过表达parkin基因对蛋白酶体抑制剂致SH-SY5Y细胞损伤的影响

目的探讨过表达parkin基因能否抵抗蛋白酶体抑制剂lactacystin对SH-SY5Y细胞的特异性损伤。方法不同浓度的lactacystin(1、5、10、15、20μmol/L)分别作用于人多巴胺能SH-SY5Y细胞和人胶质瘤U251细胞24 h,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法检测细胞活力。选取10μmol/L和20μmol/L lactacystin处理SH-SY5Y细胞,Western印迹法检测细胞内多泛素化蛋白的含量。瞬时转染parkin至SH-SY5Y细胞,并以MTT法检测10μmol/L和20μmol/L lactacystin作用下的细胞活力,Western印迹法检测细胞内多泛素化蛋白的含量,以及用免疫荧光法检测泛素阳性包涵体的形成。结果lactacystin呈剂量依赖性地损伤多巴胺能SH-SY5Y细胞(细胞活力分别为104%、82%、72%、60%、50%),而对胶质瘤U251细胞则无毒性作用。parkin过表达不能缓解lactacystin的毒性作用,也没有增加细胞内多泛素化蛋白生成,但却促进泛素阳性包涵体的形成(增加5%)。结论蛋白酶体功能障碍有可能在多巴胺能神经元的选择性死亡中起关键作用,而Parkin蛋白在路易小体的形成过程中可能起重要作用。     

蜗牛多肽提取物对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞脑源性神经营养因子表达的影响

目的研究蜗牛多肽提取物对H2O2诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧化损伤的抑制作用。方法采用醋酸沉淀法提取蜗牛多肽,在H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的基础上加入不同浓度的蜗牛多肽提取物,MTT法测定细胞存活率;细胞免疫化学技术和Western印迹技术分别检测脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。结果 1.54 mmol/L H2O2可引起SH-SY5Y细胞存活率下降,BDNF的表达明显降低;39 mg/L和156 mg/L蜗牛多肽提取物对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞的存活率有显著地提高作用(P<0.05),BDNF的表达也呈浓度依赖性升高(P<0.01)。结论蜗牛多肽提取物对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞有保护作用,机制可能是通过上调BDNF的表达。     

两种热量限制方式对SH-SY5Y细胞氧化损伤作用的比较

目的研究体外热量限制的两种处理方法(低糖和白藜芦醇)在H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,分为对照组(3.0 g/L-葡萄糖)、H2O2损伤组(250μmol/L H2O2)、低糖组(2.0 g/L-glucose)、低糖+损伤组、白藜芦醇(1.25、5μmol/L)组、白藜芦醇(1.25μmol/L)+损伤组。观察细胞形态,测定各组细胞的噻唑蓝(MTT)代谢率,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。结果用低糖和不同浓度白藜芦醇预处理细胞24 h后MTT法测定570 nm OD值显示,与对照组比较,低糖组细胞活力上升(P<0.01);白藜芦醇1.25μmol/L组活力稍有上升,但无统计学差异(P>0.05);且低糖组较白藜芦醇1.25μmol/L组活力明显升高(P<0.01)。白藜芦醇5μmol/L组显示活力下降(P<0.05),选用白藜芦醇1.25μmol/L作为后续实验用浓度。用低糖和白藜芦醇预处理细胞24 h,给予250μmol/L H2O2损伤1 h后测定MTT代谢率显示,与对照组相比,损伤组活力明显下降,低糖组和白藜芦醇组活力上升(P<0.01);与损伤组相比,低糖+损伤组、白藜芦醇+损伤组活力上升(P<0.01);低糖+损伤组OD值明显高于白藜芦醇+损伤组(P<0.01)。继续培养至7 h发现,与损伤组相比,低糖+损伤组活力明显上升,白藜芦醇+损伤组活力下降(P<0.01)。进一步检测LDH漏出率显示,损伤1 h后结果显示,与对照组相比,损伤组漏出率明显增加(P<0.05),低糖组、白藜芦醇组漏出率稍有减少,但无统计学差异;与损伤组比较,低糖+损伤组漏出率明显减少(P<0.01),白藜芦醇+损伤组漏出率减少(P<0.05);继续培养至7 h显示,低糖组漏出率增加5%;低糖+损伤组漏出率增加11%;白藜芦醇+损伤组增加48%(P<0.01);白藜芦醇+损伤组漏出率高于低糖+损伤组(P<0.01)。细胞形态学观察显示,未加损伤之前,低糖组、白藜芦醇组的细胞形态,与对照组比较无明显改变。加入损伤药物1 h后,各组的细胞形态与对照组比较无明显改变。加入损伤药物7 h后,低糖组、低糖+损伤组和对照组细胞贴壁性好,突起伸展良好细长,透光性好;损伤组和白藜芦醇+损伤组可见细胞数目明显减少,死细胞多,突起回缩,细胞明显变圆,贴壁性不好,透光性差。结论低糖模拟热量限制抗氧化应激损伤效应明显优于白藜芦醇,是一种较好的体外模拟热量限制的细胞模型。     

新型硫化氢供体8L通过上调NF-E2相关因子2的表达拮抗H2O2损伤H9c2心肌细胞

目的探讨新型硫化氢供体8L对氧化应激诱导心肌细胞损伤的保护作用及NF-E2相关因子2(Nrf2)有关的分子机制。方法用活性氧供体过氧化氢(H2O2)处理培养的大鼠H9c2心肌细胞,建立心肌细胞损伤的体外模型以模拟急性缺血再灌注诱导的心肌损伤;在H2O2处理前给予8L预处理观察其对心肌细胞的保护作用。为了明确Nrf2的作用,在H2O2处理或8L预处理前给予其选择性抑制剂鸦胆苦醇预处理。细胞计数试剂盒8比色法检测细胞存活率,试剂盒法检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放,罗丹明123染色结合荧光照相术检测线粒体膜电位(MMP),Western Blot法检测核内Nrf2的表达。结果 H9c2心肌细胞经0~600μmol/L H2O2处理6 h可浓度依赖性地降低细胞存活率,且半数有效浓度约为400μmol/L。400μmol/L H2O2处理H9c2心肌细胞6 h可使LDH释放增加,MMP降低,并增加细胞核内Nrf2的表达(P均0.01)。在用400μmol/L H2O2处理前,先用50、100和200μmol/L 8L预处理1 h,可将细胞存活率从(52.6±4.3)%分别提高至(72.5±6.3)%、(83.1±5.2)%和(85.7±4.9)%。200μmol/L 8L预处理1 h还可明显抑制H2O2诱导的LDH释放(P0.01)及MMP受损(P0.05),但可易化H2O2诱导的Nrf2表达上调(P0.01)。另外,10μmol/L鸦胆苦醇预处理1 h不但可加重H2O2诱导的心肌细胞损伤(P0.01),还可拮抗8L的心肌细胞保护作用(P0.01)。结论硫化氢供体8L可减轻氧化应激诱导的H9c2心肌细胞损伤,其机制可能与上调Nrf2有关。     

川陈皮素抑制Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激与凋亡作用

目的探讨川陈皮素对β淀粉样蛋白(Aβ)25~35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及潜在机制。方法SH-SY5Y细胞培养至对数生长期,分为正常对照组、Aβ_25~35损伤组及川陈皮素25、50、100μmol/L组,培养24 h后检测细胞存活率、氧化应激水平、凋亡率、凋亡相关基因及磷酸化-蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化-雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白表达等指标。结果与Aβ_25~35损伤组比较,川陈皮素各浓度处理组SH-SY5Y细胞的存活率显著增加(P<0.05),而乳酸脱氢酶(LDH)活性显著降低(P<0.05);与Aβ_25~35损伤组比较,川陈皮素各浓度处理组SH-SY5Y细胞谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性显著增加(P<0.05),而丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05);给予不同浓度川陈皮素处理后,与Aβ_25~35损伤组比较,SH-SY5Y细胞凋亡率、Bax mRNA表达显著降低(P<0.05),而Bcl-2 mRNA、Bcl-2/Bax值、p-Akt及p-mTOR蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论川陈皮素可以通过调控Akt/mTOR通路抑制Aβ_25~35诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激及凋亡,进而对Aβ_25~35诱导的SH-SY5Y细胞损伤产生保护作用。     

多巴胺与α-突触核蛋白在神经母细胞瘤细胞中的相互作用

目的 研究多巴胺(DA)与α-突触核蛋白(α-synuclein)在神经母细胞瘤细胞中的相互作用机制,探讨二者在帕金森病(PD)发病中的作用. 方法 3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氨唑溴盐(MTT)法确定外源添加DA的浓度,检测外源多巴胺对SH-SY5Y细胞α-synuclein、caspase-3活性片段表达及丙二醛含量的影响;野生型α-synuclein重组质粒转染SH-SY5Y细胞,观察细胞内多巴胺浓度、丙二醛含量、caspase-3活性片段表达水平的变化及多巴胺转运体抑制剂GBR12935对上述变化的影响. 结果 (1)外源添加300 μmol/L多巴胺作用24 h后SH-SY5Y细胞内多巴胺浓度较空白对照组升高了接近16倍(t=7.32,P＜0.01),α-synuclein、caspase-3活性片段表达水平及丙二醛含量均升高(t=4.92,P＜0.01;t=17.14,P＜0.01; t=6.55,P＜0.01);(2)α-synuclein重组质粒转染SH-SY5Y后细胞内多巴胺浓度(F=32.97,P＜0.01)、丙二醛含量(F=107.80,P＜0.01)、caspase-3活性片段表达水平(F=55.54,P＜0.01)均较空载体转染组升高,但这种上升均被GBR12935部分遏制. 结论 多巴胺促进SH-SY5Y细胞α-synuclein表达,而过表达α-synuclein又导致SH-SY5Y细胞内多巴胺浓度升高,二者形成产生细胞毒性的恶性循环.     

柴胡皂苷 d 对SH-SY5Y细胞体外抑制作用及机制

目的 探究柴胡皂苷(SS)d对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的体外抑制作用及分子机制。方法 体外常规培养神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,分别在浓度0、4、8、10μmol/L SSd的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中作用48 h,设为对照组及4、8、10μmol/L SSd组,荧光探针(DCFH-DA)法检测各组细胞中活性氧(ROS)的产生情况,试剂盒检测不同浓度SSd对SH-SY5Y细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)含量的影响;Western印迹法检测细胞内细胞周期蛋白(Cyclin)D1、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关X基因(Bax)表达水平。结果 与对照组相比,8、10μmol/L SSd组ROS水平、MDA含量显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),且有浓度依赖趋势;4、8、10μmol/L SSd组LDH活性、Bax蛋白表达明显升高,CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论 SSd能够通过提高细胞的氧化应激水平,抑制CyclinD1信号转导通路而促进SH-...     

刺槐素在SH-SY5Y细胞氧-葡萄糖剥夺和小鼠脑缺血再灌注中的神经保护作用

目的 探讨刺槐素在SH-SY5Y细胞氧-葡萄糖剥夺和小鼠脑缺血再灌注中的神经保护作用.方法 培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,分为正常培养组、氧-葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)组以及刺槐素小剂量组(1μmol/L)、中剂量组(5μmol/L)和大剂量组(10 μmol/L),复氧24 h后应用噻唑蓝染色法测定细胞存活率,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法测定LDH漏出率.60只C57小鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组以及小剂量组、中剂量组和大剂量刺槐素组,每组12只.采用线栓法制作大脑中动脉闭塞模型,缺血再灌注时给予刺槐素腹腔注射(小、中、大剂量组分别为6.25、12.5和25 mg/kg).再灌注后24 h时进行神经功能评分,应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色检测脑梗死体积.结果 体外实验显示,1 μmol/L、5μmol/L和10 μmol/L刺槐素组SH-SY5Y细胞存活率分别为(90.34±6.87)％(P=0.000)、(85.47 ±2.24)％ (P=0.001)和(81.79±1.77)％(P=0.008),均显著高于OGD组的(70.62± 8.89)％.1μmol/L、5μm/L和10 μm/L刺槐素组SH-SY5Y细胞LDH漏出率分别为(159.11 ±13.11)％ (P=0.021)、(155.12±24.72)％(P=0.011)和(160.92 ±7.83)％ (P =0.027),均显著低于OGD组的(180.35±10.60)％.体内实验显示,大剂量刺槐素组神经功能评分显著低于与脑缺血再灌注组[(1.67±0.85)分对(2.50±0.55)分;P=0.018].小剂量、中剂量和大剂量刺槐素组梗死体积分别为(24.14±7.10)mm3、(17.18±3.19)mm3和(12.86±1.88)mm3,均显著小于脑缺血再灌注组的[(48.81±9.48) mm3](P均=0.000).结论 体外和体内实验均显示,刺槐素具有神经保护作用.     

左旋四氢巴马汀对大鼠海马神经元细胞钙超载损伤的保护作用

目的研究左旋四氢巴马汀(l-THP)对氯化钾所致大鼠海马神经元胞内钙超载的影响。方法原代培养大鼠海马神经元细胞,分为4组:空白对照组、l-THP1μmol/L组、l-THP10μmol/L组、l-THP100μmol/L组。应用激光扫描共聚焦显微镜实时扫描,观测大鼠海马神经元胞内钙的荧光强度变化。结果在静息状态下(1～100)μmol/L左旋四氢巴马汀对胞内钙浓度([Ca2+]i)均无影响。左旋四氢巴马汀对60mmol/LKCl诱导的外钙内流引起的胞浆钙升高有抑制作用。对照组、1μmol/Ll-THP、10μmol/Ll-THP、100μmol/Ll-THP的峰值荧光强度增加分别为(64.3±2.8)%、(46.3±3.1)%、(34.2±1.5)%、(20.8±1.2)%(P0.05)。左旋四氢巴马汀对10mmol/LCaffeine诱导细胞内钙库的钙释放,引起的胞浆钙升高有抑制作用。对照组、lμmol/Ll-THP、10μmol/Ll-THP、100μmol/Ll-THP峰值荧光强度增加分别为(53.9±4.3)%、(48.2±3.9)%、(44.3±4.6)%、(35.5±3.2)%(P0.05)。结论左旋四氢巴马汀可以通过减轻损伤诱发的海马神经元细胞内钙超载程度来保护海马神经元。     

芹菜素对H2O2诱导人肝细胞L02氧化损伤模型的影响

目的探索芹菜素对H_2O_2致人肝细胞L02损伤模型的保护作用。方法以H_2O_2诱导L02细胞建立氧化损伤模型,CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA法检测细胞活性氧的生成,试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,试剂盒检测caspase-3的活性。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果芹菜素浓度为≥20μmol/L时对L02细胞的增殖有显著抑制作用(P值均001);与空白对照组L02细胞活力相比,500μmol/L及以上的H_2O_2浓度均可使细胞活力极显著降低(P值均0.001),500μmol/L为H_2O_2的建模浓度;模型组细胞活力与空白对照组相比差异显著(P0.01),与模型组相比,芹菜素5、10μmol/L组细胞存活率显著提高(P值均0. 01);空白对照组细胞状态较好,模型组细胞间收缩变圆,细胞破损变形严重,芹菜素5μmol/L组与模型组相比,明显得到改善,变圆破损细胞较少;空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间相对荧光强度比较差异有统计学意义(1. 00±026 vs 32.94±1. 29 vs 13. 49±1. 23, F=1.10,P0. 001),模型组相对荧光强度较空白对照组明显增强(P0. 001),芹菜素/L组与模型组比较,芹菜素可明显清除H_2O_2诱发的ROS(P0.001);模型组中LDH和MDA水平均明显升高,SOD水平明显降低,与正常对照组相比差异均有统计学意义(F值分别为3.21、2.03、3.32,P值均0. 05),芹菜素(5μmol/L)处理后,与模型组相比,LDH和MDA水平均明显降低,SOD水平明显升高(P值均0. 05);空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间细胞凋亡率比较差异有统计学意义(7. 54%±0. 52%vs 39. 77%±3. 44%vs 14. 40%±0. 79%,F=9.44,P 0. 01);模型组细胞凋亡率显著高于对照组(P 0. 01);给与芹菜素处理后,相比于模型组凋亡率明显降低(P0. 01);空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间caspase-3活性比较差异有统计学意义[(4. 38±0. 59)U/mg vs(16. 44±1. 13)U/mg vs(10. 60±1. 04)U/mg,F=1.17,P005],模型组细胞caspase-3活性与对照组相比明显增强(P 005),芹菜素处理后,相比于模型组caspase-3活性明显降低(P005)。结论芹菜素可能通过消除ROS的生成、降低caspase-3活性对H_2O_2诱导的L02细胞损伤产生保护作用。