不同磷脂配比构成的脂蛋白对J774巨噬细胞胆固醇转运的影响

目的研究不同磷脂配比构成的脂蛋白rHDL-A1、rHDL-A2、rHDL-A3、rHDL-B1、rHDL-B2对J774巨噬细胞胆固醇转运的影响。方法取新鲜抗凝血浆,用超速离心法进行密度梯度离心,收集LDL、HDL3。将LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH7.2)中,37℃温育24h;氧化修饰后的LDL置含200μmol/     

钉螺酚氧化酶活性的初步研究

目的初步探讨日本血吸虫惟一中间宿主钉螺体内酚氧化酶的生化活性。方法解剖健康成年钉螺,剔除外壳,将其分为雄性组、雌性组及雌雄混合组(雌雄重量相等),匀浆离心取上清为待检酶液。以邻苯二酚为底物通过比色法检测钉螺酚化酶在pH6.8、28℃条件下三组酶活力并予比较;用同法分别测定三组在不同pH(恒温28℃)及不同温度(pH6.8)下的酚氧化酶活力,绘制变化曲线,确定该酶活性最适pH和最适温度。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法和Arrhenius公式求得各组酶活化能并以比较。结果在pH6.8、28℃条件下,雄性组、雌性组及混合组的酶活力分别为188.2±5.7、183.8±5.5及185.2±6.7(U/g),经方差分析,三组酶活力无显著差异。三组酚氧化酶的活性在不同pH及温度下的变化趋势无显著差异;pH为6.0、温度为40℃时,三组的酚氧化酶活性均最高。三组活化能分别为32.6±5.1、31.7±2.9及32.1±3.3(kJ/mol),经方差分析亦无显著差异。结论钉螺酚氧化酶活性及活化能均无性别差异,其催化邻苯二酚的最适pH及最适温度分别为6.0和40℃。     

湖北钉螺酚氧化酶的部分纯化及酶学特征

目的制备并纯化钉螺酚氧化酶,探讨该酶最适pH、最适温度及其底物专一性等特征。方法利用匀浆、离心等方法制备粗制酚氧化酶酶液,用盐析、凝胶层析进行酶液纯化;在不同pH、不同温度下测定该酶比活力,寻求最适pH、最适温度;根据测定不同底物(邻苯二酚、L-多巴、焦没食子酸)对该酶的酶促反应米氏常数(Km),判定其底物专一性。结果经纯化后酶活力提高了13.62倍。该酶对邻苯二酚、L-多巴和焦性没食子酸的Km值分别为5.66±0.84mmol/L、4.72±0.45mmol/L和20.64±2.36mmol/L(前两者比较P>0.05,分别与后者比较P均小于0.05)。酚氧化酶在pH6.0、40℃时活性最高。结论通过盐析、凝胶过滤层析等方法纯化可使酶活性明显提高;钉螺酚氧化酶对邻苯二酚的亲和力近似于L-多巴,两者均高于对焦性没食子酸的亲和力。     

不对称二甲基精氨酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 观察不对称二甲基精氨酸（ADMA）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 THP-1单核细胞给予160nmol/L佛波酯（PMA）孵育48h,诱导分化成巨噬细胞,与80mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育24h,使巨噬细胞转化为泡沫细胞,用油红O染色在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化.再以不同浓度ADMA（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L）作用泡沫细胞24h,以20μmol/L ADMA作用泡沫细胞不同时间（0h,6h,12h,24h,48h）,酶比色法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①单核细胞加人PMA诱导48h后,分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导24h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L,30μmol/L的ADMA作用于,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）,③与对照组相比,20μmol/L的ADMA作用于THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞12h,24h,48h,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）.结论 ①单核细胞株THP-1经PMA诱导后,可分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导后,可转化为泡沫细胞.②ADMA可以增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的含量.     

硫化氢通过SIRT1抗内皮细胞衰老

目的探讨外源性硫化氢在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老中的作用及分子机制。方法用25μmol/L H2O2诱导HUVEC衰老,通过检测β-半乳糖苷酶计算细胞衰老率。检测不同浓度(15、30、60及120μmol/L)的硫氢化钠作用下内皮细胞衰老标志物β-半乳糖苷酶的表达,Western blot分析沉默信息调节因子1(SIRT1)蛋白的表达。结果 HUVEC经25μmol/L H2O2处理1 h后,β-半乳糖苷酶阳性细胞率为12.2%±1.30%;经60μmol/L硫氢化钠干预48 h后,β-半乳糖苷酶阳性细胞率显著降低,为4.6%±1.14%,两组相比差异显著(P<0.05);与对照组比较,60μmol/L硫氢化钠干预48 h后SIRT1蛋白表达显著上调(P<0.05),而用SIRT1抑制剂(NAM)可减弱硫氢化钠此作用(β-半乳糖苷酶阳性细胞率为12.0%±1.58%)。结论硫化氢能通过上调SIRT1表达抵抗H2O2诱导HUVEC衰老。     

铁离子对体外培养的阴道毛滴虫生长的影响

目的研究铁离子对体外培养的阴道毛滴虫生长的影响。方法在TYM(trypticase-yeast extract-maltose)培养基(pH6.0)中,分别加入100、200、300和400μmol/L铁离子,并设不加铁离子组为对照组,阴道毛滴虫初始浓度为1×105/ml,于37℃定量纯培养。采用台盼蓝染色法镜下观察并计数活滴虫数和死滴虫数,绘制生长曲线和存活率曲线,并计算对数生长期内世代时间。通过连续稀释的方法测定在加入200μmol/L铁离子培养基和对照组培养基中甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度(minimal lethal concentration,MLC)。结果在加入100、200、300和400μmol/L铁离子的培养基中,阴道毛滴虫均于40h达最高密度,分别为2.9×106、3.2×106、3.1×106和2.8×106/ml,对照组阴道毛滴虫于54h达最高密度,为2.5×106/ml。400μmol/L铁离子组阴道毛滴虫的世代时间为(6.8±0.7)h,较100～300μmol/L铁离子组的世代时间[(4.8±0.3)、(4.8±0.2)和(5.0±0.4)h]延长(均P﹤0.05),而100～400μmol/L铁离子组的世代时间均短于对照组[(10.2±3.1)h](均P﹤0.05)。在加入200μmol/L铁离子的培养基中阴道毛滴虫的甲硝唑最小致死浓度为(23.44±11.56)μg/ml,显著低于对照组[(31.25±15.44)μg/ml](均P﹤0.05)。结论阴道毛滴虫在加入100～400μmol/L铁离子的TYM培养基中生长较快,且甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度较小。     

黄芩苷对体外氧化应激模型中肝型脂肪酸结合蛋白表达的影响及其意义

目的 研究黄芩苷对体外氧化应激模型中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)表达的影响及其意义. 方法 用终浓度为400 μ mol/L的过氧化氢(H2O2) 37℃避光孵育细胞20min,建立体外诱导氧化应激模型.应用甲基噻唑基四唑法(MTT)检测不同浓度黄芩苷作用细胞的存活率,确定24h、48 h黄芩苷的半数中毒浓度(TC50).流式细胞技术检测不同浓度黄芩苷(25、50、100μmol/L)作用后活性氧(ROS)的表达、细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活性变化,实时PCR和Western blot检测肝细胞内L-FABP基因和蛋白表达.数据分析采用单因素方差分析.结果 根据MTT法得出25、50、100 μ mol/L的黄芩苷作用于细胞24h的存活率为83.60％±3.47％,72.36％±2.18％,70.16％±2.04％,F值为386.24,P＞0.05;作用于细胞48h的存活率为84.93％±3.11％,76.16％±2.45％,72.72％±2.31％,F值为475.92,P＞0.05.直线回归法得出黄芩苷持续作用24h和48h的TC50分别为153.2、170.6μmol/L.在此范围内,用25、50、100μmol/L浓度的黄芩苷分别作用Chang肝细胞24、48 h后,ROS含量24 h分别为37.0±3.30,22.90±3.84,29.60±2.52,F值为70.06,P＜0.05 ; 48h分别为35.77±2.35,21.80±3.10,23.87±1.98,F值为110.92,P＜0.05,而400μ mol/L H2O2组ROS含量24h和48h分别为45.50±3.47,48.80±2.70,以50μmol/L的黄芩苷作用48h效果最为显著.用50μmol/L黄芩苷处理48h后细胞内SOD活性为(51.53±1.91)μ g/mg,GSH为(49.85±1.45) U/mg;与对照组SOD为(26.36±1.23)μ g/mg,GSH为(25.11±1.74) U/mg,F值分别为93.81和92.51,P值均＜0.05).尽管50μmol/L黄芩苷处理48 h后细胞内L-FABP在mRNA水平并无明显变化,但50μmol/L黄芩苷处理48 h后细胞内L-FABP蛋白表达与对照组相比增加约80％.结论 黄芩苷能通过增强L-FABP蛋白表达,增加细胞内SOD和GSH的活性发挥抗氧化作用.     

结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及酶学性质研究

目的获得具有生物学活性的结核分枝杆菌重组异柠檬酸裂解酶蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因ic l,克隆入原核表达载体pET-28 a(+)中,通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白,并对其酶学性质进行测定分析。结果纯化出具有生物学活性的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶。酶学性质测定分析表明,重组异柠檬酸裂解酶ICL的比活力为7.657×102μmol.mg-1.m in-1,反应最适pH值约为7.4。重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定,测得相对分子质量为50 603.347。在5 mmol/L Tris-C l缓冲液、pH值7.8、25℃条件下,重组ICL的二级结构中相对有43.8%的α螺旋、31.9%的β折叠、3.4%β转角、20.9%无规则卷曲。结论本研究成功克隆表达结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因,酶学性质鉴定获得了具有生物学活性的重组蛋白,为该酶免疫学研究及新型抗结核药物的筛选奠定了基础。     

瑞舒伐他汀联合氨氯地平对ox-LDL诱导的人单核巨噬细胞MMP-9mRNA和蛋白表达的影响

目的瑞舒伐他汀联合氨氯地平降低对氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的健康人单核巨噬细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA及蛋白的表达进而促进粥样斑块的稳定。方法体外密度梯度离心法分离并培养单核巨噬细胞并传至2代～4代用于实验,根据实验要求分为空白对照组(单核巨噬细胞培养24h)、ox-LDL对照组(ox-LDL 100μg/mL诱导后单独培养24h)、瑞舒伐他汀组(单独加入瑞舒伐他汀0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L培养24h)、瑞舒伐他汀联合氨氯地平组(加入不同剂量瑞舒伐他汀联合氨氯地平0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L共同作用24h);分别提取各组细胞RNA,用半定量逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定MMP-9mRNA表达;用ELISA法测定MMP-9的蛋白含量。结果单核巨噬细胞经100μg/mLox-LDL诱导后,与空白对照组比较MMP-9mRNA和蛋白表达显著增加;ox-LDL诱导后不同剂量瑞舒伐他汀联合氨氯地平组,与ox-LDL对照组及瑞舒伐他汀组比较可加强抑制MMP-9mRNA和蛋白表达作用。并呈剂量-效应关系,差异有统计学意义(P<0.05)。结论外周血单核巨噬细胞在ox-LDL诱导后,MMP-9mRNA和蛋白含量明显增加,瑞舒伐他汀与氨氯地平联合后,可以加强抑制单核巨噬细胞MMP-9mRNA和蛋白表达的作用,进而增强急性冠脉综合征(ACS)患者粥样斑块的稳定性。     

小白菊内酯对胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP增殖及药物敏感性的影响

目的观察小白菊内酯(PN)对人胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP增殖及药物敏感性的影响。方法用0、5、10、20、40μmol/L的PN处理SGC-7901/DDP细胞,采用MTT法测算培养24、48、72 h的细胞增殖抑制率;再以20μmol/L PN、5μg/L DDP、10μg/L DDP、20μmol/L PN+5μg/L DDP、20μmol/L PN+10μg/L DDP作用胃癌细胞24 h,同法测算细胞增殖抑制率,计算PN与DDP的协同性(q值)。以培养基、10μg/L DDP、20μmol/L PN、20μmol/L PN+10μg/L DDP处理胃癌细胞24 h,分别采用RT-PCR、Western blot法检测细胞中的NF-κB p65 mRNA及其蛋白。结果随着作用时间的延长和药物浓度的增加,PN对胃癌细胞的抑制作用逐渐增强(P均<0.05)。20μmol/L PN处理24 h后胃癌细胞增殖抑制率为32.50%±0.27%,5、10μg/L DDP处理后分别为20.93%±0.15%、40.27%±1.04%,20μmol/L PN联合5、10μg/L DDP处理后分别为53.03%±0.67%、77.96%±0.26%。PN联合5、10μg/L DDP的q值分别为1.19、1.17,均>1.15。培养基、10μg/L DDP、20μmol/L PN、20μmol/L PN+10μg/L DDP处理24 h,胃癌细胞中NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.437±0.270、0.406±0.253、0.371±0.394、0.301±0.316,NF-κB p65蛋白相对表达量分别为0.695±0.115、0.672±0.067、0.452±0.290、0.361±0.104,20μmol/L PN+10μg/L DDP与其他三者比较,P均<0.05。结论 NP能抑制SGC-7901/DDP细胞增殖、增强其对DDP的敏感性,该作用可能与NP降低NF-κB的转录和蛋白表达有关。