活性氧在芬维A胺诱导人肝癌细胞凋亡中的作用及其机制研究

背景:芬维A胺可提高细胞内活性氧(ROS)水平,其抗肿瘤活性已在众多体内外实验和临床化学预防试验中得到验证。前期研究发现芬维A胺能体外诱导人肝细胞癌(HCC)细胞凋亡,但确切机制不明。目的:探讨ROS在芬维A胺诱导人HCC细胞凋亡中的作用及其可能机制。方法:分别以抗氧化剂维生素E、芬维A胺单独或联合处理人HCC细胞株Huh-7,共聚焦显微镜和流式细胞术检测活细胞ROS,CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒和Caspase-Glo3/7检测试剂盒分别检测细胞活力和细胞凋亡,免疫荧光染色和蛋白质印迹法分别检测核受体Nur77的表达、定位和应激诱导转录因子GADD153表达。结果:维生素E预处理能充分阻断芬维A胺诱导的ROS产生。在经维生素E预处理的Huh-7细胞中,芬维A胺的促凋亡效应显著降低(P0.05)。维生素E预处理能显著降低芬维A胺诱导的GADD153表达,对芬维A胺诱导的Nur77表达和出核则无明显影响。结论:以维生素E清除ROS可抑制芬维A胺促Huh-7细胞凋亡的效应,提示ROS参与了芬维A胺诱导的人HCC细胞凋亡,其机制可能与诱导GADD153蛋白表达有关。     

三氧化二砷对5种人类白血病细胞体外效应的比较研究

目的了解三氧化二砷(AS2O3)在体外对K562、BV173、 HL60、U937等白血病细胞生长增殖、凋亡、细胞周期的影响,并与NB4细胞进行比较.方法体外培养上述细胞株,在不同浓度AS2O3作用不同时间后以锥虫蓝拒染计数法计数细胞,绘制生长曲线;通过PI和Annexin V双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI染色、流式细胞仪检测药物作用前后白血病细胞的周期分布改变.结果AS2O3明显抑制实验所用NB4、K562、BV173、U937、HL60等 5种白血病细胞的生长增殖,且其效应在2～10 μmol/L的浓度范围内均呈剂量依赖性和时间依赖性;5 μmol/L 浓度AS2O3处理48 h后细胞凋亡率分别为K562(14.6±2.5)%、BV173(19.4±3.1)%、U937(13.8±3.6)%、HL60(18.2±4.0)%,与NB4细胞(41.8±2.6)%比较,差异有统计学意义(均P＜0.01). 以5 μmol/L 浓度的AS2O3经24 h处理,NB4细胞的周期改变以亚G1峰增加为主(5.2%∶36.2%);BV173细胞以G0/G1期细胞比例的增加为主(55.2%∶71.7%),K562细胞及U937细胞以G2/M期细胞比率增加最为明显(分别为22.6%∶45.8%,15.7%∶48.6%).结论在本实验浓度范围内AS2O3对5种白血病细胞株均具有明显生长抑制作用,对不同白血病细胞抑制生长的机制不同,NB4细胞以诱导凋亡为主,K562、BV173、U937白血病细胞以诱导周期停滞为主.提示周期停滞而凋亡不足是AS2O3对NB4以外白血病细胞体外效应的普遍特点;探讨周期停滞及凋亡耐受的机制对提高这些白血病细胞的AS2O3敏感性具有重要意义.     

柠檬醛诱导白血病细胞株NB4凋亡的分子机制

目的探讨柠檬醛（Citral）诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡的分子机制。方法Citral处理NIM细胞后,采用DNALadder检测断裂DNA;流式细胞仪Annexin V／PI双染法检测细胞凋亡率;Westernblot检测caspase3、9的活化以及Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白的表达水平变化;实时荧光定量PCR法检测Mcl-1mRNA的表达水平变化。结果Citral诱导NB4细胞凋亡呈现剂量和时间依赖性;caspase3、9在Citral作用后均发生活化;Citral处理的NB4细胞抗凋亡蛋白Mcl-1表达水平下降,但其mRNA的表达水平改变无统计学意义。结论Citral诱导NB4细胞凋亡,其中线粒体途径是重要的凋亡途径,这可能和抗凋亡蛋白Mcl-1的下调有关,Mcl-1的下词发生在转录后水平。     

维甲酸、三氧化二砷诱导NB4细胞TRAIL基因表达的研究

目的：研究全反式维甲酸(ATRA)或三氧化二砷(As2O3)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的表达及其治疗APL的机制。方法：采用RT—PCR检测TRAIL基因表达的变化。结果：10^-6mol／L的ATRA作用6h或10^-6mol／L的As2O3作用12h，即可诱导TRAIL基因表达。结论：ATRA或As2O3能诱导NB4细胞TRAIL基因表达，TRAIL基因可能以类似“旁分泌”的作用方式杀伤NB4细胞。诱导TRAIL基因介导的细胞凋亡可能是ATRA或As2O3治疗APL的机制之一。     

三氧化二砷对Molt-4细胞株Notch信号通路作用机制的研究

目的 :探讨三氧化二砷(As2O3)对急性淋巴细胞白血病细胞株Molt-4中Notch1基因的作用机制。方法 :采用反转录(RT)-PCR检测正常人外周血淋巴细胞与急性淋巴细胞白血病细胞株A3和Molt-4中Notch1基因m RNA的相对表达量,选取Notch1 m RNA表达量较高的Molt-4细胞,分别经浓度0、2、4μmol/L As2O3处理细胞后,应用细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞活力,显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Notch1 m RNA表达率,蛋白质印迹法检测细胞内Notch1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及胱天蛋白酶3(caspase-3)凋亡蛋白的表达情况。结果:As2O3能下调Molt-4细胞中Notch1基因及蛋白的表达,降低Bcl-2/Bax蛋白比例,并促进凋亡蛋白胱天蛋白酶3的活化,2μmol/L As2O3处理后,随作用时间延长,Molt-4细胞的凋亡率逐渐增高(r=0.989,P<0.05)。As2O3以时间和浓度依赖的方式诱导Molt-4细胞凋亡。结论:As2O3通过抑制Molt-4细胞株Notch1信号通路的表达,抑制其增殖并诱导凋亡。     

SNHG14调控miR-181b对H2O2诱导的人脑微血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响

目的 小核仁RNA宿主基因(SNHG)14对H₂O₂诱导的人脑微血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及作用机制。方法 体外培养人脑微血管内皮细胞BB19,100μmol/L H₂O₂诱导分别作用于转染SNHG14小干扰RNA、miR-181b模拟物及共转染SNHG14小干扰RNA与miR-181b抑制剂的BB19细胞后,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中SNHG14和miR-181b mRNA表达,CCK-8和流式细胞仪分别检测细胞增殖、凋亡,Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平。双荧光素酶报告实验验证SNHG14与miR-181b调控关系。结果 干扰SNHG14表达或过表达miR-181b后,H₂O₂诱导的BB19细胞增殖活性、Bcl-2表达及SOD和CAT活性明显升高,细胞凋亡率、Bax表达和MDA水平明显...     

齐墩果酸对人早幼粒白血病NB4细胞增殖的影响及其机制

目的 探讨齐墩果酸对NB4细胞增殖的影响及其作用机制.方法 40、60、80和100 μmol/L的齐墩果酸分别处理体外培养的人早幼粒白血病NB4细胞24、48和72 h后,MTT比色法检测NB4细胞活力;实时荧光定量PCR分析凋亡相关基因Bcl-2及Bax mRNA的表达.结果 齐墩果酸在体外具有明显的细胞毒性,可抑制NB4细胞增殖,且呈现时间和剂量依赖性;实时荧光定量PCR实验证明,NB4细胞经齐墩果酸处理后,促凋亡基因Bax表达上调,抗凋亡基因Bcl-2表达下调.结论 齐墩果酸在体外能抑制NB4细胞增殖,并使促凋亡基因Bax表达升高,抗凋亡基因Bcl-2表达降低,上调Bax和下调Bcl-2 mRNA的表达可能是其作用机制之一.     

Chk1/2反义寡核苷酸对DDP诱导白血病原代细胞凋亡影响的研究

目的:观察白血病原代细胞在顺铂作用下细胞周期变化和转染Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂诱导原代细胞凋亡的影响。方法:用RT-PCR、westernblot及免疫组化检测白血病骨髓单个核细胞(BMMNC)中Chk1和Chk2的表达,用流式细胞仪检测顺铂作用下白血病BMMNC细胞周期变化。以脂质体作为载体,转染Chk1/2反义寡核苷酸于BMMNC,用流式细胞仪检测转染Chk1/2反义寡核苷酸后顺铂作用下BMMNC细胞凋亡率。结果:在白血病BMMNC中,Chk1和Chk2mRNA水平均存阳性表达,Chk1蛋白表达强,而Chk2蛋白表达弱。10μmol/L顺铂作用下BMMNC出现S期阻滞,转染Chk1反义寡核苷酸可明显增加顺铂诱导下BMMNC凋亡率,转染Chk2反义寡核苷酸不能增加顺铂诱导下BMMNC凋亡率。结论:Chk1可作为白血病增敏治疗的有效靶点。     

白血病细胞色素P4503A亚家族多肽5与耐药的相关研究

目的　探讨细胞色素P4 5 0 3A亚家族多肽 5 (CYP3A5 )与白血病耐药是否相关。方法逆转录 PCR、免疫组化、高压液相色谱法检测白血病细胞系CYP3A5基因的转录、表达及活性 ,四氮唑蓝法检测细胞系对柔红霉素 (DNR)IC50 值、流式细胞仪 (FCM )检测细胞周期及DNR诱导凋亡能力。结果　K5 6 2、U937、HL 6 0、NB4、Jurkat 5种细胞株仅K5 6 2、U937细胞转录CYP3A5基因。 5种细胞株对DNR敏感性 (IC50 ,mg/L)依次为NB4 (0 0 6 8± 0 0 36 ) >Jurkat(0 0 76± 0 0 13) >HL 6 0(0 0 92± 0 0 16 ) >K5 6 2 (0 14 8± 0 0 4 1) >U937(0 15 0± 0 0 35 ) ,K5 6 2、U937细胞与NB4、Jurkat、HL 6 0细胞相比 ,对DNR显著耐受 (P <0 0 1)。K5 6 2与NB4细胞相比 ,前者表达CYP3A5蛋白 ,并具有显著高的CYP3A5活性 (3 0 75± 0 0 36 )× 10 -3 、(1 6 35± 0 196 )× 10 -3 ,P <0 0 5。FCM显示K5 6 2与NB4细胞二者S期比例相近 ,经 1mg/LDNR诱导 6h后NB4细胞出现明显的凋亡峰 (凋亡比 18 4 % ) ,而K5 6 2细胞则无 (凋亡比 0 8% )。结论　CYP3A5基因的转录、表达及活性与白血病耐药相关。     

抗坏血酸联合三氧化二砷对不同髓系白血病细胞凋亡与分化效应的差异化影响

目的 观察抗坏血酸(ascorbic acid,AA)对三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)促进髓系白血病细胞分化和凋亡效应的影响.方法 采用细胞培养的方法,体外培养急性早幼粒细胞白血病(APL)的不同亚型细胞株(NB4、MR2)和红白血病细胞株(K562).根据加入As2O3的剂量不同(0、0.1、0.2、0.5、1.0μmol/L和0、1.0、2.0 μmol/L)分组,再以上述各组为对照组,分别加入113.0 μmoL/L的AA,培养96 h后,光镜下观察NB4、MR2、K562细胞株形态改变,流式细胞仪检测NB4、MR2、K562细胞株凋亡[Annexin V(+)PI(-)、Annexin V(+)/PI(+)]和分化[细胞表面抗原(CD)11b、CD33]改变.结果 ①NB4、MR2、K562细胞株在As2O3联合AA作用后.均可见到明显凋亡的细胞,表现为胞浆中出现空泡,核染色质浓缩,碎裂块弥散于胞浆中.可见凋亡小体;在分化的细胞中,细胞出现胞核凹陷、分叶、核浆比例明显减低.②AA联合As2O3后,细胞凋亡的比例增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或<0.01).③AA能降低As2O3对NB4、MR2细胞的分化效应,使CD11b减少、CD33增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或<0.01);AA能显著增强As2O3对K562细胞的部分分化效应,使CD33明显减少,CD11b明显增多(P<0.01).结论 从可增强As2O3对各种髓系白血病的凋亡效应.但对不同的髓系白血病细胞,AA对As2O3的分化效应具有差异化,对NB4、MR2细胞表现为抑制作用,对K562细胞表现为增强作用.     

siRNA沉默β-Catenin对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的研究siRNA干扰β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路对肝星状细胞（HSC）增殖和凋亡的影响。方法将化学合成的siRNAβ-Catenin以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照;采用逆转录-聚合酶链反应和Western blotting检测细胞β-Catenin表达;采用Western blotting法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;采用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞凋亡。结果以不同浓度的β-Catenin SiRNA转染HSC-T6细胞后,β-Catenin mRNA水平比阴性对照组分别下调了51.3±3.6%、85.7±6.8%和94.5±7.5%（P均〈0.01）,比空白对照组分别下调了50.5±3.4%、86.1±6.2%和93.7±7.2%（P均〈0.01）;β-Catenin蛋白表达被抑制了56.43±2.88%（P〈0.01）;Ⅰ和Ⅲ型胶原表达分别被抑制了46.58±3.46%（P〈0.01）和50.48±3.72%（P〈0.01）;细胞增殖明显被抑制,最大抑制率达到44.8±2.8%（P〈0.01）;细胞凋亡增加达28.6%（P〈0.05）。结论 siRNAβ-Catenin能高效抑制HSC-T6细胞β-Catenin表达,阻断Wnt/β-Catenin信号通路,从而抑制HSC-T6细胞增殖,促进凋亡,显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌,具有预防及治疗肝纤维化的潜力。     

叉头状转录因子O1与吡格列酮干预对肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响

目的研究叉头状转录因子O1（FoxO1）及吡格列酮干预对高胰岛素诱导的肝癌HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响及机制。方法1×10^-6mol／L胰岛素培养HepG．2细胞24h后,诱发培养基葡萄糖消耗减少建立细胞模型,将细胞分为对照组、空白质粒组、FoxOlsiRNA载体组、1×10^-5mol／L吡格列酮组。以普通培养基培养的细胞作为空白对照组。37℃、5％CO2培养箱中孵育24h,葡萄糖氧化酶法检测培养基中葡萄糖含量,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测FoxO1mRNA和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）mRNA表达,Westernblot法检测PPAR-γ蛋白表达。将FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA、PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量进行相关分析和曲线拟合。采用单因素方差分析及多样本均数两两比较进行统计学分析。结果高胰岛素培养24h较未诱导细胞培养基的葡萄糖消耗降低[分别为（1．36±0．03）和（2．93±0．05）mmol／L,P〈0．01],细胞Fox01mRNA升高（分别为0．513±0．016和0．425±0．011,P〈0．05）,PPAR-γmRNA降低（分别为0．260±0．025和0．441±0．012,P〈0．05）,PPAR-γ蛋白降低（分别为0．312±0．032和0．600±0．046,P〈0．05）。在抑制FoxO1和吡格列酮干预后此趋势有所缓解,逐渐接近于空白对照组。FoxO1mRNA、PPAR-γ mRNA和PPAR-γ蛋白表达与葡萄糖消耗量高度相关。结论FoxO1表达升高或降低对葡萄糖代谢产生不利影响;增强PPAR-γ表达可有效恢复高胰岛素诱导的高糖,增加肝细胞的胰岛素敏感性。     

眼镜蛇毒细胞毒素13诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及对Bcl-2家族基因表达的影响

目的 研究眼镜蛇毒细胞毒素13诱导人脐静脉内皮细胞凋亡作用及其对Bcl-2家族基因表达的影响.方法 CCK-8法测定细胞毒素13对人脐静脉内皮细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞凋亡形态学改变;流式细胞术分析DNA倍体及细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应检测Bcl-2、Bax和Bcl-x_L基因表达的变化,Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白表达的变化.结果 细胞毒素13对人脐静脉内皮细胞增殖具有显著的抑制作用,并可诱导其发生凋亡,其抑制作用呈剂量依赖性.细胞毒素13可上调促凋亡蛋白Bax,而对抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x_L的表达无明显影响.结论 细胞毒素13可能通过上调Bax表达诱导细胞凋亡,抑制人脐静脉内皮细胞增殖.     

小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(SiRNA)抑制核转录因子(NF)-κB活化对肝癌细胞凋亡的影响.方法 化学合成NF-κB siRNA和阴性对照siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,用巢式RT-PCR和荧光定量PCR检测NF-κB mRNA表达情况;免疫组织化学法、酶联免疫吸附法、Western b10t检测NF-κB蛋白表达情况;用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素法检测细胞凋亡,分析NF-κB表达抑制和细胞凋亡间关系.多个样本均数间的比较先行方差齐性检验,方差齐时行单因素方差分析;计数资料比较采用确切概率法分析.结果 NF-κBp65 mRNA在HepG2细胞相对表达量为1.13±0.03,在正常肝细胞L02为0.29±0.07,两者比较,t=27.02,P<0.05,差异有统计学意义.利用NF-κB siRNA干扰可下调NF-κB表达,且呈剂量、时间依赖;NF-κB siRNA转染HepG2细胞72h后,NF-κBmRNA和蛋白表达分别下降了93%和62%,抑制NF-κB表达使HepG2细胞凋亡增加85%. 结论 NF-κB在肝癌细胞中高表达,NF-κB SiRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中活化并促进癌细胞凋亡发生.     

靶向封闭EEF1A2对胰腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 观察靶向封闭EEF1A2基因对胰腺癌细胞株凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外转录制备2对EEF1A2 siRNA,应用脂质体技术转染胰腺癌细胞株BxPC-3,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后EEF1A2基因表达的变化.运用膜联蛋白V/碘化丙啶法检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)细胞色素C和Bid等凋亡相关蛋白表达变化.结果 2对EEF1A2 siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中第2对siRNA静默效果更佳,EEF1A2在mRNA和蛋白质水平的表达抑制率均达75%左右.抑制BxPC-3细胞中EEF1A2的表达后,细胞的早期凋亡率为15.28%±3.65%,显著高于阴性对照组的10.11%±3.05%和空白组的9.41%±4.14%,同时伴随出现caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP和Bid的蛋白活化增强和细胞色素C表达增加.结论 抑制EEF1A2表达能明显诱导胰腺癌细胞BxPC-3的凋亡,而死亡受体途径和线粒体途径的激活可能均参与凋亡的发生.     

siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子,其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高,并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响,从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞,以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达,CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比,EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05）,侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF,P＜0．05）,细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力,证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。     

Down regulation of BCL11B expression inhibits proliferation and induces apoptosis in malignant T cells by BCL11B-935-siRNA

To screen the highly efficient and specific B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma 11B (BCL11B) small interfering RNA (siRNA) which are able to downregulate the BCL11B gene expression in human T-cell acute lymphoblastic leukemia, thereby inhibiting the leukemic T-cell proliferation and inducing apoptosis, four BCL11B-siRNAs and the scrambled non-silencing siRNA control (sc) were designed and obtained by chemosynthesis. After nucleofection, BCL11B expression in the mRNA and the protein levels were measured by qRT-PCR and immunoblotting, respectively. The biological consequences based on the highly efficient and specific BCL11B-siRNA were demonstrated by CCK-8 kit, morphological changes (Hoechst 33258 staining), high-resolution imaging, and flow cytometry. Reduction in the BCL11B mRNA level was observed at 24 or 48 hours in molt-4 T cells with BCL11B-935-siRNA, BCL11B-434-siRNA, or BCL11B-748-siRNA, respectively. BCL11B protein expression levels were reduced by 34·77% and 41·73% in the BCL11B-935-siRNA- and BCL11B-434-siRNA-treated cells, compared with the control level at 72 hours. In comparison with BCL11B-434-siRNA treatment group, the Molt-4 cells transfected with the BCL11B-935-siRNA showed significantly inhibited proliferation and effectively induced apoptosis (P<0·05). When highly efficient and specific BCL11B-935-siRNA was used to analyze the inhibition of BCL11B mRNA level in primary T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cells, similar result was obtained. In conclusion, siRNAs targeting the different exon domains resulted in different silencing effects and biological consequences. Suppression of BCL11B by RNA interference could inhibit the proliferation and induce the apoptosis effectively in leukemic T cells, which might be considered as a new target therapeutic strategy in T-cell malignancies.     

小干扰RNA抑制胃癌细胞环氧合酶-2的表达

目的 观察瞬时转染环氧合酶-2特异性小干扰RNA(COX-2 siRNA)对胃癌细胞增殖与凋亡的影响,探讨COX-2在胃癌发生中的作用和RNA干扰方法 对肿瘤的治疗作用.方法 以胃癌细胞系SGC7901为研究对象,瞬时转染COX-2 siRNA,转染后72 h用RT-PCR方法 分别检测COX-2siRNA组、无意义siRNA组及空白对照组的COX-2 mRNA表达;免疫组化法与Western blot检测3组细胞的COX-2蛋白质的表达;流式细胞仪检测3组的细胞周期和凋亡情况.转染后1周内每天同一时间用噻唑蓝比色分析法(MTr)检测3组癌细胞的活力并计算癌细胞的相对生存率.结果 COX-2siRNA对胃癌细胞中COX-2 mRNA及蛋白表达均有明显抑制作用,胃癌细胞增殖受到抑制,凋亡增加,但细胞周期分布无明显变化.结论 在胃癌细胞中,COX-2表达的抑制可降低胃癌细胞的增殖速度,促进肿瘤细胞凋亡,COX-2在胃癌的发生中可能具有重要作用.     

VEGF基因沉默对胰腺癌细胞化疗敏感性和Akt信号通路的影响

目的 观察靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对胰腺癌BxPC3细胞化疗药物敏感性的影响,并探讨其可能机制.方法 将培养后的BxPC3细胞分为单纯BxPC3细胞组、脂质体处理组、错配siRNA转染组和VEGFsiRNA转染组.以5、10、20、100、200 nmol/L的VEGF siRNA转染BxPC3细胞.采用实时定量RT-PCR和ELASA法检测细胞VEGF mRNA和蛋白的表达;MTT法检测吉西他滨对各组细胞生长的影响;蛋白质印迹法检测BxPC3细胞Akt蛋白的磷酸化.结果 VEGF siRNA转染后,BxPC3细胞VEGF mRNA和蛋白呈浓度和时间依赖性明显下调,但对BxPC3细胞的增殖无明显影响.用0.2 μmol/L吉西他滨处理细胞48 h后,BxPC3细胞组、错配siRNA组及5、10、20 nmol/L siRNA组细胞的生长抑制率分别为(16.9±0.3)%、(17.3±0.3)%、(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%,抑制率与siRNA浓度相关(r=0.928).同时,siRNA转染后细胞Akt蛋白的磷酸化被明显抑制.结论 VEGF基因在胰腺癌BxPC3细胞耐药中起着重要的作用,其机制可能与Akt蛋白磷酸化有关.     

靶向甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因小干扰RNA抑制肝癌细胞生长的研究

目的研究靶向甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)2A基因的小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法以MAT 2A为目的基因,以产生siRNA质粒载体pSilence-2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条siRNA;并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucA-MAT 2A。脂质体转染法将重组质粒载体plucA-MAT 2A与产生siRNA的质粒pSilence-2.1-U6共转染293 T细胞,定量检测荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA,然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞,半定量逆转录聚合酶链反应检测MAT 2A mRNA表达,并检测转染后肝癌细胞MAT的活性,进一步采用四甲基偶氮唑盐法观察siRNA对肝癌细胞生长的抑制率,用流式细胞仪检测siRNA对肝癌细胞凋亡的影响。结果所合成的4条siRNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为81%和89%,并特异性抑制肝癌细胞MAT 2A表达,降低了肝癌细胞中MAT活性,抑制肝癌细胞的生长,诱导肝癌细胞凋亡。结论靶向MAT 2A基因的siRNA抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡;MAT 2A是肝癌基因治疗的一个很有希望的靶位点。