CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达载体的构建及其表达和纯化

目的构建CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合基因表达质粒并分离、纯化融合蛋白。方法以质粒pCMV-SPORT6中Tapasin基因为模板,设计一对引物,上游引物带有融合基因CTP-HBcAg18-27序列,进行PCR反应;PCR产物回收纯化克隆到质粒pREST-B中,双酶切及测序鉴定;将鉴定正确的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;镍柱亲和层析法纯化融合蛋白;Western blotting鉴定融合蛋白。结果由质粒pCMV-SPORT6 PCR扩增得到1 480 bp大小的条带,为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合序列;将其克隆到表达质粒pREST-B后经酶切、测序结果正确;表达质粒转化DE3后成功表达,经纯化得到52.3 KD的蛋白;Western blotting鉴定为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白。结论成功构建了CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达质粒,并成功表达,为进一步研究此融合蛋白的功能提供了实验基础。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

空肠弯曲菌CadF蛋白的原核表达与产物分析

目的构建空肠弯曲菌cadF基因重组表达质粒pET30a(+)-cadF,分析其在大肠埃希菌中的表达情况及其融合蛋白的抗原性。方法用PCR方法扩增cadF基因,构建重组克隆质粒和表达质粒,经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后在E.coli(DE3)原核表达系统中诱导表达,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定表达蛋白,Western blot分析其抗原性。结果含重组表达载体pET-30a(+)-cadF中的cadF基因序列经测序证实与出发菌株cadF基因序列100%同源,并成功诱导表达CadF蛋白,Westernblot显示该CadF融合蛋白能被抗空肠弯曲菌多克隆兔血清识别。结论成功构建了空肠弯曲菌cadF基因重组表达载体,表达产物具有抗原性。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析

目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bti）以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体（pET32c）进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。     

用含霍乱毒素A2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的：克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2／B亚基基因的原核表达载体，为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法：应用PCR方法扩增出P30基因片段后，克隆入含有霍乱毒素A2／B亚基基因的表达质粒pUAB024，在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳及Western blotting进行检测鉴定。结果：电泳证明质粒构建正确，SDS-PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带，Western blotting进一步证实该条带为P30-CTA2／B融合蛋白。结论：表达载体pUAB024-P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30-CTA2B。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因（malate dehydrogenase,MDH）进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹（Western Blot）进行免疫学分析。结果成功构建pET-28a（＋）-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

Stx1B基因克隆、表达及重组蛋白的纯化

目的构建志贺样毒素1B亚单位(Stx1B)的原核表达载体,获取高纯度的Stx1B重组蛋白。方法用PCR法扩增Stx1B,通过基因重组技术克隆入原核表达载体pGEX4T-2,将该重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析及Westernblot检测。结果重组质粒经诱导后表达分子量为34kD的重组蛋白,Western blot检测显示特异性条带,亲和层析柱纯化后得到重组蛋白的纯度在90%左右。结论成功构建了Stx1B重组质粒,表达并纯化出高纯度重组蛋白,为进一步的生物性质研究奠定了基础。     

牛分枝杆菌Mb2277蛋白的表达及其反应原性初步研究

目的构建牛分枝杆菌Mb2277基因的原核表达载体,获得高纯度的融合表达蛋白,并对其表达产物的免疫原性进行初步研究。方法根据GenBank提供的M.bovisMb2277基因序列设计引物。以牛分枝杆菌(93006)DNA为模板,通过PCR方法扩增出Mb2277基因片段,以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pET28a(+),后将纯化的Mb2277基因克隆至pET28a(+)中,构建出原核表达质粒,再转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导后,收集菌体进行SDS-PAGE,进一步利用Western Blot对表达产物的反应原性进行研究。结果获得了牛结核分枝杆菌Mb2277原核表达质粒,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见约25ku蛋白表达条带,Western Blot结果显示,表达产物与兔抗分枝杆菌抗体具有反应性。结论该蛋白具有较强的反应原性。     

家蝇Cecropin基因的原核表达及表达产物的免疫学鉴定

目的克隆家蝇抗菌肽基因Cecropin A,进行原核表达,制备兔抗家蝇幼虫血清鉴定表达产物。方法在GenBank中检索家蝇Cecropin A基因序列,设计特异性引物,从家蝇幼虫组织总RNA中RT-PCR扩增Cecropin A成熟肽(Ma-tureCecropin,MC)基因,克隆入原核表达载体pET32a中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白。用家蝇幼虫匀浆液免疫家兔,获得多抗血清,双向琼脂扩散实验鉴定多克隆抗血清的效价。Western blotting鉴定纯化后的重组蛋白质。结果重组蛋白质Thiore-doxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC,经兔抗家蝇幼虫血清鉴定正确。结论天然MC在原核表达系统中得到正确表达。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2（GRA2）的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST—His—GRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GST—His—GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

转录反式激活蛋白转导域介导HBcAg穿透细胞膜的作用

目的 观察蛋白转导域(PTD)-HBcAg融合蛋白的细胞膜穿透作用.方法 合成转录反式激活蛋白(Tat)-PTD编码序列,PCR技术扩增HBcAg全长基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法将Tat-PTD编码序列和HBcAg全长基因融合,将融合基因克隆到pMAL-c2X原核表达载体中.挑选测序正确的构建质粒,转化大肠埃希菌Rosetta-gamiTM2(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,Western印迹鉴定,亲和层析纯化融合蛋白PTD-HBcAg,同样方法得到HBcAg蛋白作为对照.纯化蛋白加入细胞培养介质中,间接免疫荧光检测进入细胞内的PTD-HBcAg和HBcAg.结果 大肠埃希菌中过度表达的融合蛋白可通过亲和层析纯化,Western印迹证实纯化的PTD- HBcAg和HBcAg能被HBeAg单克隆抗体识别,细胞免疫荧光检测证实PTD-HBcAg可跨膜转导入细胞内,而单独的HBcAg未能在细胞内检测到.结论 融合蛋白PTD-HBcAg可在原核表达系统中高效表达、分离纯化,PTD能介导HBcAg穿透细胞膜进入细胞.     

日本血吸虫SCP/TAPS基因家族的生物信息学分析和克隆表达

目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白进行生物信息学分析,经PCR确定后,以AAW24579为代表进行进一步的研究,将其命名为SjVAL2。根据SjVAL2的序列设计引物,通过RT-PCR扩增出全长编码区域,克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,免疫印迹实验（Western-blotting）鉴定纯化的重组蛋白。结果日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,多序列比对分析发现它们初步可以分为3个不同的亚组。以日本血吸虫成虫cDNA为模板RT-PCR扩增出SjVAL2序列,PCR、双酶切及DNA测序均证实pET-28a（＋）-SjVAL2重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌中获得高效表达,重组蛋白能识别日本血吸虫感染的小鼠血清,说明其具有免疫反应性。结论日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,其中SjVAL2基因可在原核表达系统中高效表达,为进一步研究该家族蛋白的功能打下基础。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆 表达及免疫性分析

目的 通过原核表达获得细粒棘球绦虫转酮醇酶（TK）表达产物,分析其作为棘球蚴病诊断抗原分子的价值。方法 PCR扩增TK基因,克隆至原核载体pMD19?EgTK,随后亚克隆至表达载体pET?28a,构建目的基因TK原核表达质粒pET?28a（+）?EgTK,转入大肠埃希菌BL21,分离纯化蛋白,经SDS?PAGE、Western blotting鉴定后,收集细粒棘球蚴病（CE组）、多房棘球蚴病（AE组）患者及健康人（健康组）血清,以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组蛋白作为诊断抗原的价值。结果 成功构建pET?28a（+）?EgTK质粒,经SDS?PAGE和Western blotting分析,EgTK蛋白在70 kDa处出现条带,与理论值一致。ELISA显示,CE组、AE组和健康组血清反应吸光度A450值间差异有统计学意义（F = 44.47,P < 0.01）,CE组（1.46±0.41）、AE组A450值（1.28±0.29）高于健康组（0.66±0.23）（P ＜ 0.05）,但CE组和AE组间A450值差异无统计学意义（P＞ 0.05）。结论 重组TK分子可较好地区分棘球蚴病患者和非棘球蚴病患者,但无法区分细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者。