形虫卵囊对昆明小鼠的毒力中等,包囊形成率较高。     

PRU株弓形虫感染家猫实验动物模型的建立

目的建立家猫弓形虫有性生殖实验动物模型,获取并纯化卵囊,为弓形虫相关研究奠定基础。方法将6只3月龄雄性华南本地家猫分为2组,实验组经口感染600个PRU株弓形虫包囊,对照组口服生理盐水。通过镜检猫的粪便,鉴定弓形虫卵囊的排放。将收集到的弓形虫卵囊以CsCl梯度离心法进行纯化,观察不同条件下卵囊的孢子化情况。用不同数量的孢子化卵囊感染KM小鼠,检测卵囊的感染活性。结果实验猫感染PRU株弓形虫后于第5d开始排出卵囊并持续至感染后第11~13d,排出的卵囊数为1.0亿~1.5亿个/只,以CsCl梯度离心方法纯化卵囊得率为20%。新鲜采集的卵囊孢子化率为95%。以100、50和10个孢子化卵囊的剂量感染小鼠,8~10d后的死亡率分别为100%,66.7%和0%。结论用PRU株弓形虫感染华南本地家猫,成功建立了弓形虫有性生殖实验动物模型,收集、纯化的卵囊易孢子化且具感染活性,为弓形虫感染的防治提供了基础。     

刚地弓形虫China 1基因型成囊株在小鼠体内的动态分布

目的观察流行我国的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)主要基因型China 1成囊株在感染小鼠体内的动态分布和包囊形成。方法采自武汉的猫源性刚地弓形虫株(TgCtwh1,基因型为China 1,即ToxoDB#9)包囊50个(约含1×104个缓殖子)经口感染SPF级CD1雌性小鼠50只,于感染后第2、4、7、10、14、21、35、50和72天,分别大体观察小鼠健康状况并测定体重;颈椎脱臼法处死小鼠,脑组织压片观察弓形虫包囊形成时间,计算成囊率,测量包囊直径;荧光定量PCR和组织接种方法检测弓形虫在血液、心、肝、脑和淋巴结组织中的动态分布。结果实验小鼠感染后第7天体重减轻(3.650±0.252)g;第10天[(1.730±0.017)g]与第14天体重差值[(-0.390±0.554)g]比较,有统计学意义(P<0.05)。感染后第21天,在脑组织中查获包囊,成囊率为80%,直径为20～40μm;至感染后第35天,小鼠成囊率增为100%,包囊直径为50～60μm。感染后第2天,TgCtwh1虫体即出现在血液、心、肝和淋巴结组织中,拷贝数分别为3.510±0.152、4.100±0.198、4.220±0.209和4.960±0.052,感染后第4天见于脑组织(3.800±0.154);血液中的虫体在第7天达峰值(5.240±0.115),随后逐渐下降,至第35天消失;心和脑组织中的虫体分别于第14天和第10天达峰值后(5.640±0.214和5.790±0.060)维持相对稳定的水平;肝和淋巴组织中的虫体分别于第7天和第10天达峰值(5.310±0.038和6.200±0.152),此后虫体逐渐减少,至第50天转阴。结论流行中国的弓形虫China 1基因型成囊株在感染小鼠体内虫血症可持续至少21 d,感染后第21天首次在小鼠脑组织内检测到包囊。     

弓形虫Fukaya株在慢性感染小鼠体内分布的研究

目的观察弓形虫(Fukaya株)感染时的慢性期病变特点及虫体在主要脏器的动态分布,以期为弓形虫病的病理诊断提供依据,并对弓形虫的致病机理加深理解。方法弓形虫Fukaya株速殖子(5×104个)分别以腹腔、皮下和口服途径感染小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,对照组不给药。于感染后第3、6、14、21、28、42和90 d,取肝、肺和脑进行间接免疫酶染色检查。结果经腹腔感染的实验组小鼠第21、28 d肺与脑内均可见虫体,脑内有包囊;皮下感染组第21 d肺和脑内也可见虫体,脑内有包囊;经口感染组第14、21 d肺和脑内均可见虫体,脑内偶见包囊,并检测到弓形虫抗原。感染后第21 d,3种方式感染的实验组小鼠肺内虫体数差异无显著性(P>0.05),而脑内虫体数差异有显著性(P<0.05),口服感染组>皮下感染组>腹腔感染组。结论间接免疫酶染色方法可清楚显示弓形虫感染慢性期的组织内弓形虫速殖子、抗原成分和包囊。弓形虫感染慢性期小鼠肺与脑多被累及。小鼠脑内较其他脏器易成囊。弓形虫体内成囊的影响因素很多,感染方式及感染阶段也是影响成囊的重要因素。     

PRU株弓形虫包囊感染小鼠模型的建立

目的建立一个合理、经济的弓形虫包囊小鼠感染模型,为弓形虫的相关研究提供参考。方法 20个PRU株弓形虫包囊分别感染C57BL/6J、ICR、KM或BALB/c四个品系雌性小鼠10只,感染后42d,统计小鼠存活率、脑组织包囊数和包囊直径。结果 KM小鼠存活率100%(10/10),ICR小鼠存活率70%(7/10),C57BL/6J存活率10%(1/10),BALB/c全部死亡(0/10);ICR小鼠包囊数和包囊直径与KM小鼠相比具有显著性差异(P0.01):ICR鼠脑组织包囊数为1385.71±378.555,直径为4.044±0.187μm;而KM鼠脑组织包囊数为290.00±129.743,直径为3.557±0.271μm。结论与其他3个品系小鼠相比,ICR小鼠对PRU株弓形虫包囊的抗性较强,可以作为弓形虫包囊感染模型。     

不同途径感染弓形虫小鼠在脑内形成包囊的研究

目的用3种不同途径感染Fukaya株弓形虫速殖子,观察弓形虫感染小鼠慢性期病变特点及虫体在脑内的成囊过程,以期寻求一个稳定、易建的慢性感染动物模型,为弓形虫病的病理诊断提供依据,并对弓形虫的致病机理加深理解。方法弓形虫Fukaya株速殖子(5×104个)分别以腹腔、皮下和口服途径感染小鼠,给适量药物使之形成慢性感染,并与不给药组做对照,于感染后第3d、6d1、4d2、1d、28d、42d和90d,取脑进行间接免疫酶染色,统计脑内虫体数量及形成包囊情况。结果不给药组第3d、6d与给药组第6d,3种感染途径的腹腔含虫数比较:均为腹腔感染>皮下感染>经口感染。比较小鼠脑内虫体分布:腹腔感染组,第28d的脑内虫体达到高峰,此时脑内包囊最多。皮下感染组,第21d的脑内虫体最多,脑内包囊也多。经口感染组,第21d脑内虫体最多,但脑内偶见包囊。经口感染Fukaya株速殖子似不易成囊。经腹腔、皮下和口服感染虫体的小鼠存活率在第42d分别为100%、66%、80%。结论弓形虫感染慢性期小鼠脑多被累及。腹腔与皮下感染弓形虫Fukaya株速殖子比口服易成囊,经腹腔感染方式建立弓形虫慢性感染动物模型较稳定。     

隐性弓形虫感染小鼠的学习记忆能力障碍研究

目的应用物体识别试验和Morris水迷宫试验检测隐性弓形虫感染小鼠的学习记忆能力。方法 36只昆明小鼠随机分为对照组、低剂量弓形虫包囊感染组(低感染组)和高剂量弓形虫包囊感染组(高感染组),每组12只,低感染组和高感染组每鼠分别经口感染弓形虫Prugniaud(PRU)弱毒株6个和12个包囊。感染后第63天进行物体识别试验,通过第1天的适应期和第2天的熟悉期,于试验第3天记录小鼠对新旧不同物体的探究时间,计算分辨指数(DI)。感染后第66天进行Morris水迷宫试验,分别通过定位航行试验、空间搜索试验和工作记忆试验检测各组小鼠的空间记忆获得能力、空间记忆保持能力和工作记忆能力。于水迷宫试验结束当天,即感染后第74天处死小鼠,取左侧脑组织固定,切片,伊红-苏木素染色后,镜下观察病理改变。右侧脑组织用于检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果物体识别试验结果显示,高感染组和低感染组小鼠的分辨指数分别为(14.3±5.2)%和(17.5±5.6)%,均显著低于对照组[(28.9±7.1)%](P<0.01)。在定位航行试验中,两个弓形虫感染组小鼠找到平台的逃避潜伏期均长于对照组,其中试验第2天和...     

大蒜素、美浓霉素对小鼠脑内弓形虫包囊形成的影响

目的　观察大蒜素、美浓霉素对小鼠脑内弓形虫包囊形成的影响。方法　将弓形虫Fukaya株包囊腹腔注射感染小鼠 ,分别用大蒜素、美浓霉素治疗 ,设置不治疗对照组 ,45d后处死小鼠 ,观察脑内包囊数 ,以判断药物效果。结果　急性期用大蒜素能明显提高小鼠脑内包囊数 ;美浓霉素可杀灭弓形虫速殖子而使脑内包囊数明显减少 ;包囊形成后大蒜素、美浓霉素均无杀灭包囊的作用。结论　初步认为大蒜素可提高弓形虫包囊的收获量 ;美浓霉素对弓形虫包囊无作用     

弓形虫Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗强毒株致死性感染的免疫保护作用

目的 研究我国流行的优势基因型Chinese 1弱毒Wh6株感染抗致死性强毒Wh3株攻击感染的保护力,探讨其潜在的制备减毒活疫苗的价值。方法 将30只BALB/c雌性小鼠随机分为3组(I,II,III组),每组10只。取弱毒株弓形虫保种小鼠脑组织,分离包囊,计数。I组小鼠灌胃包囊25-35个;II组给与PBS对照;III组正常小鼠不予任何干预。35 d后,I组感染小鼠脑组织压片镜检,查见典型弓形虫包囊,表明慢性弓形虫感染BALB/c小鼠模型建立成功。分别取Wh3株速殖子(3 000个),腹腔感染I组和II组小鼠,观察小鼠存活及腹腔虫荷;同时剖杀小鼠,收集脾细胞培养上清,采用流式细胞术、荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验等检测脾细胞中的Th1、Th2细胞因子水平。结果 II组对照鼠在感染Wh3株弓形虫速殖子后第7 d内死亡5只,第8 d剩余5只全部死亡,随机取3只死亡小鼠对其腹腔进行计数,计数结果为(1.28±0.035 1)×10⁶/mL;而I组小鼠截止实验结束全部存活(P<0.01)。II组鼠脾细胞培养上清Th1细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2细胞因子IL-10水平相比I组显著升高(P<0.001)。其中Th1细胞因子升高程度明显高于Th2细胞因子,巨噬细胞向Th1方向极化。结论 用弱毒株Wh6包囊攻击感染BALB/c鼠,可诱导强力的抵抗Wh3强毒株致死性感染的免疫保护力。Chinese 1基因型Wh6株具有候选减毒活虫疫苗研究的潜在价值。     

液氮保存微小隐孢子虫卵囊对小鼠感染力的研究

目的 观察两种不同保存方法 对微小隐孢子虫卵囊感染小鼠能力的影响.方法 用PBS稀释纯化的卵囊,加入二甲基亚砜(DMSO),置-40℃ 3h后,放入液氮中保存;或加入2.5%重铬酸钾中,4℃保存.3个月后取出,观察它们的脱囊率;分别感染用地塞米松免疫抑制后的BALB/c小鼠,计数卵囊排出量,计算平均每克粪便中的卵囊数目,同时记录两组小鼠的死亡时间.分别采用t检验和成组设计的两样本秩和检验进行统计学分析.结果液氮中保存3个月的卵囊能够感染免疫抑制的BALB/c小鼠,其脱囊率为7.2%～49.6%、卵囊排出量为(4.7～7.3)×10~5/g,接种后实验小鼠死亡时间为124～351 h,与4℃保存的卵囊差别无统计学意义[8.3%～51.2%,(4.6～6.9)×10~5/g,132～348 h,P均>0.05)].结论 液氮中保存3个月的卵囊与4℃保存的卵囊对免疫抑制的小鼠具有同样的感染力,突破了微小隐孢子虫卵囊只能在4℃保存的传统观念,为隐孢子虫卵囊的长期保存提供了理论和实践依据.     

抗真菌药对复发急性弓形虫病小鼠的保护研究

目的 了解氟康唑或伊曲康唑对复发急性弓形虫病小鼠的保护作用。方法 将感染弓形虫Prugniaud株(PRU株)2月后的ICR小鼠按以下方法进行分组:环磷酰胺组(CTX),环磷酰胺+氟康唑组(CTX+F),环磷酰胺+伊曲康唑组(CTX+I),环磷酰胺+阿奇霉素组(CTX+A),阿奇霉素浓度为250 mg/kg·d,氟康唑和伊曲康唑组根据浓度不同又分为20 mg/kg·d、30 mg/kg·d和40 mg/kg·d 3个组,同时设置正常小鼠+环磷酰胺(N+CTX)和感染组(In)对照。除In组外,其余各组每天腹腔注射环磷酰胺(100 mg/kg·d),同时CTX+F、CTX+I和CTX+A组小鼠用灌胃方法分别喂食不同浓度的氟康唑、伊曲康唑和阿奇霉素,连续用药14 d。结果 实验结束时,CTX组小鼠全部死亡, CTX+A组、N+CTX组及In组小鼠全部存活,CTX+A组与CTX组存活率有显著差异(P=0.016)。CTX组、F组、I组和A组对复发急性弓形虫病小鼠的存活情况差异及其显著(P=0.000);阿奇霉素效果好于氟康唑(P=0.001),而氟康唑作用强于伊曲康唑(P=0.000)。但是氟康唑或伊曲康唑组由于药物剂量不同所导致的存活率无显著差异。CTX组与In组、F组、I组和A组比较,小鼠脑组织包囊数量明显增加(P=0.001),但是A组、I组、F组和In组之间的包囊数差别及F组和I组各个浓度之间包囊数的差别均无统计学差异。结论 氟康唑对复发急性弓形虫病小鼠能起到一定保护作用,其可作为临床上免疫低下患者同时并发弓形虫及其他机会性真菌感染时的备选药物。     

Immunization with a DNA plasmid encoding the SAG1 (P30) protein of Toxoplasma gondii is immunogenic and protective in rodents

Immunization with DNA can induce humoral and cell-mediated immune responses, both of which are important in conferring immunity to Toxoplasma gondii. The efficacy of genetic vaccination with a cDNA encoding the T. gondii SAG1 (P30) surface antigen was evaluated. Sera of immunized mice showed recognition of T. gondii tachyzoites by immunofluorescence and exhibited high titers of antibody to SAG1 by ELISA. SAG1-stimulated splenocytes from vaccinated mice produced primarily interferon-gamma and interleukin-2. Vaccinated mice survived challenge with 80 tissue cysts of ME49 strain, whereas all control mice died; challenge with 20 tissue cysts resulted in fewer brain cysts, compared with controls. Challenge of vaccinated rats with VEG strain oocysts resulted in a reduction in brain cysts. No protection was observed when mice were challenged with the highly virulent RH strain tachyzoites. These results suggest that nucleic acid vaccination can provide protection against T. gondii infection in mice.     

Oral infection of C57BL/6 mice with Toxoplasma gondii: a new model of inflammatory bowel disease?

Infection with Toxoplasma gondii is naturally acquired through the oral route by ingestion of undercooked or raw meat containing cysts of the parasite or through ingestion of contaminated water or food contaminated with cysts or oocysts. Following peroral infection with 100 cysts of the ME49 strain of T. gondii, C57BL/6 mice die within 13 days after infection, whereas BALB/c mice survive. At day 7 of infection, massive necrosis of the villi and mucosal cells in the ilea is observed in C57BL/6 but not BALB/c mice. CD4(+) T cells, interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and inducible nitric oxide synthase mediate the development of necrosis. These findings indicate a Th1-type immunopathology, with parasite replication appearing to be involved in the first 3 days of infection. Murine and human studies on the immunopathogenesis of inflammatory bowel disease (e.g., Crohn's disease) also indicate a Th1-type immunopathology. The shared and distinct features of oral infection of mice with T. gondii and murine models of inflammatory bowel disease are discussed herein.     

应用PCR技术评价抗弓形虫药物的疗效

目的　探讨应用PCR技术对药物治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了考核评价。方法　小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子 2× 10 3 ,8h后给予双氢青蒿素 75mg/kg d和双氢青蒿素 75mg/kg d联合磺胺嘧啶钠 10 0mg/kg d每日两次灌胃小鼠治疗 ,疗程 15d ,观察小鼠存活率 ,并于感染后第 9、15、31d取小鼠腹水及肝、脾和脑进行弓形虫PCR检测 ;于停药后5个月取存活小鼠脑再行弓形虫PCR检测。结果　双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达 93% ,明显高于磺胺嘧啶钠组 (6 8 3% )及双氢青蒿素组 (0 % )。PCR检测可见小鼠腹水中除联合治疗组外 ,其余各组均可检测出特异弓形虫DNA ;但只有对照组和双氢青蒿素组小鼠的肝脏和脑中可检测出虫体DNA ,而脾脏中只有对照组可检出虫体DNA。结论　小鼠腹水的PCR检测结果与存活率和腹水虫体镜检结果一致 ,并弥补了镜下检查由主观造成的不足 ;肝、脾、脑等脏器的PCR检测也取得与存活率基本一致的结果 ;总之 ,本研究中的PCR检测结果较客观地反映药物对小鼠的疗效情况 ,为动物实验性弓形虫病的药物疗效考核提供了一个较为简便、灵敏、特异的方法     

脱落酸抑制剂氟啶酮对小鼠弓形虫病的影响

摘要：目的 观察脱落酸抑制剂氟啶酮对小鼠弓形虫病的影响。方法 给感染弓形虫RH株的小鼠腹腔注射氟啶酮,观察小鼠生存延长率、体重变化;光镜及电镜观察腹腔中弓形虫形态;脏器组织印片评估体内弓形虫扩散情况。结果 与对照组相比,氟啶酮治疗的小鼠弓形虫病症状出现晚且程度较轻,生存时间延长（P<0.05）,生存延长率为45%,体重减少率为6.13%,而对照组体重减少率为7.23%;对照组小鼠腹腔中以游离速殖子为主,实验组则以细胞内虫体为主;实验组小鼠脏器受虫体累及的时间稍晚,感染程度也比对照组轻。结论 氟啶酮能对小鼠弓形虫病起抑制作用。     

Quantitative toxoplasma gondii oocyst detection by a modified Kato Katz test using Kinyoun staining (KKK) in ME49 strain experimentally infected cats

We detected Toxoplasma gondii oocysts in feces of experimentally infected cats, using a Kato Katz approach with subsequent Kinyoun staining. Animals serologically negative to T. gondii were infected orally with 5 x 10(2) mice brain cysts of ME49 strain. Feces were collected daily from the 3rd to the 30th day after challenge. Oocysts were detected by qualitative sugar flotation and the quantitative modified Kato Katz stained by Kinyoun (KKK). In the experimentally infected cats, oocysts were detected from the 7th to 15th day through sugar flotation technique, but oocysts were found in KKK from the 6th to 16th day, being sensitive for a larger period, with permanent documentation. The peak of oocysts excretion occurred between the 8th to 11th days after challenge, before any serological positive result. KKK could be used in the screening and quantification of oocysts excretion in feces of suspected animals, with reduced handling of infective material, decreasing the possibility of environmental and operator contamination.