淡色库蚊rDNA-ITS2基因的克隆分析

目的克隆并鉴定淡色库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因并应用于现场孽生蚊媒的种属鉴定,从而为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。方法设计淡色库蚊诊断性引物分别对淡色库蚊实验室标准株及从现场采集的蚊虫的rDNA-ITS2序列进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pGEM-Teasy载体上并转化到DH5α菌中,然后对其进行DNA序列测定及分析。结果成功克隆了淡色库蚊的rDNA-ITS2基因。序列分析结果表明,实验中所克隆到的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列与GenBank所登录的淡色库蚊的rDNA-ITS2序列同源性均为98%以上,同时发现孽生现场存在淡色库蚊。结论rDNA-ITS2序列在淡色库蚊中具有种属特异性,可为孽生现场的蚊媒预警提供分子生物学依据。     

基于核糖体 DNA 第二内转录间隔区基因的 9 种蚊虫分子鉴定

目的 分析常见 9 种蚊虫核糖体 DNA 第二内转录间隔区( rDNA-ITS2 )基因序列特征,为蚊虫种类分 子鉴定方法探讨提供依据。 方法 在山东省济宁市采集淡色库蚊、三带喙库蚊、二带喙库蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中 华按蚊、骚扰阿蚊、常型曼蚊和黄色柯蚊成蚊,形态学种类鉴定后,提取上述 9 种蚊虫 DNA,PCR 扩增 rDNA-ITS2 基 因并测序;在 GenBank 中进行同源性比对,采用 Bioedit 7. 0 软件及 DNAMAN 软件对测序结果进行比对分析,通过 DNASTAR、ClustalX 1. 81 和 Mega6 软件分析列特征并构建系统进化树探讨系统发生关系。 结果 9 种蚊虫的 rDNA- ITS2 长度在 343 bp 与 577 bp 之间,共有 59 个保守位点、449 个变异位点、235 个简约信息位点和 191 个单态位点,9 种蚊虫种间序列同源性为 28. 21% ~ 53. 76%;所有蚊虫的 rDNA-ITS2 基因分子鉴定与形态学鉴定吻合率 100%,库 蚊属的淡色库蚊、三带喙库蚊和二带喙库蚊聚成一类,伊纹属的白纹伊蚊和刺扰伊蚊聚成一类,不同种蚊虫为独立 分支。 结论 核糖体 DNA 第二内转录间隔( rDNA-ITS2 )基因可用于蚊虫属和种的鉴定。     

基于mtDNA?COⅠ基因的山东省蚊种群遗传多样性分析

目的　探讨山东省不同地理株及实验室不同抗性品系淡色库蚊及5种常见蚊种的线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA?COⅠ）基因序列特征,分析其遗传多样性。方法　采用山东省济南、济宁、青岛等地现场采集及实验室选育的淡色库蚊成蚊,以济宁市现场采集的5种蚊（淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊）作为样本,PCR扩增mtDNA?COⅠ基因并测序,分析序列特征并构建系统进化树。结果　PCR特异扩增8个不同地理株及4个实验室抗性品系的淡色库蚊mtDNA?COⅠ区域,获得长度均为528 bp的扩增片段,A+T含量为67.4%,存在两个变异位点。不同地理株淡色库蚊mtDNA?COⅠ基因同源性为99.95%,不同抗性品系淡色库蚊基因序列相同,所有蚊虫COⅠ基因具有高度保守性。5种常见蚊虫的mtDNA?COⅠ基因片段长度均为528 bp,有408个保守位点,120个变异位点,42个简约信息位点,78个单态位点,A+T含量为65.7%～68.0%,同源性分析发现蚊种间基因同源性为86.17%～92.05%,所有蚊虫的COⅠ基因分子鉴定与其形态学相吻合。系统进化关系显示,同种和同属之间呈明显的聚集,但阿蚊属成单独的分支,与其他蚊种亲缘关系较远。结论　线粒体COⅠ作为不同地理株及实验室不同品系淡色库蚊的遗传进化分子标记不够理想,但该基因具有种间和属间特异性,可用于蚊虫属和种的区分。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及序列分析

目的 从白纹伊蚊基因组DNA中获得乙酰胆碱酯酶（AchE)基因片段及其DNA序列。方法 根据已知的果蝇和斯氏按蚊AchE氨基酸序列保守区域设计一对简并引物，利用简并引物对白纹伊蚊AchE基因片段进行扩增。PCR产物经T／A克隆，α互补筛选法筛选，碱裂解法提取出重组质粒DNA,并对之进行酶切鉴定和PCR鉴定。对重组质粒的阳性克隆进行DNA是序，利用互联网和PCGENE软件与部分已知物的AchE氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出AchE基因片段，其核酸序列共394bp，根据内含子特性确定内含子位置后，所得基因的氨基酸序列共107个氨基酸残基，并含有AchE的特征性保守序列FGESAG。同源性分析表明，其与埃及伊蚊相应片段的同源性最高（96％），其次为斯氏按蚊（87％），与黑腹果蝇则较低（69％）。结论 从白纹伊蚊敏感株中获得了AchE基因片段，DNA序列及其特征。该片段与埃及伊蚊相应片段同源性最高。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及序列分析

目的　从白纹伊蚊基因组 DNA中获得乙酰胆碱酯酶 ( Ach E)基因片段及其 DNA序列。　方法　根据已知的果蝇和斯氏按蚊 Ach E氨基酸序列保守区域设计一对简并引物 ,利用简并引物对白纹伊蚊 Ach E基因片段进行扩增。PCR产物经 T/ A克隆 ,α互补筛选法筛选 ,碱裂解法提取出重组质粒 DNA,并对之进行酶切鉴定和 PCR鉴定。对重组质粒的阳性克隆进行 DNA测序 ,利用互联网和 PCGENE软件与部分已知物种的 Ach E氨基酸序列进行同源性分析并构建进化系统树。　结果　从白纹伊蚊基因组 DNA中扩增出 Ach E基因片段 ,其核酸序列共 394bp,根据内含子特性确定内含子位置后 ,所得基因的氨基酸序列共 10 7个氨基酸残基 ,并含有 Ach E的特征性保守序列 FGESAG。同源性分析表明 ,其与埃及伊蚊相应片段的同源性最高 ( 96 % ) ,其次为斯氏按蚊 ( 87% ) ,与黑腹果蝇则较低 ( 6 9% )。　结论　从白纹伊蚊敏感株中获得了 Ach E基因片段、DNA序列及其特征。该片段与埃及伊蚊相应片段同源性最高。     

三种蚊虫COII基因的克隆与序列分析

目的　测定和比较中华按蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊细胞色素C氧化酶亚基II(COII)基因全序列 ,分析 3种蚊虫之间及与其它几种蚊虫的COII基因序列的同源性。方法　运用T A克隆技术分别获得 3种蚊虫的COII基因重组质粒 ,并进行DNA测序和结构分析。结果　 3种蚊虫COII基因的核苷酸序列同源性为 84.1%～87.9% ,氨基酸序列的同源性为 85 .1%～ 89.5 % ;C +G含量为 2 3 .2 %～ 2 4.9% ,颠换频率高于转换频率。结论　基因序列同源性比较结果显示 :在COII分子结构 ,白纹伊蚊与致倦库蚊具有更近的亲缘关系。     

白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因片段克隆及各发育期转录水平分析

目的克隆白纹伊蚊(Aedes albopictus)RNA干扰通路相关AGO2和Dcr-2基因片段,并分析该蚊种不同发育阶段这2个基因片段的转录水平。方法根据埃及伊蚊(Ae.aegypti)AGO2和Dcr-2蛋白的氨基酸序列保守区设计简并引物,经RT-PCR从白纹伊蚊雌蚊总RNA中分别扩增AGO2和Dcr-2 cDNA,并与载体pMD18-T连接,转染大肠埃希菌(E.coli)后,筛选阳性克隆,测序并做Blastx分析。根据获得的白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因片段设计特异性引物,采用半定量RT-PCR分析白纹伊蚊卵、Ⅰ/Ⅱ龄幼虫、Ⅲ/Ⅳ龄幼虫、蛹、雄蚊和雌蚊中这2个基因的mRNA水平。结果获得的AGO2和Dcr-2 cDNA片段大小分别为326 bp和491 bp,登录号分别为JQ764670和JQ764671。Blastx分析结果显示,该2个序列编码的氨基酸序列与埃及伊蚊的AGO2和白纹伊蚊的Dcr-2氨基酸序列的同源性分别为91%和98%。AGO2和Dcr-2基因在白纹伊蚊不同发育阶段中均有转录,于雌蚊中的mRNA水平最高,分别为雄蚊中mRNA的3.1倍和15.5倍,显著高于其他各阶段的mRNA水平(P<0.05)。结论获得了白纹伊蚊AGO2和Dcr-2基因部分cDNA片段,并发现这2个基因在雌蚊中转录水平最高。     

我国部分地区28种蚊虫的线粒体COⅠ基因序列分析

目的分析我国部分地区28种蚊虫的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrion cytochrome c oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因序列,探讨其作为蚊虫分子标记的应用潜力。方法 2015年3月至2016年10月在我国海南、广东、广西、云南、福建、浙江、河南、山西、天津、内蒙古、吉林和黑龙江等12省(自治区、直辖市)的蚊虫孳生地采集幼虫,室内饲养至羽化成蚊,在蚊虫栖息地和蚊虫监测点,采用灯诱法和人诱法采集成蚊。所有成蚊经形态学鉴定后,提取单只蚊虫基因组DNA,采用国际双翅目通用引物PCR扩增并克隆线粒体COⅠ基因5′端片段,并进行测序。所得COⅠ基因序列上传Gen Bank获取登录号。序列通过Clustal1.83和MEGA5.05软件进行多序列比对,用DNAMAN9.0软件分析同源性。采用Mega5.05软件进行序列特征分析、计算遗传距离。每种蚊虫随机选择1~4条线粒体COⅠ基因序列,采用邻接法(NJ)构建系统发育进化树。结果共采集3亚科6属28种301只蚊虫,分别为伊蚊属(Aedes)的白纹伊蚊(Ae.albopictus)等5种、按蚊属(Anopheles)的中华按蚊(An.sinensis)等6种(亚种)、库蚊属(Culex)的二带喙库蚊(Cx.bitaeniorhynchus)等14种(亚种)、阿蚊属(Armigeres)的骚扰阿蚊(Ar.subalbatus)、曼蚊属(Mansonia)的常型曼蚊(Ma.uniformis)和巨蚊属(Toxorhynchites)的华丽巨蚊(Tx.splendens)。PCR扩增结果显示,28种蚊虫线粒体COⅠ基因的长度约711 bp,经多序列比对排齐后长度为651 bp。不同种别蚊虫的线粒体COⅠ序列同源性范围为97.85%~99.97%。种内K2P遗传距离为0.15%~2.89%,属内种间遗传距离为0.25%~14.50%。其中,按蚊属6种蚊虫COⅠ序列存在153个变异位点,131个简约信息位点,T+A平均含量为67.70%;编码的217个氨基酸残基中保守氨基酸206个(占94.9%);6种蚊虫的核苷酸同源性为98.31%~99.72%,种内K2P遗传距离为0.41%~1.56%,种间K2P遗传距离为1.07%~14.50%。28种蚊虫(60条)COⅠ序列的系统发育树分析结果显示,种团内近缘种(尖音库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊)聚在一起,但近缘种之间未完全隔开;白跗按蚊(An.albitarsis)和迷走按蚊(An.vagus)聚在一起,其余23种蚊虫分别以种为单位聚在一起。结论基于线粒体COⅠ基因的分子标记可以区分捕获蚊虫的部分蚊种,但尚未能有效及准确地区分近缘种。     

白纹伊蚊AL-100 30 ku蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku蛋白基因,并构建其原核表达载体。方法RT-PCR克隆白纹伊蚊主要过敏原AL-100 30 ku的全长基因,设计简并引物,扩增白蚊伊蚊30ku的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体。结果成功克隆白纹伊蚊主要过敏原30ku基因并构建其原核表达载体。该基因含有长度为816bp的开放阅读框,编码271个氨基酸。该蛋白质的分子质量单位为28.33ku,等电点为4.04,编码序列与数据库中已知的白纹伊蚊30ku基因的同源性为99％。结论成功克隆了白蚊伊蚊主要过敏原30ku基因并构建了原核表达载体,为白纹伊蚊主要过敏原30ku蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础。     

山东省淄博市淄川区淡色库蚊kdr等位基因突变研究

目的　了解山东省淄博市淄川区淡色库蚊（Culex pipiens pallens）季节消长趋势及蚊虫击倒抗性（Knockdown resistance, kdr）相关钠通道基因多态性分布特征。方法　于2017–2018年蚊媒活动高峰期，使用诱蚊灯法对山东省淄博市淄川区进行蚊虫种群和密度调查，提取淡色库蚊DNA，通过PCR检测kdr等位基因突变类型和频率。结果　在山东省淄博市淄川区共捕获830只蚊虫，包括淡色库蚊、骚扰阿蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊、中华按蚊和三带喙库蚊6种，其中淡色库蚊占83.13%，密度为12.32只/（台·夜）；淡色库蚊全年密度监测曲线呈双峰趋势，高峰出现在6月和9月。在kdr基因1 014位点共检测发现5种kdr等位基因类型，包括TTA（75.71%）、TTT（10.00%）、CTA（5.71%）、TCA（4.29%）、TTC（4.29%），同时发现2种核苷酸非同义突变，即亮氨酸（L1014）突变为苯丙氨酸（L1014F）、丝氨酸（L1014S）。罗村镇、太河镇两地淡色库蚊kdr基因突变频率分别为10.53%、40.63%，差异具有统计学意义（[χ2] = 8.559，P = 0.003）。结论　淡色库蚊为山东省淄博市淄川区优势蚊种。本研究首次在淡色库蚊中检测发现CTA、TTC两种kdr等位基因突变，kdr基因型呈多态性。