肺癌患者14-3-3σ基因启动子异常甲基化的检测

目的：探讨肺癌组织及其外周血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）中14-3-3σ基因启动子异常基因化状况及其在肺癌诊断中的价值。方法：用甲基化特异性PCR方法对肺癌组织、肺正常组织及相应血浆、BALF进行14-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果：45例肺癌组织中,14-3-3σ基因启动子异常甲基化率为51.11%（23/45）,相应血浆中14-3-3σ的甲基化检出率为31.11%（14/45）,BALF检出率为42.22%（19/45）;而正常组织中的14-3-3σ启动子甲基化率为17.39（4/23）（χ2=7.229,P〈0.01）,正常对照血浆未检出甲基化,非肺癌患者BALF中甲基化检出率为2.22%（1/45）;血浆、BALF中甲基化改变与肿瘤组织甲基化状况显著相关（P〈0.01）;但与患者年龄、性别、肿瘤大小差异无统计学意义（P〉0.05）,与肿瘤病理分类相关（SCLC、NSCLCχ2=5.156,P〉0.01）。结论：血浆、BALF中14-3-3σ基因异常甲基化改变的检测在肺癌的特异诊断等方面有一定的应用价值。     

浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ、p73α蛋白表达及临床意义

目的探讨表皮细胞特异性标志物14-3-3σ、p73α蛋白在浸润性乳腺癌发生发展中的作用。方法选择我院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本94份（浸润癌组）,导管原位癌15份（原位癌组）,上皮不典型增生15份（不典型增生组）,导管内乳头状瘤15份（乳头状瘤组）,乳腺增生症20份（增生症组）,乳腺癌旁5 cm组织10份（癌旁组）,采用免疫组化PV-9000两步法检测各组14-3-3σ、p73α蛋白表达情况,并分析两者间及与浸润性乳腺癌临床病理特征的相关性。结果浸润癌组14-3-3σ蛋白阳性率明显低于其余各组,p73α蛋白阳性率明显高于其余各组,P均〈0.05。14-3-3σ蛋白阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移、HER-2受体、组织学分级、TNM分期相关,p73α蛋白与腋窝淋巴结转移、ER受体、PR受体、TNM分期相关。14-3-3σ与p73α蛋白表达呈负相关。结论 14-3-3σ和p73α蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展相关,两者联合检测可为乳腺癌早期诊断和治疗提供参考。     

14-3-3蛋白影响肿瘤放射敏感性的机制研究进展

14-3-3蛋白是一组常表达于真核生物中的小分子蛋白质，随着近年来对其功能研究不断加深，相关研究发现其在肿瘤的发生发展及放射敏感性中具有重要意义，其机制可能与14-3-3蛋白对DNA损伤后修复、细胞周期调控、信号转导等多种途径有关。本文就14-3-3蛋白对不同肿瘤放射敏感性的影响进行综述。     

14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义

目的:研究14-3-3蛋白在心肌细胞缺氧预处理中的表达及意义。方法:实验用SD新生大鼠(1～3d龄),雌雄不拘,无菌取出乳鼠心脏,经分离附着组织,胰蛋白酶消化,纯化制成心肌细胞。在培养的第4天随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧(A/R)组、缺氧预处理(APC)组。各组分别进行以下指标观察:①心肌细胞搏动频率;②细胞存活率(MTT法);③培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;④透射电镜观察细胞超微结构;⑤Western Blotting法检测14-3-3蛋白的表达变化。RT-PCR法检测14-3-3蛋白η、σmRNA的表达变化。结果:A/R组和APC组的14-3-3蛋白表达均上调,分别是正常对照组的(3.61±0.37)倍和(5.52±0.49)倍,A/R组和APC组与正常对照组比较、A/R组与APC组比较,均P<0.01。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3η亚型mRNA分别为正常对照组的(1.82±0.30)倍、(2.93±0.52)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);APC组与A/R组比较,差异亦有统计学意义(P<0.01)。A/R组、APC组心肌细胞14-3-3σ亚型mRNA表达量分别为正常对照组的...     

浸润性乳腺癌中14-3-3σ基因的甲基化及其转录表达的意义

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中14-3-3σ基因的mRNA的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用RT-PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测73例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中14-3-3σ基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组14-3-3σ基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);14-3-3σ的甲基化与TNM分期、腋窝淋巴结转移及ER受体等分组间差异均有显著性意义(P<0.05),而与其他临床特征之间差异均无统计学意义(P>0.05);14-3-3σ在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在40例14-3-3σ基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到14-3-3σ的mRNA表达,进一步研究甲基化与基因表达相关性发现,二者呈负相关性(r=-0.676,P=0.000)。结论 14-3-3σ基因异常甲基化可能影响其mRNA的表达水平;14-3-3σ基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和及时治疗提供帮助。     

细粒棘球蚴重组14-3-3基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的 构建细粒棘球蚴14-3—3基因的重组质粒并原核表达、纯化该重组蛋白，对其免疫学特性进行初步鉴定。方法 从重组质粒pGEM—T／Eg14-3—3中获取14—3—3基因，亚克隆于表达载体pET28a构建基因丁程菌株，并表达、纯化重组蛋白，经Westernblot、ELISA对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 成功构建含目的片段14—33的基因工程菌株；ELISA检测显示，用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠，诱导产生了特异性抗体，Westernblot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴、囊液、囊壁抗原。结论构建的pET28a／Eg14—3—3菌株能高效表达14—3—3蛋白，初步鉴定该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

弓形虫14—3—3信号转导蛋白基因序列测定

目的 克性与鉴定弓形虫14－3－3（Toxo14-3-3)信号转导蛋白基因,用于寻找弓形虫新的诊断和候选疫苗分子,并在寄生虫入侵宿主细胞中寻找分子干预环节。方法 设计合成引物,以弓形虫RH株速殖子RNA为模板逆转录合成cDNA链,用PCR扩增出弓形虫14－3－3蛋白编码基因序列,克隆入pGEM-T载体,并用双酶切法、以质粒为模板PCR法和DNA测 序进行鉴定。结果 Toxo14-3-3具有一个长度为798bp的完整开放阅读框,与GenBank收录（编号为ABO12775）Toxo14-3-3蛋白编码基因一致,2个碱基出现密码简并。结论 本实验获得了完全正确Toxo14-3-3蛋白基因克隆,为下一上基因表达等研究奠定了基础。     

重组小鼠脑14-3-3γ蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备重组小鼠脑14-3-3γ蛋白单克隆抗体(McAb),为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物.方法 采用重组小鼠脑14-3-3γ蛋白免疫小鼠,制备抗小鼠脑14-3-3γ蛋白的多克隆抗体,并应用多克隆血清检测14-3-3蛋白在大鼠脑中的分布.进一步应用杂交瘤技术制备其单克隆抗体,并鉴定其特异性以及与天然抗原的亲合力.结果 制备的多克隆血清能有效识别大鼠脑组织的14-3-3蛋白,免疫组化显示在黑质,蓝斑,室周核,背外侧核染色阳性.制备的单克隆抗体可特异性识别重组14-3-3γ蛋白、大鼠脑及人脑中14-3-3蛋白.结论 重组小鼠脑14-3-3γ蛋白多克隆血清和单克隆抗体成功制备;此可用于神经系统退行性疾病的诊断.     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定多房棘球绦虫重组BCGEm14—3—3疫苗。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT—PCR扩增获得Em14—3-3的cDNA，将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG的人结核分枝杆菌热休克蛋白（HSP）70启动子下游构建重组质粒pBCG—Em14-3—3，用电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗。将该疫苗接种到含12μg／ml、HgCl2的罗氏培养基筛选培养3周。结果 重组pBCG—Em14—3-3质粒经酶切证实构建成功，rBCG—Em14-3-3疫苗能在含12μg／ml HgCl2的罗氏培养基上生长繁殖。结论 成功构建多房棘球绦虫重组BCGEm14-3-3疫苗，为泡球蚴病的防治提供了一种新方法。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒pcDNA3.0/14-3-3,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人宫颈癌(HeLa)细胞,蛋白印迹(Western blotting)分析表达产物。结果根据14-3-3蛋白基因片段序列和氨基酸序列预测,该蛋白分子为酸性可溶性蛋白,主要以同源或异源二聚体存在,有5个氨基酸保守序列区。RT-PCR的扩增产物约为800 bp,构建的真核表达质粒pcDNA3.0/14-3-3插入片段经测序,片段长度为801 bp,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。Western blotting分析结果显示,在转染pcDNA3.0/14-3-3的细胞中,有14-3-3蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,且表达量显著高于转染空质粒和未转染的细胞。结论构建了真核表达载体pcDNA3.0/14-3-3,并能在真核细胞内表达。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14—3—3编码基因重组质粒pET28a一Sj14—3—3的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3编码基因原核表达质粒pET28a-Sj14-3-3,测定Sj14-3-3基因序列,并为中国大陆株Sj14-3-3的体外表达奠定基础。方法采用RT-PCR技术从日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因,扩增产物经纯化后。用BamH I Xho I双酶切,定向克隆入pET28a质粒,转化大肠杆菌DH5a,再用BamH I Xho I双酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用在线软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 PCR扩增产物约为765bp,符合预计大小,并成功地定向克隆到原核表达质粒pET28a,对插入片段的测序结果表明,该序列和推测的氨基酸序列与GenBank收录的日本血吸虫14-3-3基因分别有99.5％和99.2％的同源性。序列分析显示,Sj14-3-3基因序列中可能有抗原表位存在。结论 pET28a-Sj14-3-3重组质粒构建成功,为日本血吸虫5j14-3-3分子疫苗及信号转导研究奠定基础。     

日本血吸虫Sj14-3-3疫苗研究进展

日本血吸虫病是由日本血吸虫引起的一类严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,研制疫苗防治该病是目前的研究热点.Sj14-3-3蛋白是一种有效的疫苗分子,该文就Sj14-3-3蛋白疫苗和核酸疫苗的研究进展进行综述.     

猪带绦虫14-3-3基因家族生物信息学分析北大核心CSCD

目的 14-3-3基因家族广泛存在于真核生物体内,参与重要的生命活动过程,且与多种疾病的发生密切相关,本研究旨在进一步了解猪带绦虫14-3-3蛋白家族的序列特征和分类情况。方法采用生物信息学方法对猪带绦虫全基因组的14-3-3基因进行序列分析,包括外显子和内含子组成情况及其编码氨基酸基本特性、并进行蛋白二级结构和三级结构特征、亚细胞定位与系统进化树分析。结果对猪带绦虫全基因组蛋白质数据库进行搜索,获得6个14-3-3蛋白序列。序列分析显示,所有14-3-3基因均具有典型14-3-3结构域,蛋白分子质量介于26.88×103～29.33×10~3之间,等电点范围为4.76～5.12;基因结构分析表明其中1个蛋白基因具有1个内含子,3个蛋白基因具有2个内含子,2个蛋白基因具有3个内含子;系统进化分析显示,猪带绦虫14-3-3蛋白系统进化树主要分为4个进化枝,其中第Ⅱ进化枝包含3个蛋白成员,其它3个蛋白分别位于不同的进化枝上;三级结构预测6个14-3-3蛋白具有较为相似的蛋白结构,均以二聚体的形式存在,每个单体都包含9个反向平行的α-螺旋。结论生物信息学预测猪带绦虫含有6个位于不同进化枝的14-3-3蛋白,为研究其基因功能提供了理论依据。     

6-羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中14-3-3蛋白表达的研究

目的 应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中14-3-3蛋白的表达变化.方法 在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞PD模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24 h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定出差异蛋白质.结果 DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P＜0.05),经质谱分析鉴定确认为14-3-3蛋白.结论 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD模型中14-3-3蛋白表达上调,提示14-3-3蛋白上调可能与PD的发病机制有关.     

膀胱尿路上皮癌组织中CDC25B、14-3-3σ蛋白的表达变化及意义

目的观察膀胱尿路上皮癌（下称膀胱癌）组织中CDC25B、14-3-3σ蛋白的表达变化,并探讨其意义。方法采用Western blot法检测90例膀胱癌（观察组）及20例正常膀胱黏膜（对照组）中的CDC25B、14-3-3σ蛋白。结果观察组CDC25B蛋白阳性率为54.4%、14-3-3σ蛋白阳性率为72.2%,对照组分别为30.0%、100.0%,两组比较,P均〈0.05。CDC25B、14-3-3σ蛋白表达与膀胱癌临床分期、病理分级有关（P均〈0.05）,CDC25B与14-3-3σ蛋白表达呈明显负相关（rs=-0.627,P〈0.05）。结论膀胱癌组织中CDC25B蛋白高表达、14-3-3σ蛋白低表达,二者在膀胱癌的发生发展中起重要作用。     

肝癌组织中14-3-3基因差异表达的意义

目的:检测肝癌组织中,4-3-3基因家族成员表达差异的临床意义.方法:用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关.14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关.14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(γ=-0.403,P<0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切.     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon 亚型基因的表达及鉴定

目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合成 1对引物 ,以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板 ,用RT PCR法合成日本血吸虫大陆株 14 3 3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK Sj14 3 3 ,转染到大肠杆菌BL2 1,双酶切鉴定后 ,通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL2 1中进行表达及Western blot鉴定。　结果　RT PCR产物、pGEM T Sj14 3 3及pBK Sj14 3 3分别经双酶切均获得一特异性基因片段 ,其表达产物经SDS PAGE及Western blot鉴定后其分子质量为 3 2ku ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。　结论真核表达重组质粒 pBK Sj14 3 3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为 3 2ku融合蛋白 ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。