酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因

乙型肝炎病毒(HBV )的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子,HBV诱导细胞恶性化的发病机制还未完全弄清,已有许多研究提示HBVX蛋白(HBxAg)对多种增强子及启动子有反式激活作用[1,2 ] ,在HBV诱导肝细胞癌的发生中起着重要作用。筛选肝细胞中与HBxAg结合的蛋白对探讨HBV致癌的细胞效应机制提供了重要线索。材料与方法一、材料及主要试剂AH10 9酵母菌株、预转化的cDNA肝文库(Y187)、pGBKT7 BD克隆载体及酵母YPD培养基、SD培养基、X αgal购于Clontech公司。大肠埃希菌DH5α及HBVayw亚型基因全序列质粒载体pCP10为本室保存…     

小儿急性白血病bcl—2、bax蛋白的表达及临床意义

目的：检测小儿急性白血病bcl-2、bax蛋白的表达，探讨其与临床诊治、预后的关系及两基因间的相互作用。方法：采用免疫细胞化学技术分析患儿骨髓单个核细胞bcl-2、bax蛋白的表达。结果：初治组bcl-2蛋白表达较CR一和正常组显著增高；bax表达显著降低；bcl－2表达与影响预后因素间无显著相关。结论：bcl-2抑调亡作用增强和bax促凋亡作用减弱在小儿白血病的发生发展中具有重要作用，bcl－2表达可能与疗有关，bcl-2、bax共同调控白血病细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白研究进展

鲍曼不动杆菌是医院获得性感染主要致病菌之一,其外膜蛋白是指肽聚糖外脂质双层中间镶嵌的一些特殊的蛋白质.CarO、33-to-36-kDa、OprD等外膜蛋白丢失与细菌耐药有关,而OmpA外膜蛋白是重要的致病因素.其研究技术分为提取、分离和鉴定3个方面,超声物理法、双向凝胶电泳、质谱技术及免疫印迹是目前常用技术.     

Ezrin蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨Ezrin蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义。方法采用流式细胞技术（FCM）检测58例大肠癌患者（肠癌组）癌组织及癌组织远端正常黏膜（对照组）的Ezrin蛋白表达,对Ezrin蛋白表达与大肠癌组织分化程度、淋巴结转移情况等相关因素进行分析。结果肠癌组Ezrin蛋白表达明显高于对照组（P〈0．01）：Ezrin蛋白表达与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位及癌组织分化程度均无统计学差异（P均〉0．05）,与有无淋巴结转移有统计学差异（P〈0．05）。结论Ezrin蛋白高表达提示癌组织的浸润、侵袭能力和淋巴结转移风险高,FCM检涮女肠癌绡织Ezdn罾白嘉扶可椎嘶怖床评估帛者而后冉钉新指标     

噬菌体展示技术在鼠CD137L活性研究中的应用

目的探讨噬菌体展示技术在鼠CD 137配体(CD 137L)活性研究中的应用。方法用PCR法扩增出鼠CD 137L胞外区,用噬菌体展示技术展示其CD 137L;EL ISA方法检测噬菌体CD 137L的抗原性,并分3次注射到大鼠体内,取血清检测大鼠体内多克隆抗体水平。结果PCR方法成功扩增出鼠CD 137L胞外区;获得重组子pCom b3H-CD 137L,成功展示在噬菌体上;噬菌体CD 137L可与抗CD 137L特异性结合;大鼠体内产生了CD 137L的多克隆抗体。结论噬菌体展示技术用于鼠CD 137L活性的研究,可提高制备特异性抗体的成功率,得到特定结构和功能的蛋白质。     

酵母双杂交法对HBV表面抗原主蛋白候选结合蛋白的筛选

目的:自肝细胞cDNA文库中筛选与HBV主蛋白(SHBs)相互作用的蛋白基因,探讨主蛋白的生物学功能.方法:利用PCR扩增S主蛋白基因,定向克隆技术将靶基因克隆到pDEST32构建出S主蛋白的诱饵质粒:Western blot方法验证转化诱饵质粒的酵母细胞表达SHBs:将诱饵质粒与人肝cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,在营养缺陷型培养基和X-gal上进行三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母茵落的猎物质粒进行DNA测序;利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:构建S主蛋白及肝文库酵母细胞表达载体,进行酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,筛选出既能在缺陷培养基也能在X-gal的检测下变成蓝色的真阳性菌落3个,分别为核糖体蛋白L3、微管蛋白α-1a和α-2巨球蛋白.结论:用酵母双杂交技术筛选出3个与SHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,提示SHBs可能参与到肝细胞内部的多种生物学反应.     

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBst167蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs^t167）具有相互作用的肝细胞蛋白，以探讨MHBs^t167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应（PCR）法扩增MHBs^t167研基因，应用酵母双杂交系统3，连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转染酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合，于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆，提取此酵母克隆的质粒转化DH5a大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA，酶切鉴定后进行测序，然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBs^t167酵母表达载体pGBKT7-MHBs^t167.筛选出阳性菌落28个，经生物信息学分析，最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBs^t167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸（ALDOB）、补体3（C3）、人类血清扩散因子（生长调节素B）、人类BAC（细菌人工染色体）克隆GSI一306C12。结论成功克隆出MHBs^t167基因并在酵母细胞中表达，应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBs^t167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因，根据所克隆到的基因，对以后研究MHBs^t167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。     

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白

目的以乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBV Pre-S2）为靶蛋白，寻找该蛋白相应的结合蛋白。方法应用噬菌体表面展示技术，以纯化的HBV前S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，对筛选克隆进行DNA序列分析，将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索，自GenBank中获得与HBV Pre-S2有结合作用蛋白的cDNA和基因组的全长序列，并用ELISA验证筛选的结合蛋白。结果噬菌体经过5轮生物富集后，将随机筛选的200个噬斑裂解液做PCR，得到120个插入片段长短不一的克隆，ELISA证实获得43个阳性克隆。将其PCR产物序列测定后进行同源搜索，初步确定30个人体肝脏中固有的与乙型肝炎病毒前S2蛋白结合的蛋白，其中含细胞色素P450Ⅰ类A型亚基克隆2个、3个PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白、2个细胞生长抑制蛋白42，1个膜联蛋白All转录变异体、3个转录激活因子5、2个α酸性糖蛋白、5个未知功能蛋白等。结论应用T7 cDNA噬菌体表面展示技术和生物信息学方法筛选并验证了HBV Pre-S2蛋白结合蛋白，为进一步研究Pre-S2蛋白的生物学功能提供新了思路。     

酵母双杂交技术筛选与克隆白细胞中与NS5ATP7蛋白结合的蛋白编码基因

目的 应用酵母双杂交体系寻找与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A反式激活蛋白7(human gene 5 transactivated by nonstructural protein 5A of hepatitis C virus,NS5ATP7)相互作用的白细胞蛋白,以探讨SN5ATP7的生物功能。方法 应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP7诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒。DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果 筛选出15个与NS5ATP7特异性相互作用的克隆,其中包括人类RhoGDF分裂抑制剂α、人类细胞色素b558a亚单位、人类MLL(MLL)基因外显子、人类S100钙结合蛋白A9(钙粒蛋白B)、人类移动抑制因子相关蛋白14变体E(S100A9)、人类金属硫蛋白2A、人类染色体序列及人类cDNA序列等,1个是未知功能基因。结论 初步克隆了NSSATP7与白细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究NS5ATP7的功能有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP7相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析

目的：利用酵母双杂交技术，业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因。为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性，阐明HCBP6的生物学功能，我们应用生物信息学技术，克隆猴HCBP6同源基因序列，并对其结构进行分析。方法：应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照，对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析。对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较。结果：猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570bp，编码产物HCBP6蛋白由189aa组成。猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96．27％、89．95％、85．7l％。结论：生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径。猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白．方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达．后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5α),并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析．结果:应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到7种已知基因,分别为ADP核糖基因子2种,RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4- NOT-10)1种,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种,醛缩酶B(ALDOB)1种,补体成分3(C3)1种,丙酮酸脱氢酶(PDH)1种．结论:成功克隆出MHBst结合蛋白．     

核素标记的抗肌凝蛋白抗体心肌显像技术在心肌炎诊断中的应用

作为“金标准”的心肌活检技术在心肌炎诊断中敏感性较低，而核素标记的抗肌凝蛋白抗体及其Ｆａｂ片段心肌显像技术作为一种非创伤性诊断心肌坏死的高敏感手段，可认成为可疑心肌炎患者做心肌活检前明确活检必要性的重要方法。     

恶性疟原虫热休克蛋白86(HSP86)基因置换型和插入型打靶载体的构建

目的 对恶性疟原虫热休克蛋白基因进行体外扩增,构建ＨＳＰ８６基因打靶载体,利用基因敲除技术进行恶性疟原虫热休克蛋白基因功能的研究。方法 恶性疟原虫体外培养,基因组ＤＮＡ提取,目的基因扩增,载体与目的片段连接、阳性克隆筛选及酶切鉴定。结果 经酶切鉴定ＰＣＲ产物及插入片段大小与预期值相符,进一步测序鉴定证实ＰＣＲ产物及插入片段为所需目的基因片段。插入片段经酶切鉴定证实插入方向正确。结论 成功构建了用于     

绿色荧光蛋白标记蜂毒肽的表达及其抗肝癌效应的初步评价

蜂毒是一种成分复杂的混合物，主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其他物质。在蜂毒的各个组分中，研究较多的是蜂毒溶血肽。蜂毒溶血肽又称蜂毒肽，最近研究表明蜂毒肽（Mel）具有较好的抗肝癌效应。Mel短肽一般直接从蜜蜂毒腺中分离或通过化学方法合成。本研究通过体外合成的Mel基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因进行融合，在大肠杆菌中实现高水平表达，得到纯度和产率满意的Mel-EGFP融合蛋白，并显示明显的抗肝癌效应，现将研究结果报道如下。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

Expression of hepatitis B virus X protein in transgenic mice

AIM: To establish a mice model harboring hepatitis B virus x gene (adr subtype) for studying the function of hepatitis B virus X protein, a transactivator of viral and cellular promoter/enhancer elements. METHODS: Expression vector pcDNA3-HBx, containing CMV promoter and hepatitis B virus x gene open reading fragment, was constructed by recombination DNA technique. Hela cells were cultured in DMEM and transfected with pcDNA3-HBx or control pcDNA3 plasmids using FuGENE6 Transfection Reagent. Expression of pcDNA3-HBx vectors in the transfected Hela cells was confirmed by Western blotting. After restriction endonuclease digestion, the coding elements were microinjected into male pronuclei of mice zygotes. The pups were evaluated by multiplex polymerase chain reaction (PCR) at genomic DNA level. The x gene transgenic mice founders were confirmed at protein level by Western blotting, immunohistochemistry and immunogold transmission electron microscopy. RESULTS: Expression vector pcDNA3-HBx was constructed by recombination DNA technique and identified right by restriction endonuclease digestion and DNA direct sequencing. With Western blotting, hepatitis X protein was detected in Hela cells transfected with pcDNA3-HBx plasmids, suggesting pcDNA3-HBx plasmids could express in eukaryotic cells. Following microinjection of coding sequence of pcDNA3-HBx, the embryos were transferred to oviducts of pseudopregnant females. Four pups were born and survived. Two of them were verified to have the HBx gene integrated in their genomic DNA by multiplex PCR assay, and named C57-TgN(HBx)SMMU1 and C57-TgN(HBx)SMMU3 respectively. They expressed 17KD X protein in liver tissue by Western blotting assay. With the immunohistochemistry, X protein was detected mainly in hepatocytes cytoplasm of transgenic mice, which was furthermore confirmed by immunogold transmission electon microscopy. CONCLUSION: We have constructed the expression vector pcDNA3-HBx that can be used to study the function of HBx gene in eukaryotic cells in vitro. We also established HBx gene (adr subtype) transgenic mice named C57-TgN (HBx)SMMU harboring HBx gene in their genome and express X protein in hepatocytes, Which might be a valuable animal system for studying the roles of HBx gene in hepatitis B virus life cycle and development of hepatocellular carcinoma in vivo.     

增强型绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫成虫体内的瞬时表达

目的探讨异源性增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫成虫体内表达的可能性。方法运用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1导入日本血吸虫成虫体内,提取分离体外培养48小时成虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、RT-PCR和Western blot验证转基因在成虫体内的存在、转录和翻译。同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在成虫体内进行定位。结果PCR和RT-PCR分别成功的扩增出760bp和276bp的预期大小的片断,Western-blot证实了EGFP基因在成虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察到,EGFP主要定位在成虫的皮层,口吸盘和尾部尤为明显。结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫成虫体内并获得表达,为转基因血吸虫和基因功能的研究打下基础。     

Study of transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus and cloning of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization

AIM: To investigate the transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus (HBV) and construct a subtractive cDNA library of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization (SSH) technique, and to pave the way for elucidating the pathogenesis of HBV infection. METHODS: pcDNA3.1(-)-pre-S2 containing pre-S2 region of HBV genome was constructed by routine molecular methods. HepG2 cells were cotransfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ and empty pcDNA3.1(-)/pSV-lacZ. After 48 h, cells were collected and detected for the expression of β-galactosidase (β-gal). SSH and bioinformatics techniques were used, the mRNA of HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 and pcDNA3.1(-) empty vector was isolated, respectively, cDNA was synthesized. After digestion with restriction enzyme RsaI, cDNA fragments were obtained. Tester cDNA was then divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, amplified cDNA fragments were subcloned into pGEM-Teasy vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E.coli strain DH5oα. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR. RESULTS: The pre-S2 mRNA could be detected in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 plasmid. The activity of β-gal in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ was 7.0 times higher than that of control plasmid (P<0.01). The subtractive library of genes transactivated by HBV pre-S2 protein was constructed successfully. The amplified library contains 96 positive clones. Colony PCR showed that 86 clones contained 200-1 000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 50 clones randomly, and the full length sequences were obtained with bioinformatics method and searched for homologous DNA sequence from GenBank, altogether 25 coding sequences were obtained, these cDNA sequences might be the target genes transactivated by pre-S2 protein. CONCLUSION: The pre-S2 protein of HBV has transactivating effect on SV40 early promoter. The obtained sequences may be target genes transactivated by pre-S2 protein among which some genes coding proteins involved in cell cycle regulation, metabolism, immunity, signal transduction and cell apoptosis.This finding brings some new clues for studying the biological functions of pre-S2 protein and further understanding of HBV hepatocarcinogesis.