hHGF转染HepG2细胞后基因表达谱差异筛选

目的:构建hHGF真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,筛选其对HepG2细胞的差异表达基因.方法:构建pcDNA3.1(-)-hHGF载体,测序鉴定:转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:运用基因表达谱芯片技术,筛选pcDNA3.1(-)-hHGF和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,经表达谱芯片分析差异表达基因.结果:构建的表达载体经酶切和测序确定;转染HepG2细胞后hHGF表达经蛋白免疫印迹证实;经20000个基因的表达谱芯片分析发现,其中有430个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:筛选出HGF转染HepG2细胞后的差异表达基因,对其在肝细胞中多种作用机制研究提供了重要依据.     

基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNase H结构域蛋白(HBV DNA P-RNase H, RNase H)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNase H对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3.1(-)-RNase H,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA 3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果:RNase H表达质粒转染的细胞有222条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调.结论:应用基因芯片成功筛选了RNase H转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNase H的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

HCV核心基因转染HepG2细胞后基因表达差异筛选

目的将真核表达载体pcDNA3.1(-)HCV core转染到HepG2细胞,在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白,并筛选其中的差异表达基因。方法将构建的真核表达载体pCDNA3.1(-)HCVcore转染HepG2细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)HCVcore和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的真核表达载体经双酶切鉴定;转染HepG2细胞后HCV核心蛋白表达经蛋白免疫印迹证实;经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是181个和48个。结论筛选HCV核心基因转染HepG2细胞后的糖类和脂类物质代谢相关的差异表达基因,从而为丙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据。     

应用基因芯片技术对乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节基因的研究

目的应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAP)三个功能域[(N末端蛋白(TP),逆转录酶DNA多聚酶(PR),核糖核酸酶H(RNaseH)]的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明HBVDNAP对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法以常规分子生物学技术分别构建真核表达载体pcDNA3.1()TP,pcDNA3.1()PR和pcDNA3.1()RNaseH,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1()的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果TP有111条基因表达水平上调,88条基因表达水平下调。PR有79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。RNaseH有113条基因表达水平上调,109条基因表达水平下调。结论应用基因芯片成功筛选HBVDNAP三个功能域蛋白转染细胞后的差异表达基因,为进一步研究HBVDNAP的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。     

乙型肝炎病毒e抗原与核心抗原调节靶基因的比较

目的利用基因表达谱芯片技术筛选、比较乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原调节靶基因。方法利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆HBeAg和HBcAg的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-HBeAg和pcDNA3.1-HBcAg脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型。结果对于2个基因转染细胞系差异表达基因谱的分析,HBeAg和HBcAg共同上调的基因1条;HBeAg和HBcAg共同下调的基因1条;未发现HBeAg上调,而HBcAg下调;或HBeAg下调,而HBcAg上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到HBeAg的调节,或只受到HBcAg的调节。结论应用基因表达谱芯片技术对于HBeAg和HBcAg反式调节的靶基因进行分析,可以发现HBeAg和HBcAg可引起体内多个系统相关的基因表达改变,两者在体内所调节的基因种类方面还有很大差异。     

HBV pre-X转染HepG2细胞后差异表达基因的筛选

目的:检测HBV Pre-X在真核表达栽体PcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X转染的HepG2细胞中的表达,并筛选其中的代谢相关差异表达基因.方法:将构建的真核表达载体pcDNA3.1-mychis-HBV pre-X转染HepG2细胞后蛋白免疫印迹检测:将pcDNA3.1-myc-his-HBV pre-X和pcDNA3.1-myc-his载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA后逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因.结果:构建的真核表达载体经ApsI、BstXI双酶切鉴定,转染HepG2细胞后HBV pre-X表达经蛋白免疫印迹证实:经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是200个和62个.结论:筛选HBV pre-X转染HepG2细胞后的代谢相关差异表达基因,从而为乙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据.     

Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。     

应用基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒HBsAg基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片技术研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响.方法设计并合成HBsAg主蛋白基因序列特异性的引物,以含有HBV全基因组的质粒G376 A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HBsAg蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达栽体pcDNA3.1(-)-HBsAg.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,29个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了HBsAg转染细胞后差异表达的基因,为深入研究HBsAg可能的生物学功能提供依据.     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的下调基因

目的筛选与克隆乙型肝炎表面抗原大蛋白(LHBs)的下调基因,以阐明HBV感染相关性疾病的分子生物学机制.方法应用常规分子生物学方法,克隆LHBs基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-LHBs.将pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.分别以pcDNA3.1(-)-LHBs以及pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并逆转录为cDNA,来源于pcDNA3.1(-)-LHBs转染细胞的cDNA为驱动(driver),来源于pcDNA3.1(-)的cDNA为测试(tester),进行抑制性消减杂交分析,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆进行测序及同源性分析.结果 ①成功构建pcDNA3.1(-)-LHBs真核表达载体;②pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染HepG2细胞的CAT表达活性较对照组的活性明显下降(P＜0.01),抑制率达93.9%;③成功构建人LHBs下调基因的cDNA消减文库.通过生物信息学分析获得14种编码基因.结论 LHBs是HBV基因组编码的一种反式调节因子,可以下调SV40早期启动子的活性.筛选到的LHBs下调的cDNA全长序列,包括与抗氧化防御、细胞生长调节、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,以此可以推测LHBs存在的调控机制以及HBV的致病(癌)机制.     

应用表达谱芯片技术筛选HBeAg反式调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg反式调节基因，了解其在体内的调节功能线索及机制。方法 以分子生物学技术构建HBeAg的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HBeAg，转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析。结果 HBeAg表达质粒pcDNA3．1(-)-HBeAg经酶切鉴定和DNA测序鉴定正确。经基因表达谱芯片分析，5种基因的表达水平上调，7种基因的表达水平下调。结论 筛选到一些与细胞信号传导、免疫调节、蛋白翻译合成、肿瘤、神经系统发生相关的HBeAg反式调节的靶基因。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的应用表达谱基因芯片技术，研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白1(SBP1)反式调节基因，阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成SBP1基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增SBP1基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误。提取高质量的mRNA，逆转录为cDNA，进行cDNA芯片分析。在1152个基因容量的表达谱芯片的筛选中，发现有12个基因表达水平显著上调，6个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选XTP6基因转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP6的表达对肝母细胞瘤系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP6蛋白可能的分子生物学功能.方法设计并合成XTP6基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP6基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP6编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析.结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析的DNA序列测定,证实准确无误.提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现21个基因表达水平显著上调,18个基因表达水平显著下调.结论应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP6转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP6蛋白可能的生物学功能提供依据.     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

表达HBeAg和HBsAg对HepG2细胞系细胞因子分泌及ACE活性的影响

目的:观察HBeAg和HBsAg对人肝癌细胞系 HepG2细胞中血管紧张素转化酶(ACE)分泌的影响．方法:利用本所既往构建的表达乙肝病毒 (HBV)表面抗原和E抗原的真核表达载体 pcDNA3．1(-)-HBsAg、pcDNA3．1(-)-HBeAg 及空载体pcDNA3．1(-)转染HepG2细胞,观察转染24,48 h后细胞上清中ACE活性和炎性细胞因子IL-6、IL-8的变化．培养细胞上清液内 ACE活性采用底物裂解法检测;IL-6、IL-8浓度采用流式细胞仪检测．结果:转染48 h的HepG2细胞裂解液中检测到了HBsAg和HBeAg的表达,但二者细胞上清中的ACE与转染空载体对照pcDNA3．1(-)细胞上清中的ACE无显著差异;同样,炎性因子 IL-6和IL-8也没有显著差异．结论:HBV HBsAg和HBeAg对ACE活性、 IL-6和IL-8不具有显著的上调或下调作用; HBsAg和HBeAg在肝纤维化发生过程中的作用机制尚待进一步阐明．     

基因表达谱芯片技术筛选XTP1基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP1基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP1基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-XTP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为eDNA,与转染空表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和。DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有3个基因表达水平显著上调,24个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP1蛋白可能的生物学功能提供依据。