nmhaFGF和haFGF 对放线菌素D诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的 探讨非促分裂型人酸性成纤维细胞生长因子(non-mitogenic human acidic fibmblast growth factor,nmhaFGF)和 haFGF对放线菌素D诱导的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞凋亡的保护作用,同时探讨2种浓度放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡模型的复制条件.方法 用0.25 mg·L-1和0.50 mg·L-1放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡,用琼脂糖凝胶电泳检测2种浓度放线茵素D诱导hRPE细胞DNA断裂情况,并用流式细胞仪检测放线菌素D诱导hRPE细胞的凋亡率,确定诱导hRPE细胞凋亡的条件,分另q以0.02 mg·L-1、0.06 mg·L-1、0.18 mg·L-1、0.54 mg·L-1和1.62 mg·L-1的nmhaFGF和haFGF预作用于hRPE细胞24 h,并设置正常细胞组和凋亡模型细胞组,观察nmhaFGF和haFGF对hRPE细胞凋亡的作用.结果 0.25 nag·L-1和0.50 mg·L-1放线菌素D诱导hRPE细胞凋亡16 h后细胞凋亡率分别为32.68%和53.27%.琼脂糖凝胶电泳结果显示0.25 mg·L-1放线菌素D诱导细胞凋亡条带清晰,而0.50 mg·L-1放线茵素D诱导hRPE细胞凋亡条带模糊,因此0.25 mg·L-1放线菌素D作用hRPE细胞16 h是诱导hRPE细胞凋亡的最佳条件.在nmhaFGF各剂量组中,随着nmhaFGF浓度升高,hRPE细胞凋亡率明显降低,其中1.62 mg·L-1剂量组细胞凋亡率最低,为(11.49±0.50)%;相同浓度haFGF各剂量组细胞凋亡率也呈现不同程度的降低,但随着haFGF剂量升高,凋亡率下降的趋势不如nmhaFcF剂量组明显,在haFGF剂量组中,1.62 mg·L-1剂量组细胞凋亡率最低,为(14.35±1.02)%,nmhaFGF和haFGF对hRPE细胞凋亡率的下降作用经比较差异无统计学意义.结论 haFGF和nmhaFGF都可以发挥对hRPE细胞凋亡的保护作用.该保护作用可能是通过发挥其非促分裂活性实现的.     

脑苷肌肽对rd小鼠视网膜细胞保护作用的研究

目的观察脑苷肌肽(cattle encephalon glycoside and ignotin,CEGI)对体外分离的rd小鼠视网膜细胞的保护作用,旨在探求CEGI对视网膜以及视神经损伤相关疾病的治疗效果,为临床用药提供客观依据和指导。方法采用体外分离rd小鼠视网膜细胞悬液,用MTT和台盼蓝染料排斥法观察CEGI和神经生长因子(NGF)对细胞活性的影响。结果 MTT实验示CEGI8.00mg·L-1、0.04g·L-1、0.20g·L-1和NGF0.04mg·L-1、0.20mg·L-1对视网膜细胞活性有促进作用,尤其以CEGI0.04g·L-1和NGF0.20mg·L-1最为明显,细胞增殖率分别为130.0%±21.8%和124.0%±13.3%。若将二者组合使用,可使细胞增长率达到132.0%±9.1%,与药物空白对照组100.0%±10.1%相比差异均有统计学意义。台盼蓝染料排斥试验结果显示0.04g·L-1CEGI组活细胞比例在除5min外的各时间点,都明显高于对照组,而0.20mg·L-1NGF组也可保护视网膜细胞,主要以短时间点为主(5min～1d),与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 CEGI有促进视网膜细胞生长发育作用,对rd小鼠视网膜细胞有一定的保护作用。     

枸杞多糖对H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 探讨枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)对H2O2诱导人晶状体上皮细胞(SRA01/04)氧化应激损伤的保护作用.方法 将SRA01/04细胞传代培养24h后,加入不同浓度(50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1600 mg·L-1)LBP预处理24 h,之后加入200 μmol·L-1H2O2继续培养24 h,用CCK-8检测LBP对H2O2诱导的SRA01/04细胞活力的影响并筛选出LBP最佳保护浓度用于后续实验.采用流式细胞仪检测SRA01/04细胞凋亡率和线粒体膜电位变化情况,Western blot检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达情况.结果 CCK-8检测结果显示:LBP浓度为200 mg·L-1和400 mg·L-1时,能够促进SRA01/04细胞增殖,细胞存活率分别为(121.10±5.56)％和(128.20 ±3.79)％,与对照组(99.98±4.73)％比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2模型组SRA01/04细胞经氧化应激损伤后,细胞存活率(51.67±4.91)％明显降低,与对照组(99.67±2.52)％相比,差异有统计学意义(P ＜0.001).用200 mg·L-1和400mg·L-1 LBP预处理后,SRA01/04细胞存活率明显提高至(74.01±3.21)％及(84.67±4.33)％,与H2O2模型组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01).400 mg·L-1 LBP对RA01/04细胞氧化应激损伤保护作用最大.流式细胞仪检测结果显示:对照组细胞凋亡率为(5.1±1.2)％;H2O2模型组细胞凋亡率为(25.9±1.5)％;400 mg·L-1 LBP预处理后,细胞凋亡率降至(13.8±1.2)％,与H2O2模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).线粒体膜电位检测结果显示:对照组阳性细胞数最多,线粒体膜电位高;H2O2模型组阳性细胞数最少,线粒体膜电位低;400 mg·L-1 LBP预处理后,阳性细胞数增多及线粒体膜电位升高,与H2O2模型组相比,差异有统计学意义(P＜0.001).Western blot检测显示:与对照组相比,H2O2模型组Bcl-2表达下降,Bax表达上升(P＜0.01);经400 mg·L-1 LBP预处理后,Bcl-2表达上升,Bax表达下降,与H2O2模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 LBP对H2O2诱导人晶状体上皮细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抑制细胞凋亡.     

胰岛素样生长因子结合蛋白-6对RPE细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6,IGFBP-6)对视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)细胞增殖和迁移的影响。方法用IGF-Ⅱ(50mg·L-1)、PDGF(20mg·L-1)、VEGF(40mg·L-1)和TGF-β(4mg·L-1)干预ARPE-19细胞6h,以诱导细胞增殖,再加入不同浓度IGFBP-6(1mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)作用24h、48h后,通过MTS实验观察OD值的变化,研究IGFBP-6对细胞增殖的影响。细胞划痕实验分为IGF-Ⅱ组(50mg·L-1)、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组(含IGF-Ⅱ50mg·L-1和IGFBP-6500mg·L-1)、无血清培养液组的实验,细胞划痕24h、48h后,计算各组细胞移行愈合率的变化,从而研究IGFBP-6对细胞迁移的影响。结果 MTS比色法显示一定浓度的IGFBP-6(100mg·L-1、500mg·L-1、1000mg·L-1)可以抑制IGF-Ⅱ诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),各浓度IGFBP-6对PDGF、VEGF、TGF-β诱导的细胞增殖均无明显影响(均为P>0.05);细胞划痕实验显示,IGF-Ⅱ组、IGF-Ⅱ+IGFBP-6组、无血清培养液组的细胞移行愈合率[分别为(24h:43.91%±3.85%、29.76%±2.49%、26.12%±2.33%;48h:66.09%±1.67%、59.88%±3.43%、57.05%±2.49%)]差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGFBP-6能够抑制IGF-Ⅱ诱导的RPE细胞增殖和迁移。     

Tumstatin肽对视网膜微血管内皮细胞增生和迂移的影响

目的探讨Tumstatin肽对视网膜血管内皮细胞增生和迁移的影响,了解其抑制血管生成的途径。方法采用MTT比色法观察1mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1、20mg.L-1和40mg·L-1的Tumstatin肽(T8肽)对恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)增生的影响;采用流式细胞仪检测20mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞细胞周期的影响;采用划痕修复实验观察0mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的T8肽对RF/6A细胞迁移的影响。结果5mg·L-1以上浓度的T8肽对RF/6A细胞增生有抑制作用且呈剂量依赖性,1mg·L-1、5mg.L-1、10mg·L-1、20mg·L-1和40mg·L-1浓度的T8肽抑制率分别为(2.69±1.10)%、(6.58±1.91)%、(16.77±3.05)%、(31.60±7.57)%和(40.05±8.43)%,各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。未加入T8肽时,RF/6A处于G0～G1期、S期和G2～M期的细胞比例分别为(43.66±1.37)%、(44.13±0.99)%和(12.21±0.39)%,而加入20mg·L-1的T8肽后则分别为(55.27±0.63)%、(28.51±0.68)%和(16.23±1.00)%,细胞凋亡率也由原来的0增加到(7.18±0.25)%,2组比较差异有显著统计学意义(P<0.01)。培养基中加入0mg·L-1、5mg·L-1、10mg·L-1和20mg·L-1的T8肽后RF/6A细胞24h的迁移距离分别为(248.09±2.28)μm、(175.27±3.22)μm、(120.81±3.59)μm和(44.65±1.83)μm,而48h时则为(393.68±2.21)μm、(341.62±4.27)μm、(254.65±2.93)μm和(118.69±5.96)μm,在同一时段,各组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论T8肽能够抑制RF/6A细胞的增生和迁移,使细胞阻滞于G0～G1期及诱导细胞凋亡是其抑制RF/6A细胞生长的原因。     

糖基化终产物诱导视网膜微血管内皮细胞VEGF和ZO-1 mRNA合成的变化

目的 观察糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)作用下,大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMEC)的增生和活力的变化,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)合成和紧密链接蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)mRNA合成的变化.方法 采用免疫磁珠法分离培养rRMEC,0 mg·L-1、10 mg·L-1、100 mg·L-1和600 mg·L-1糖基化牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA)作用rRMEc,观察4 d内细胞增生变化,并采用台盼蓝染色法测定细胞活力.不同浓度的AGE-BSA(0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1)作用12 h,100 mg·L-1的AGE-BSA作用不同时间(0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h)后,采用RT-PCR和Elisa测定rRMEC中VEGF mRNA、ZO-1 mRNA和上清中VEGF含量.结果 rRMEC在0 mg·L-1、10 mg·L-1和100 mg·L-1 AGE-BSA环境中可以继续增生,600 mg·L-1细胞增生可能受到抑制,造成rRMEC活力降低.在浓度为10～400 mg·L-1 AGE-BSA作用12 h时,VEGF mRNA合成增强,上清液中VEGF蛋白表达升高;在100 mg·L-1 AGE-BSA作用2～24 h,VEGF mRNA合成首先升高,后降低并趋于稳定;作用后各组均高于作用前(P＜0.01),上清液中VEGF蛋白表达随时间延长逐渐增加.随AGE-BSA浓度的增加,ZO-1 mRNA逐渐降低;随AGE-BSA作用时间的延长,ZO-1 mRNA逐渐降低.结论 在一定范围内,VEGF mRNA和ZO-1 mRNA合成呈AGE-BSA剂量和时间依赖性.VEGF可能是促进rRMEC ZO-1 mRNA合成降低的重要因素之一.     

体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

目的探索以人永生化角膜上皮细胞( immortalized human corneal epithelial cells,ihCEC) 培养液体外模拟角膜上皮细胞微环境,诱导人羊膜上皮细胞( human corneal epithe-lial cells,hAEC) 分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法取( 37 ± 1) 周剖宫产人羊膜组织,酶消化法提取 hAEC; 流式细胞仪测 CD29、CD90、CD105、CD34、HLA-DR 的表达。复苏培养 ihCEC,以 0 mg·L- 1、10 mg·L- 1、20 mg·L- 1、30 mg·L- 1、40 mg·L- 1丝裂霉素 37℃作用 2 h,吸去丝裂霉素,继续培养 72 h 后 CCK8 测吸光度并计算增殖抑制率。10 mg·L- 1、20 mg·L- 1丝裂霉素处理细胞后 12 h、24 h 收集细胞培养液培养 hAEC,CCK8 测吸光度绘制生长曲线; 收集 ihCEC 细胞培养液,制备条件培养基( CM) 培养 hAEC 10 d,倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光检测 CK12 的表达。结果 hAEC 可表达 CD29、CD90、D105,不表达 CD34、HLA-DR; 各浓度丝裂霉素组增殖抑制率分别为 10 mg·L- 1( 65. 48% ±1. 03) 、20 mg · L- 1( 77. 01% ± 0. 99) 、30 mg · L- 1( 75. 25% ± 0. 71) 、40 mg · L- 1( 76. 90% ±0. 97) ;20 mg·L- 1丝裂霉素培养 12 h 收集的细胞培养液对 hAEC 具有明显促增殖作用; 诱导分化后 hAEC 可表达 CK12。结论以 ihCEC 细胞培养液模拟的角膜上皮细胞微环境可诱导 hAEC 分化为角膜上皮样细胞。     

环孢霉素A抑制人视网膜色素上皮细胞增生的体外研究

目的 观察环孢霉素A(cyclosporine,CsA)对体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增生的影响作用.方法 取体外培养人RPE细胞进行分组实验,实验分对照组和实验组:对照组用DMEM培养液继续培养;实验组按所加CsA浓度的不同分为0.20 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.80 mg·L-1、1.60 mg·L-1、3.20 mg·L-1、6.40 mg·L-1.时间效应关系分别于CsA作用24 h、48 h、72 h后测定.对照组和实验组均用MTT比色法测吸光度A值.结果 CsA浓度为0.20 mg·L-1时,作用72 h后差异有统计学意义(P＜0.05);CsA浓度≥0.40 mg·L-1时,作用24 h即差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CsA能够抑制体外培养的RPE细胞的生长,这种抑制作用在一定浓度范围内有剂量时间效应.     

黄芪多糖对过氧化氢诱导人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的观察黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)氧化损伤的保护作用。方法培养的人RPE细胞系ARPE-19分为正常对照组、过氧化氢损伤组和不同浓度(1000 mg·L-1、500mg·L-1)APS干预组,正常对照组不作任何处理,过氧化氢损伤组加入200μmol·L-1过氧化氢,APS干预组加入不同浓度(1000 mg·L-1、500 mg·L-1)APS后加入200μmol·L-1过氧化氢。用倒置荧光显微镜观察各组细胞形态变化;MTT检测各组细胞活性;DAPI染色观察各组细胞核形态学变化;实时细胞电子分析系统(real-time cell electronic sensing system,RT-CES)实时记录细胞生长状态;应用caspase-3活性检测试剂盒测定各组细胞中caspase-3的活性。结果过氧化氢损伤组细胞皱缩,悬浮细胞增多,APS干预后细胞状态改善。MTT检测结果显示:1000 mg·L-1、500 mg·L-1APS孵育24 h后细胞存活率分别为(99.86±3.64)%和(101.03±3.52)%,与正常对照组(100%)相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05),过氧化氢损伤组细胞存活率为(56.49±2.30)%,与正常对照组相比显著降低(P<0.01),1000 mg·L-1、500 mg·L-1APS干预后,细胞存活率升高到(88.14±2.97)%和(80.75±3.13)%,与过氧化氢损伤组相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。DAPI染色显示正常细胞核均匀淡染,过氧化氢损伤组出现强荧光点和致密的细胞核,APS处理后凋亡程度减轻。RT-CES显示,APS处理可以减少过氧化氢造成的细胞损伤。Caspase-3检测发现过氧化氢造成细胞caspase-3水平升高,APS处理后caspase-3水平下降。结论 APS可以抑制过氧化氢诱导的人RPE细胞系ARPE-19的凋亡,这为APS的临床应用提供了一定的实验基础。     

骨连蛋白对人晶状体上皮细胞在人工晶状体上黏附的影响

目的 通过观察骨连蛋白的微量加入对晶状体上皮细胞黏附于人工晶状体表面的数目及形态特征的影响,探讨骨连蛋白有效抑制晶状体上皮细胞黏附的可行性.方法 传代培养永生化的人晶状体上皮细胞系SRA01/04,分别制备含0 mg·L-1、0.2 mg·L-1、1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的骨连蛋白完全培养液,然后滴加到嵌入琼脂板的人工晶状体上,在CO2培养箱中连续培养.分别于培养1 d、3 d、7 d后,在倒置显微镜下观察细胞变化,并用血小板计数法计数人工晶状体表面黏附的细胞数,进行比较.结果 浓度为0.2 mg·L-1时骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(266.25±4.97)mm-2、(270.82±7.47)mm-2、(241.44±17.14)mm-2]有抑制黏附的趋势,但与0 mg·L-1浓度组[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(274.63±6.67)mm-2、(277.78±7.37)mm-2、(261.71±13.23)mm-2]相比差异无统计学意义(P＞0.05);1.0 mg·L-1骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(199.86±5.91)mm-2,(162.12±6.11)mm-2、(156.94±4.90)mm-2]即可见明确的抑制作用(P＜0.01);5.0 mg·L-1骨连蛋白[作用1 d、3 d、7 d后黏附的细胞数分别为(180.30±7.37)mm-2,(141.16±10.83)mm-2,(130.41±13.50)mm-2]作用更加明显(P=0.00).作用1 d时各浓度组未见明确改变(P＞0.05),3 d、7 d时可见明确的抑制作用(P＜0.01).结论 骨连蛋白可以抑制晶状体上皮细胞在人工晶状体表面黏附,其作用浓度及作用时间呈现正相关性.     

阿克替苷通过激活血红素加氧酶-1抑制H_(2)O_(2)诱导的视网膜神经节细胞氧化损伤北大核心

目的研究阿克替苷对视网膜神经节细胞(RGC-5)的保护作用及其机制。方法将RGC-5细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组、阿克替苷+H_(2)O_(2)组(1μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)阿克替苷分别预处理细胞2 h),MTT法检测各组细胞活力;后续实验阿克替苷+H_(2)O_(2)组选择阿克替苷30μmol·L^(-1)作为治疗浓度,荧光探针H2DCF-DA检测活性氧(ROS)产生和罗丹明123检测线粒体膜电位,Western blot检测各组细胞中Bcl-2、Bcl-2/Bax、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达。机制研究中首先用不同浓度阿克替苷单独处理RGC-5细胞24 h,Western blot检测血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达水平,进一步锌原卟啉(ZnPP)预处理RGC-5细胞1 h,而后30μmol·L^(-1)阿克替苷单独预处理后与200μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)共孵育24 h,通过MTT法测定细胞活力。结果与对照组相比,H_(2)O_(2)组中细胞活力明显降低(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,阿克替苷+H_(2)O_(2)组中10μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)阿克替苷预处理可显著提高细胞活力(P<0.05、P<0.01)。与对照组相比,H_(2)O_(2)组RGC-5细胞ROS生成明显增加,线料体膜电位显著降低,同时Bcl-2/Bax比值降低和Caspase-3蛋白相对表达量增加(均为P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,阿克替苷+H_(2)O_(2)组RGC-5细胞ROS生成减少,线粒体膜电位增加,Bcl-2/Bax比值提高,Caspase-3蛋白相对表达量减少(均为P<0.05)。与阿克替苷未处理组相比,阿克替苷剂量依赖性诱导HO-1蛋白的表达,与阿克替苷+H_(2)O_(2)组相比,加入ZnPP后细胞活力降低(P<0.01),说明HO-1抑制剂ZnPP降低了阿克替苷对H_(2)O_(2)损伤的抑制作用。结论阿克替苷能够通过上调HO-1表达抑制H_(2)O_(2)诱导的RGC-5氧化应激损伤。     

甘草查尔酮A对过氧化氢致视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的　研究甘草查尔酮A（licochalcone A,LCA）对过氧化氢（H₂O₂）致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGC）损伤的保护作用,为LCA在青光眼治疗方面的应用提供初步的实验依据。方法　体外培养RGC-5细胞,随机分为对照组（正常培养基培养）、H₂O₂组（培养基中加入200 μmol·L^-1 H₂O₂）、LCA组（培养基中除加入200 μmol·L^-1 H₂O₂外,还分别加入10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1、40 μmol·L^-1的LCA溶液）,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blotting检测各组细胞中Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞中丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。结果　CCK-8法检测结果显示,10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和40 μmol·L^-1LCA组的细胞存活率分别为（63.7±5.4）%、（78.8±6.3）%和（72.3±6.9）%,与H₂O₂组的（54.3±3.9）%相比,20 μmol·L^-1 LCA组增殖最显著（P＜0.05）。流式细胞术检测结果显示,10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和40 μmol·L^-1LCA组细胞凋亡率分别为（21.1±1.9）%、（12.3±1.3）%和（14.8±2.0）%,与H₂O₂组的（29.3±2.0）%比较,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。Western blotting检测结果显示,与H₂O₂组比较,不同浓度LCA组Bcl-2蛋白的表达均增加,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达均降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。ELISA法检测结果显示,与H₂O₂组比较,不同浓度LCA组RGC-5的丙二醛含量均降低,但超氧化物歧化酶活性均显著增加（均为P＜0.05）。结论　LCA能缓解H₂O₂诱导的RGC损伤,其作用机制可能与抑制细胞凋亡和氧化应激有关。     

血管内皮生长因子-B对高糖环境下人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的探讨血管内皮生长因子-B(vascular endothelial growth factor-B,VEGF-B)对高糖环境下诱导的人视网膜色素上皮细胞(cultured human retinal pigmentepithelial cells-19,ARPE-19)凋亡的保护作用及其机制。方法将ARPE-19细胞分为正常组(体积分数10%胎牛血清+5.6 mmol·L^-1葡萄糖)、高糖组(体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖)、药物组(100μg·L^-1 VEGF-B+体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖)、抑制组20μmol·L^-1 PD98059(ERK1/2阻滞剂)+100μg·L^-1 VEGF-B+体积分数10%胎牛血清+30 mmol·L^-1葡萄糖。倒置显微镜观察细胞的形态变化;CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测蛋白Bcl-2、Bax及细胞外信号调节激酶1/2(extracelluar regulated protein 1/2,ERK1/2)、p-ERK1/2表达水平;实时荧光定量PCR检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表达。结果倒置显微镜发现,高糖组细胞皱缩变小变圆,正常组及药物组细胞体积大、有突起,抑制组细胞形态及数量接近正常组,少许细胞皱缩变圆,体积变小。CCK-8法检测显示,高糖组细胞较正常组存活率降低,药物组较高糖组细胞存活率升高,抑制组细胞存活率介于高糖组和药物组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测显示,高糖组较正常组细胞正常细胞率下降、细胞凋亡率升高,药物组较高糖组正常细胞率升高、细胞凋亡率下降,抑制组细胞凋亡率介于高糖组和药物组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot和实时荧光定量PCR检测显示,高糖组较正常组Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA表达减少、Bax蛋白及Bax mRNA表达增多、Bcl-2/Bax蛋白及mRNA比值均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);药物组较高糖组Bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA增多、Bax蛋白及Bax mRNA减少、Bcl-2/Bax蛋白及mRNA比值均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);高糖组p-ERK1/2表达量较正常组增多、药物组p-ERK1/2较高糖组表达增多、抑制组p-ERK1/2表达量介于药物组和高糖组之间,差异均有统计学意义(均为P<0.05),四组总ERK1/2表达量不变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF-B具有抑制高糖环境培养的ARPE-19细胞凋亡作用,其作用机制部分是通过ERK1/2信号通路,调节Bcl-2和Bax基因表达而实现。     

槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导损伤的视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）诱导的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）损伤的保护作用及其机制。方法　将小鼠RGC随机分为对照组,NMDA组,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组,槲皮素处理组,NMDA+槲皮素+茴香霉素（anisomycin,ANISO）处理组,NMDA+槲皮素+P79350处理组。NMDA组细胞加入100 μmol·L^-1的NMDA作用24 h,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组则在NMDA作用前分别加入相应浓度槲皮素预处理2 h,槲皮素处理组只加入10 μmol·L^-1槲皮素处理,NMDA+槲皮素+ANISO处理组和NMDA+槲皮素+P79350处理组在NMDA和槲皮素处理后分别加入25 μg·L^-1的ANISO和50 μmol·L^-1的P79350处理。随后利用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）试剂盒检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和一氧化氮（nitric oxide,NO）水平,RT-PCR检测细胞中神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA表达,Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p-JNK蛋白表达水平,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性。结果　与对照组比较,NMDA组细胞活性、SOD、Bcl-2 mRNA表达水平降低,LDH,ROS,MDA,NO,iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白表达水平,Caspase-3活性,p-JNK蛋白表达水平,p-p38 MAPK蛋白表达水平,细胞凋亡率均升高（均为P<0.05）。相比于NMDA组,NMDA+槲皮素处理组则提高细胞活性和SOD水平,上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,降低LDH、ROS、MDA和NO,下调iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白,p-JNK蛋白以及p-p38 MAPK蛋白表达,并降低Caspase-3活性和细胞凋亡率（均为P<0.05）。ANISO和P79350抵消槲皮素的作用。结论　槲皮素通过JNK/p38 MAPK信号通路防止NMDA诱导的RGC损伤。     

薯蓣皂苷对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨薯蓣皂苷(Dio)对高糖(HG)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤的保护作用,并分析其机制.方法 用细胞计数试剂8(CCK-8)法筛选葡萄糖浓度和无细胞毒性的Dio剂量范围.将ARPE-19细胞分为对照组(5 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)、模型组(50 mmol·L-1葡萄糖处理48 h)和低、中...     

槲皮素对转化生长因子β1介导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化过程的影响

目的　探讨槲皮素对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、迁移、I型胶原蛋白含量、上皮-间质转化相关标志物表达以及Smad信号通路的影响。方法　取人RPE细胞系（ARPE-19细胞）进行培养,依据干预药物浓度筛选结果设置4个组:对照组、10.0 mg·L^-1TGF-β1组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组、10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组,ARPE-19细胞在4种不同的条件下培养24 h和48 h。采用CCK-8法测定各组细胞活性,Transwell实验检测细胞迁移情况,ELISA检测细胞中I型胶原蛋白含量,Western blot 检测各组细胞上皮-间质转化标志物表达情况及Smad2/3磷酸化情况。结果　处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞存活率均高于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞存活率高于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。处理细胞24 h或48 h,10.0 mg·L^-1TGF-β1组细胞迁移数均多于其他各组（均为P<0.05）;10.0 mg·L^-1TGF-β1+25 μmol·L^-1槲皮素组细胞迁移数多于10.0 mg·L^-1TGF-β1+50 μmol·L^-1槲皮素组（P<0.05）。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,培养基上清液I型胶原蛋白含量升高（P<0.05）,而加入不同浓度槲皮素均能够有效抑制I型胶原蛋白含量的升高（均为P<0.05）。槲皮素以浓度依赖的方式显著降低了TGF-β1所引起的N-钙黏合素和α平滑肌肌动蛋白的表达增高作用;槲皮素可以使紧密连接蛋白ZO-1和E-钙黏合素的表达增高。10 mg·L^-1 TGF-β1处理细胞48 h后,Smad2/3磷酸化显著增加,而槲皮素可以抑制Smad2/3磷酸化。结论　槲皮素能够显著抑制TGF-β1介导的RPE细胞增殖、迁移和胶原分泌,通过调节Smad2/3磷酸化来抑制TGF-β1介导的RPE细胞的上皮-间质转化过程。     

丹酚酸B对高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡、自噬及AMPK信号通路的影响

目的 探讨丹酚酸B对高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡、自噬及AMPK信号通路的影响.方法 提取大鼠视网膜原代Müller细胞,随机分为对照组、高糖组、高糖+丹酚酸B组、高糖+AMPK抑制剂Dorsomorphin(DS)组、高糖+DS+丹酚酸B组、高糖+AICAR组和高糖+AICAR+丹酚酸B组.其中,对照组细胞给...     

川芎嗪对过氧化氢致大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的抑制作用及机制

目的　探讨川芎嗪对H₂O₂诱导的大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）氧化损伤的抑制作用及其机制。方法　在DMEM培养基中培养RGC-5细胞。将细胞分成5组:正常对照组:不做任何处理；阴性对照组:用20 g·L^-1川芎嗪孵育24 h；氧化损伤组:用100 μmol·L^-1的H₂O₂孵育24 h；川芎嗪低浓度组:用20 g·L^-1川芎嗪孵育24 h后加入100 μmol·L^-1的H₂O₂孵育12 h；川芎嗪高浓度组:用40 g·L^-1川芎嗪孵育24 h后加入100 μmol·L^-1 的H₂O₂孵育12 h。通过MTT法测定细胞增殖情况，荧光标记法检测RGC-5细胞内活性氧含量，Hoechst-PI染色观察细胞凋亡情况，使用721D分光光度计测定细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。结果　MTT法测定结果显示，氧化损伤组RGC-5细胞活性明显下降(24.67%±2.90%)，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与氧化损伤组比较，川芎嗪低、高浓度组RGC-5细胞活性分别提高到51.33%±4.35%和60.00%±3.65%，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。荧光标记法显示，氧化损伤组DCF荧光信号明显增强，不同浓度川芎嗪干预后，荧光信号强度逐渐减弱。Hoechst-PI染色显示，氧化损伤组凋亡细胞数增多，甚至出现红染的坏死细胞，细胞凋亡率为66.00%±2.98%；川芎嗪干预后，凋亡及坏死细胞逐渐减少，川芎嗪低、高浓度组细胞凋亡率分别为52.33%±4.11%和46.04%±3.52%，两组细胞凋亡率与氧化损伤组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与阴性对照组比较，氧化损伤组RGC-5细胞内SOD、GSH-PX含量明显下降，MDA含量升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与氧化损伤组比较，川芎嗪高浓度组SOD、GSH-PX含量升高，MDA含量下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与氧化损伤组比较，川芎嗪低浓度组 SOD 与MDA含量变化不大（均为P>0.05），GSH-PX含量升高（P<0.05）。结论　川芎嗪通过改变RGC-5细胞内抗氧化酶表达发挥对氧化损伤的RGC的保护作用。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对视网膜色素上皮细胞增殖及相关因子表达的影响

目的　研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞增殖及相关因子表达的影响。方法　体外培养人RPE细胞,设阴性对照组,40 mg·L^-1、 80 mg·L^-1、 160 mg·L^-1 EGCG 3个浓度药物处理组。利用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达,Western blot检测色素上皮衍生因子受体（pigment epithelium derived factor receptor,PDGFR-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）和IκB蛋白的表达情况。结果　MTT实验结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG药物处理组随着作用时间的延长,对人RPE细胞的增殖抑制作用也逐渐增强;随着药物浓度的增加,EGCG的增殖抑制作用也增强（均为P<0.05）。160 mg·L^-1 的EGCG 在72 h的细胞增殖抑制率达到81.11%。随着EGCG浓度的增加,培养的人RPE细胞中G1期和G2期细胞比例减少,S期细胞比例增加,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组S期细胞比例与阴性对照组相比增加极显著（均为P<0.05）。EGCG对细胞周期的影响作用具有明显的剂量依赖性。与阴性对照组相比,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组细胞内的P21和P27 mRNA表达均有不同程度的升高（均为P<0.05）;40 mg·L^-1 EGCG药物处理组与阴性对照组相比,P27 mRNA表达也增高（P=0.015）,而P21 mRNA表达增高不明显（P=0.824）。P21和P27 mRNA表达量与EGCG浓度呈明显量效依赖关系（均为P<0.05）。Western blot结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG作用人RPE细胞后,NF-κB蛋白表达随着浓度的增加而减少,各药物处理组与阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG亦能够抑制人RPE 细胞IκB蛋白和PDGFR-α蛋白表达,与相应阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。EGCG对人RPE细胞内PDGFR-α、NF-κB和IκB的蛋白表达抑制作用呈明显的浓度依赖性（均为P<0.05）。结论　EGCG可以有效地抑制人RPE细胞的增殖,其机制可能与EGCG将人RPE细胞阻滞于S期,上调P21及P27 mRNA表达,下调PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白表达有关。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的　探讨纳豆激酶（NK）对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）损伤的保护作用。方法　不同浓度的葡萄糖和氯化钴（CoCl₂）诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1（ZO-1）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素（IL）-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组（5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组）、高糖+ CoCl₂组（25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200 μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组）和NK处理组（1.0 μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200 μmol·L^-1 CoCl₂,NK+HG+CoCl₂组）,采用Western blot和RT-qPCR检测各组ARPE-19细胞中ZO-1、HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平。结果　CCK-8法检测结果显示,与NC组比较,CoCl₂浓度高于200 μmol·L^-1的干预组中ARPE-19细胞的活性均明显降低（均为P<0.01）,且细胞形态发生明显改变。Western blot和RT-qPCR检测结果显示,与NC组比较,200 μmol·L^-1CoCl₂的干预组ARPE-19细胞中HIF-1α和VEGFA的蛋白和mRNA与IL-1β和IL-18的mRNA的表达水平均明显增加（均为P<0.01）,而ZO-1蛋白的表达水平均明显降低（均为P<0.05）。CCK-8法检测结果显示,当NK 浓度高于1.0 μmol·L^-1 时, ARPE-19细胞的活性较NC组均明显下降（均为P<0.01）。与HG+CoCl₂组比较,NK+HG+CoCl₂组ARPE-19细胞中HIF-1α、VEGFA蛋白和mRNA的表达水平均显著降低（均为P<0.001）,而ZO-1蛋白的表达水平明显上升（P<0.05）。结论　NK可以降低高糖缺氧损伤的ARPE-19细胞中HIF-1α及VEGFA的蛋白和mRNA表达水平,对高糖缺氧引起的细胞损伤具有保护作用。