蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素特异性多克隆抗体的制备及免疫电镜定位研究

目的制备针对蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素的特异性抗体,免疫胶体金电镜观察该贾第素的亚细胞定位。方法生物信息学分析并合成α-4贾第素抗原肽,与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫新西兰白兔,Protein A亲和层析纯化抗血清,采用α-4贾第素重组蛋白和贾第虫滋养体全虫体裂解物通过Western blot验证抗血清结合力和结合特异性,选择高特异性抗体通过免疫胶体金电镜观察α-4贾第素的亚细胞定位。结果筛选出3段可能的抗原肽,合成的抗原肽与KLH偶联后免疫兔得到高效价抗血清,Protein A纯化效果良好;3种纯化抗血清均能与α-4贾第素结合,其中anti-P2具有较高的抗原结合特异性。采用anti-P2进行免疫胶体金电镜,显示α-4贾第素主要定位于鞭毛,胞浆也有少量散在表达。结论制备的α-4贾第素多克隆抗体具有抗原结合特异性。用anti-P2进行免疫胶体金电镜,α-4贾第素主要定位于贾第虫鞭毛。     

基于微波法快速合成胶体金建立猴痘病毒抗原免疫层析试纸条半定量方法

目的 建立猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A35R蛋白现场快速半定量检测胶体金免疫层析方法。方法 以微波法6 min快速合成金纳米颗粒(Gold nanoparticles, AuNPs)作为标记物，基于双抗体夹心法体系建立检测MPXV A35R蛋白的免疫层析试纸方法。利用真核系统表达的MPXV包膜成分A35R蛋白配制系列浓度标准液，初步评价胶体金免疫层析试纸条的敏感性、特异性及稳定性等检测性能。结果 20 min内完成检测，建立MPXV抗原的胶体金免疫层析试纸的半定量检测的灵敏度达到62.5 pg/mL,肉眼最低检测限是125 pg/mL。与登革病毒(Dengue virus, DENV)、诺如病毒(Norovirus, NV)均无交叉反应，稳定性良好。结论 本研究建立的胶体金半定量免疫层析试纸条可以实现对MPXV的快速灵敏检测，在MPXV的即时检测(Point of care testing, POCT)领域具有一定潜力。     

布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。     

免疫金银染色法对华支睾吸虫病人血清中抗体的检测

胶体金(Colloidal-gold)能和许多生物大分子结合,形成胶体金探针,与相应抗原(或抗体)形成抗原抗体复合物,经过银显影处理后,使金颗粒周围吸附大量银颗粒,在光镜下即可见到黑褐色的金银颗粒。八十年代以来金标记技术发展很快,可以检测单一或多种抗原,与细胞化学、免疫细胞化学相结合,应用于光镜和电镜的许多领域,上海免疫研究所利用免疫     

日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关蛋白rSj338的免疫细胞化学定位

目的　应用免疫电镜技术观察日本血吸虫线粒体相关蛋白rSj338在成虫组织细胞中的分布和定位。 方法　收集新鲜的日本血吸虫成虫 ,常规固定、包埋 ,制备日本血吸虫成虫超薄冷冻切片。用纯化的抗rSj338单特异多克隆抗体为一抗 ,同时 ,以正常兔血清作阴性对照 ;以直径为 10nm胶体金颗粒标记的蛋白A进行定位 ,进行组织化学反应 ,透射电镜观察日本血吸虫线粒体相关蛋白rSj338在成虫组织细胞中的分布和定位。 结果　高密度胶体金颗粒主要分布于日本血吸虫线粒体外膜上 ,在线粒体的嵴上也见分布。结论　rSj338蛋白确为日本血吸虫线粒体相关蛋白 ,与采用BLAST网分析结果同源性一致     

检测日本血吸虫抗体的胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒研制

目的研制胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒用于检测日本血吸虫抗体。方法通过不同筛目尼龙绢和低频超声等方法,制备、纯化日本血吸虫可溶性虫卵抗原,研制胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒。用该试剂盒检测人血清中日本血吸虫特异性抗体,并用ELISA方法进行平行比较。结果胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒检测慢性血吸虫病的敏感性为93%,检测急性血吸虫病的敏感性为100%,检测健康人血清的特异性为96%,检测肺吸虫病的交叉反应为40%,对其他寄生虫和乙肝未见有交叉反应。与ELISA检测结果比较,两种方法具有良好的一致性。结论胶体金-葡萄球菌A蛋白试剂盒具有快速、简便、不需要仪器、敏感性高和特异性强等优点,可广泛用于血吸虫病流行区现场查病。     

全反式维甲酸对糖尿病肾病肾小球p-cadherin表达的影响

目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对糖尿病肾病(DN)肾小球p-cadherin表达的影响,明确其对肾脏的保护作用.方法 应用链脲佐菌素(STZ)建立DN大鼠模型.ATRA治疗组(n=10)给予ATRA每天20 mg/kg灌胃,对照组(C组,n=10)、DN组(n=10)以等量蒸馏水灌胃.采用ELISA法检测大鼠24 h尿液中白蛋白及肌酐值;免疫组织化学和胶体金免疫电镜法观察p-cadherin蛋白表达的部位及数量;RT-PCR法检测p-cadherin mRNA表达. 结果 ATRA组肾重及尿白蛋白/尿肌酐比值较DN组明显下降(P＜0.01).免疫组化检测结果示ATRA组p-cadherin蛋白表达较DN组上调,与C组相比无明显下降.电镜结果示DN组免疫金染色的p-cadherin蛋白较C组减少.RT-PCR结果示ATRA组p-cadherin mRNA表达较DN组上调,与C组无明显差异.结论 ATRA可逆转DN大鼠早期DN肾小球足细胞p-cadherin蛋白的下调,由此降低早期DN尿白蛋白排泄量,延缓DN进展.     

乳酸菌对肠上皮细胞侵袭性大肠杆菌损伤的保护作用

目的:研究肠上皮细胞(Caco-2)在侵袭性大肠杆菌(entcroinvasivc Eschenchia coli,EIEC)感染后,紧密连接(TJ)相关蛋白表达的改变及乳酸菌对Caco-2细胞的保护作用机制.方法:将Caco-2感染模型分为正常组、感染组、乳酸菌处理组和庆大霉素处理组.采用免疫金标记及电镜观察上皮细胞间TJ的位置和超微结构.免疫荧光观察TJ相关蛋白(Claudin-1,Occludin,JAM-1,ZO-1)及F-actin的表达分布和超微结构变化.结果:紧密连接结构位于相邻上皮细胞间的顶端,间隙大小约25-38 nm.EIEC感染后,免疫胶体金定位不清,细胞骨架F-actin遭到破坏、相邻Caco-2细胞间TJ结构遭到破坏,TJ相关蛋白(Claudin-1蛋白,Occludin蛋白,JAM-1蛋白,ZO-1蛋白)的表达亦减少,而乳酸菌处理后F-actin的表达明显增多,可减轻EIEC引起的TJ结构受损,TJ相关蛋白的表达增多.结论:EIEC感染导致Caco-2细胞细胞骨架F-actin、TJ相关蛋白的表达和分布发生改变.乳酸菌可以明显抑制EIEC引起的单层细胞TJ结构和相关蛋白的破坏,并改善细胞骨架的分布表达.     

纳米细菌的免疫电镜检测

目的:介绍一种有效鉴别纳米细菌的金标记免疫电镜方法方法:纳米细菌经25 g／L戊二醛固定、树脂包埋后,用钻石刀制成超薄切片,用纳米细菌特异性抗体进行间接金标免疫电镜染色．结果:纳米细菌经负染后于透射电镜下观察,呈球形或短棒状颗粒,大小约为80-350 nm．纳米细菌可以和特异性抗体结合,在电镜下表现为胶体金颗粒的附着．结论:采用免疫电镜的方法,在较好地显示纳米细菌超微结构的同时,又可以指示其独特的抗原性．     

Sj43B基因编码蛋白的日本血吸虫虫体组织定位

目的确定Sj43B基因编码蛋白在日本血吸虫成虫体内组织及亚细胞水平定位。方法取新鲜日本血吸虫成虫标本,按电镜生物样品制备方法常规固定、包埋,制成超薄切片,与鼠源纯化的抗重组Sj43B基因编码蛋白的IgE抗体(对照组试验为正常鼠血清)反应,再与大鼠抗小鼠IgE的IgG抗体结合,最后与蛋白A-胶体金连接,透射电镜下观察胶体金颗粒的分布。结果用正常鼠血清处理虫体切片,从皮层、肌层到皮层细胞体,未见有明显的电子致密的胶体金颗粒分布。用特异性IgE抗体处理的样品上,胶体金颗粒分布较广泛,见于皮层、肌层、胞质、核膜和核质内。结论Sj43B基因编码蛋白在血吸虫成虫体内的分布无组织和亚细胞结构特异性。     

胶体金免疫层析法与化学发光法在心肌梗死诊断中的价值比较

目的比较胶体金免疫层析法与化学发光法检测心肌标志物在诊断心肌梗死(MI)中的应用价值。方法收集MI住院患者98例,采用化学发光法与胶体金免疫层析法检测患者心肌标志物肌钙蛋白(c Tn)I、肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,计算胶体金免疫层析法灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、正确指数。结果胶体金免疫层析法与化学发光法相关性分析,c Tn I、Mb、CK-MB的相关系数依次为0.607、0.647、0.481(P<0.05)。c Tn I、Mb、CK-MB阳性率在两种检测方法中无统计学差异(P>0.05)。胶体金免疫层析法检测c Tn I、Mb、CK-MB灵敏度依次为88.16%、88.41%、83.78%,特异度依次为77.27%、79.31%、66.67%。结论胶体金免疫层析法检测心肌标志物方便快捷,灵敏度高。     

淀粉样肽前体蛋白片段免疫改善糖尿病小鼠脑内β淀粉样肽类蛋白的表达

目的　探讨用 β淀粉样肽前体蛋白 (APP)中的某些肽段免疫小鼠可否减轻小鼠脑内 β淀粉样肽 (Aβ)及其前体蛋白 (APP)的表达。方法　分别用 APP中的 31 9- 335肽段 (APP1 7肽 )、597- 62 4肽段 (APP2 8肽即 Aβ1 - 2 8)免疫小鼠 ,APP1 7肽、Aβ1 - 2 8由我室合成并纯化。第 3次免疫后 ,诱发小鼠糖尿病模型。小鼠分 4组 :即用 APP1 7肽免疫的正常小鼠 (1 7PC) ;用 APP1 7肽免疫后诱发糖尿病的小鼠 (1 7PDM) ;用 Aβ1 - 2 8免疫的正常小鼠 (2 8PC) ;用 Aβ1 - 2 8免疫后诱发糖尿病的小鼠 (2 8PDM)。第 5次免疫后 ,对各组小鼠脑切片进行 Aβ类抗体的免疫组织化学染色。结果　 1 7PC组小鼠海马内表达 Aβ1 - 4 2、 Aβ1 - 1 6及 APP C端抗体的阳性染色神经元数目多 ,而 1 7PDM组小鼠海马内上述各种抗体的阳性染色数目比 1 7PC组明显减少 (P<0 .0 1 ) ;2 8PC组小鼠海马内表达 Aβ1 - 4 2、Aβ1 - 1 6及 APP N端抗体的阳性染色神经元数目多 ,而 2 8PDM组小鼠海马内上述各种抗体阳性染色的数目比 2 8PC组明显减少 (P<0 .0 1 )。结论　糖尿病小鼠血 -脑屏障破坏 ,抗体进入脑组织 ,与β淀粉样肽或其前体蛋白结合而使之易被清除。     

快速诊断多房棘球蚴病胶体金免疫层析试条方法的建立与评价

目的建立快速、简便诊断多房棘球蚴病的胶体金免疫层析试条方法。方法提取多房棘球蚴原头节总RNA,通过RT-PCR获得编码Em18基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到重组蛋白;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记抗人IgG单克隆抗体;将重组Em18抗原包被于硝酸纤维素膜适当位置,制成检测特异抗体的胶体金免疫层析试条。用该试条检测多房棘球蚴病(56份)、细粒棘球蚴病(87份)、囊尾蚴病(30份)、日本血吸虫病(10份)和弓形虫病(10份)患者血清,以及健康人(50份)血清,以评价其检测的敏感性和特异性,同时用ELISA法进行平行检测,以评价该试条的诊断性能。结果以重组蛋白Em18为抗原胶体金免疫层析试条检测多房棘球蚴病患者血清,敏感性为92.9%(52/56)。与细粒棘球蚴病和囊尾蚴病患者血清分别存在9.2%(8/87)和3.3%(1/30)的交叉反应,与健康人血清存在8.0%(4/50)的假阳性率,与日本血吸虫病和弓形虫病患者血清则无交叉反应,特异性为93.0%(174/187)。ELISA法检测的敏感性和特异性分别为94.6%(54/56)和92%(172/187),与试条法比较两者差异均无统计学意义(P>0.05)。kappa分析结果显示,试条法与ELISA法检测多房棘球蚴病患者血清的结果高度一致(κ=0.98)。结论以重组Em18抗原建立的快速诊断胶体金免疫层析试条,检测多房棘球蚴病的敏感性和特异性均较高。     

恶性疟原虫裂殖子与人血型糖蛋白A之间分子识别的研究

用纯化的人血型糖蛋白A(Glycophorin A,简称GPA)和GPA糖肽分别对恶性疟原虫FCC-1/HN株的裂殖子进行免疫胶体金标记。标记样品按常规电镜要求处理,透射电镜观察。结果显示,胶金颗粒呈弥漫状分布于整个裂殖子虫体表面,获得恶性疟原虫裂殖子与GPA及GPA糖肽特异识别结合的直观实验证据,属国内外首次报道。本结果进一步证实GPA是恶性疟原虫裂殖子的受体,及GPA糖肽区域是膜受体的活性部位。     

胶体金快速诊断技术的研究进展

胶体金技术是一种常见的标记技术,自1971年Faulk和Taylon用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布,30年来胶体金技术得到不断的发展和成熟,期间发展到扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究,光镜水平的应用,银显影、蛋白质转移电泳、彩色免疫金银染色等领域,后引进到免疫诊断领域,与其他快速诊断技术(如ELISA、HPLC、RIA等)相比,胶体金技术由于方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,目前已在此领域得到广泛应用,显示出了极大的魅力。1胶体金技术的基本原理…     

冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用

目的:介绍冷冻超薄切片免疫电镜技术在肾活检病理中的应用. 方法:肾活检组织经固定、蔗糖冷冻保护后,应用改良Tokuyasu技术冷冻超薄切片进行IgA、κ、λ、C3aR、Podocine、Nephrin免疫胶体金标记,结合免疫荧光标记,并与Epon812常规免疫电镜技术及LR White Resin低温包埋免疫电镜技术进行对比,观察和比较冷冻超薄切片免疫电镜方法对肾活检组织超微结构、抗原保存及免疫标记的影响. 结果:冷冻超薄切片肾组织免疫电镜微细结构保存良好,细胞内结构清晰,肾组织及细胞内抗原保存较好,但细胞内基质、糖原保存不理想.lgA、κ、λ免疫标记金颗粒密度高,分布特异、敏感性高.Epon812常规免疫电镜和LR White Resin低温包埋免疫电镜方法能很好地标记C3aR、Podocine、Nephrin较难检测的抗原. 结论:肾活检冷冻超薄切片免疫电镜方法免疫标记特异度强、敏感度高,是研究肾脏病理超微结构较为理想的方法.     

胶体金免疫层析测试条快速诊断鼠疫应用研究

目的观察胶体金免疫层析测试条快速诊断鼠疫的效果。方法用胶体金免疫层析抗体(抗原)测试条与鼠疫间接血凝试验(IHA)/反向间接血凝试验(RIHA)两种方法平行检测鼠疫的抗体(或抗原)。结果通过对实验感染动物、青海鼠疫疫源地内鼠疫患者(尸体)及染疫动物等396份样品的检测,两种方法符合率为100%。结论胶体金免疫层析法操作简单、方便、快速,适用于现场应用和鼠疫的快速诊断。     

抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白 (HRP- )融合表达蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,取脾细胞与 SP2 / 0细胞融合 ,经 3次 EL ISA筛选 ,共获得 6株分泌抗恶性疟原虫重组 HRP- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1B11、1D10、2 E7、3A3、3F9、4G5 ) ,用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养 ,并用杂交瘤细胞经腹腔接种 BAL B/ c小鼠制备腹水。 6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (Mc Ab)经琼脂双扩散鉴定均为 Ig G1亚类 ,Dot- EL ISA及 Western blot分析显示 6株 Mc Ab都能与重组 HRP- 抗原发生特异性反应 ,但其中只有 2 E7和 3A3在 Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然 HRP- 结合     

氨氯地平对兔动脉粥样硬化及炎症因子妊娠相关血浆蛋白A作用的影响

目的 观察氨氯地平对动脉粥样硬化炎症因子妊娠相关血浆蛋白A的作用.方法 20只雄性新西兰大白兔应用球囊拉伤腹主动脉后高脂饲养12周,然后随机分为氨氯地平组和对照组,分别给予氨氯地平5 mg/d和溶媒对照治疗,治疗12周后处死动物;在实验开始,12周末和处死前耳缘静脉抽血检测高敏C反应蛋白和妊娠相关血浆蛋白A的水平,同时应用高频超声检测腹主动脉;处死动物后留取腹主动脉,分别进行常规病理检查,免疫组织化学染色检测妊娠相关血浆蛋白A的分布.结果 病理学和电镜结果 显示,与对照纽比较氨氯地平组斑块明显减小、脂质含量降低、平滑肌纤维较多而胶原少;超声检查也显示氨氯地平组内膜-中层厚度、收缩末期直径均明显减小(P<0.01),而校正的内中膜回声强度明显增加(P<0.01).氨氯地平还可以明显降低血清妊娠相关血浆蛋白A和高敏C反应蛋白的水平(P<0.01);免疫组织化学显示氨氯地平组斑块局部妊娠相关血浆蛋白A的表达减少;且血清妊娠相关血浆蛋白A的水平与高敏C反应蛋白和内膜-中层厚度相关(R2=0.424和R2=0.339).结论 妊娠相关血浆蛋白A与动脉粥样硬化的严重程度密切相关,氨氯地平可以抑制妊娠相关血浆蛋白A,从而延缓动脉粥样硬化的进展.     

恙虫病东方体平潭岛株重组抗原的制备及快速诊断试剂的研制

目的制备重组抗原,利用胶体金技术研制恙虫病快速诊断试剂。方法用PCR扩增出Ptan株编码56kD外膜蛋白长约1352bp的DNA,克隆至原核载体pET28a,构建了表达载体。表达产物经SDS-PAGE及Western-blot进行鉴定分析。将Ptan株和Gilliam56kD截短重组抗原混合作为诊断抗原,研制胶体金免疫层析诊断试纸检测血样中的恙虫病特异性总抗体、IgM和IgG。结果SDS-PAGE表明重组蛋白在相对分子质量约52kD处有表达目的条带,Western-blot证实该蛋白具有免疫活性。胶体金免疫层析法检测抗恙虫病东方体总抗体、IgM、IgG和IFA法检测IgG的敏感性分别为94.5%,81.4%,91.6%和86.2%,胶体金免疫层析法检测总抗体、IgM、IgG特异性分别为98.1%,100%,98.9%。结论胶体金层析法可替代常规IFA法用于恙虫病诊断。