骨髓间充质干细胞分化为光感受器样细胞的体外诱导和微环境研究

背景 近年来间充质干细胞(MSCs)在眼科方面已成功诱导分化为角膜细胞、视网膜神经节细胞(RGCs)、视网膜神经样细胞等,但诱导成为光感受器细胞及其微环境的研究尚少. 目的 研究骨髓MSCs(BMSCs)在体外定向分化为光感受器样细胞的可能性及其所需的微环境. 方法 分别将第2代BMSCs细胞株和视网膜色素上皮(RPE)细胞株进行常规培养和传代,取第4代人BMSCs细胞株及第3代RPE细胞株用于实验.将BMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的BMSCs与含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20 μg/L表皮生长因子(EGF)及20 μg/L脑源性神经营养因子(BDNF)的骨髓干细胞培养基(MSCM)及RPE细胞的条件培养液共培养进行BMSCs的诱导分化,而对照组的BMSCs仅用MSCM培养基进行培养,倒置显微镜下观察分化细胞的形态学变化.采用免疫细胞化学法检测RPE细胞诱导BMSCs3、5、7d时细胞中视紫红质蛋白的阳性表达率,以鉴定分化细胞的表型.采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测RPE细胞诱导BMSCs 5 d、7d时细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA的表达情况. 结果 培养的BMSCs形态均一,呈纺锤形或梭形,RPE细胞形态均一,呈多边形或六边形,细胞内充满色素颗粒,生长良好.诱导后的部分BMSCs呈神经样细胞形态,细胞变圆,突起增长,突起末端可见一级、二级分支,相互间连接呈网状.免疫细胞化学法检测表明,诱导组细胞诱导后第3、5、7天细胞中可见视紫红质的表达,表达率分别为(5.83±0.29)％、(20.36±0.32)％和(29.80±2.30)％,明显高于对照组的(0.71±0.35)％、(2.56±0.24)％和(2.32±0.42)％,差异均有统计学意义(t3 d =41.510,ts d=107.290,t7 d=30.036,P＜0.01).RT-PCR法检测显示,诱导后5d、7d诱导组细胞中视紫红质和恢复蛋白mRNA表达的灰度值均明显高于对照组,差异均有统计学意义(视紫红质mRNA:ts d=103.506,t7 d=122.584,P＜0.01;恢复蛋白mRNA:t5 d=106.674,t7 d=189.992,P＜0.01). 结论 采用含bFGF、EGF及BDNF的条件培养基与RPE细胞培养液体外共培养后BMSCs能够诱导分化成光感受器样细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为光感受器样细胞的研究

目的 探讨体外培养的大鼠骨髓问允质干细胞(MSC)诱导为光感受器样细胞的可能性.方法 实验研究.采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞,经流式细胞仪鉴定后,用含小鼠表皮生长因子(EGF)的培养液诱导MSC细胞8～10 d.用免疫组织化学染色观察诱导后的细胞是否表达视紫红质,并用流式细胞术检测表达视紫红质的细胞比例.结果 传3代的MSC细胞生长曲线呈S型,显示培养细胞具有正常的分裂增殖特性;超过70%的传1代和传2代细胞为CD90单阳性,从传3代绌胞开始CD90单阳性的百分数一直高于93%,即采用贴壁筛选法可获得大量高纯度的大鼠骨髓MSC细胞.经EGF诱导后的细胞有15.32%±0.92%表达视紫红质,而未经诱导的细胞表达视紫红质的比例为1.64%±0.78%.结论 经EGF诱导后,15.32%的大鼠MSC可分化为光感受器样细胞.     

牛磺酸体外诱导脐血干细胞分化为感光细胞生物学鉴定

目的 探讨牛磺酸诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)分化为感光细胞的实验条件,并鉴定其生物学特性.方法 从胎儿脐血中分离出MSCs进行原代培养,待细胞融合时,按1:2的比例进行传代.取第3代脐血MSCs用流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44、CD45的表达.另取第3代脐血MSCs在最小必需培养基继续培养8～10 d,应用免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、视紫红质(RHOS)、蛋白激酶C(PKC)、巢蛋白(Nestin)的表达.结果 MSCs培养5～7 d后有间充质样细胞贴壁,3～4周后细胞生长达80%～90%融合,形态学类似骨髓源性MSCs.连续传5代,增生能力未见明显减弱.脐血MSCs的大部分细胞(>90%)处于G0/G.期,可表达MSCs的相关抗原CD29、CD44、CD90,但不表达CD34、CD45.经牛磺酸体外诱导后的脐血MSCs(71.4±11.1)%中等强度以上表达NSE,(21.0±7.8)%的细胞表达Nestin,(30.2±8.9)%表达RHOS,而不表达GFAP、PKC、MAP2.无牛磺酸诱导组的脐血MSCs仅(5.8±2.3)%表达NSE,其他抗原未见表达.结论 脐血的MSCs可在体外纯化增生,经牛磺酸体外诱导能使部分MSCs向感光细胞或表达RHOS的细胞分化.     

大鼠骨髓间充质干细胞在脉络膜新生血管微环境中的分化

目的研究骨髓间充质干细胞（MSCs）在大鼠脉络膜新生血管（CNV）微环境中的分化。方法将体外培养的BN大鼠MSCs植入经氩激光诱导建立的CNV模型大鼠视网膜下腔,用免疫荧光标记的方法对MSCs进行追踪并观察术后1、2、3、4、5周MSCs在CNV微环境中的分化。结果术后第1周即可见MSCs位于CNV表面,但CD31标记阴性,第2周始可见MSCs在CNV内表达CD31阳性,第5周可见移行于光感受器的MSCs表达视紫红质。结论MSCs植入CNV模型大鼠视网膜下腔后可存活,并可向内皮细胞和光感受器细胞方向分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的可行性研究

目的 探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向视网膜色素上皮(RPE)细胞分化的可行性.方法 采用贴壁筛选法分离、培养Brown-Norway(BN)rMSCs.将反复冻融制成的BN大鼠RPE细胞裂解液加入到rMSCs培养体系中,鉴定被诱导的细胞是否同时表达RPE细胞的特征性标记物细胞角蛋白(CK)与S-100.结果 经RPE细胞裂解液诱导的rMSCs生长速度减慢,细胞呈长梭形,周边有毛刺样突起.免疫印迹法和双重免疫荧光标记显示部分经诱导的细胞同时表达CK与S-100.流式细胞术显示14.1%的细胞能够同时表达CK与S-100.结论 rMSCs经RPE细胞裂解液诱导后能够向RPE细胞方向分化.     

人重组表皮生长因子和牛磺酸体外诱导人脐血干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨人重组表皮生长因子(rhEGF)和牛磺酸体外诱导人脐血间充质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的实验条件和可能机制.方法 用含有105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清(FBS)、5%自体血浆、4 mmol/L-谷氨酰胺、30 ng/ml rhEGF的Dulbeceo改良Eagle培养基与F12以1:1混合(DMEM/F-12)培养液对人脐血MSC进行原代培养,传至第3代后改用含牛磺酸的培养基进行诱导.流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44及CD45的表达.免疫细胞化学方法观察神经元特异性烯醇化酶(NSE)、视紫红质、巢蛋白的阳性细胞表达情况.统计学方法采用两组资料的卡方检验分析NSE、视察红质、巢蛋白的表达.结果 脐血MSC首次培养5～7 d,有间充质样细胞贴壁,3～4周后细胞达80%～90%融合,传代后生长加速;形态学类似骨髓源性MSC.脐血MSC均一稳定地表达MSC的相关抗原CD29、CD44、CD90,不表达CD34、CD45.经牛磺酸体外诱导后的脐血MSC中,3120个细胞中有2515个细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),3050个细胞中有903个细胞表达巢蛋白,3175个细胞中有1168个细胞表达视紫红质;未诱导组的2965个脐血MSC中仅有234个细胞表达NSE,其他抗原未见表达.两组间NSE、巢蛋白和视紫红质的表达差异具有统计学意义(χ2=3 242.9,1 073.0,1 444.5;P值均<0.01).结论 人脐血MSC经rhEGF和牛磺酸诱导后能使部分MSC向神经元样细胞或视紫红质阳性细胞分化.     

骨髓间充质干细胞在视网膜色素变性大鼠视网膜下的分化

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)在视网膜色素变性(RP)大鼠体内的分化. 方法 Lewis大鼠腹腔注射3%NaIO3 100mg/kg,建立大鼠RP模型,将体外培养的MSCs植入视网膜下腔,用免疫荧光标记法对MSCs进行追踪,并观察术后第1、2、3、4、5周MSCs在该微环境中的分化.结果 术后第1周即可见MSCs位于视网膜色素上皮(RPE)层与光感受器细胞层,但全角蛋白(PCK)及Rhodopsin标记阴性,第3周开始可见MSCs在体内表达PCK及Rhodopsin.结论 MSCs植入RP模型大鼠视网膜下腔后可存活,主要分布于RPE层和视锥、视杆细胞层,并表达RPE细胞和光感受器细胞的表面标志.     

光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导 MSCs 分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cells , MSCs）成为视网膜样细胞的可能性。 方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs ,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质（Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ,GFAP）等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。 结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。 RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin （0．3915±0．00644）、NSE （0．2019±0．00682）、GFAP （0.1972±0．00211）,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin（0．0983±0．00319）、NSE （0．1048±0．00323）、GFAP （0．1040±0.00254）,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin（0．0044±0．00126）、NSE（0．0498±0．00149）、GFAP（0．0467±0．00333）,组间差异有统计学意义。 结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的初步研究

目的 探讨在体外损伤微环境下,人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为角膜上皮细胞的可行性. 方法体外分离培养人MSCs和人角膜缘干细胞(LSCs),检测细胞CD34、CD44、细胞角蛋白3(CK3)、细胞角蛋白19(CK19)的表达情况.制作人LSCs热损伤模型,加入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的人MSCs共同培养,2周后检测细胞CK19的表达情况.结果 人MSCs CD44表达阳性、CD34表达阴性,流式细胞术显示CD44阳性率为92.59%,CD34阳性率为0.01%;人LSCs CK19表达阳性,CK3表达阴性.共同培养后部分人MSCs CK19表达阳性,并有多核细胞现象.结论 在损伤微环境下,人MSCs可以转化为类角膜上皮细胞的细胞,在此过程中存在细胞融合现象.     

大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植的短期观察

目的探索骨髓间充质干细胞（MSCs）视网膜移植的可行性。方法采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSCs，将溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记的大鼠MSCs悬液经玻璃体腔注入大鼠视网膜下腔。术后14d处死大鼠，取新鲜眼球，连续冰冻切片，经BrdU单抗、FITC标记二抗和Rhodopsin单抗、Cy3标记二抗免疫荧光双重标记后，荧光显微镜下观察。结果荧光显微镜下可见移植后的MSCs主要分布于视网膜色素上皮层和视锥、视杆细胞层，未表达视网膜光感受器细胞的特异性抗原视紫红质。结论移植14d后MSCs可在视网膜下腔存活，主要分布于视网膜色素上皮层和视锥、视杆细胞层，未分化成视网膜光感受器细胞。     

Differentiation of human olfactory mucosa mesenchymal stem cells into photoreceptor cells in vitro

AIM: To investigate whether the human olfactory mucosa mesenchymal stem cells (OM-MSCs) can differentiate into photoreceptor cells in vitro. METHODS: Through the olfactory mucosa adherent method, olfactory mucosa was isolated, cultured and identified in vitro among mesenchymal stem cells. The cell surface markers were analyzed by flow cytometry, induced to differentiate into retinal photoreceptor cells in vitro, and the expression of rhodopsin was observed and identified by Immunofluorescence and Western blot methods. RESULTS: OM-MSCs from human were spindle cell-based, and showing radial colony arrangement. OM-MSCs were negative for CD34, CD45 and CD105, but positive for CD73 and CD90. Following induction, a strong positive reaction was produced by photoreceptor specific marker rhodopsin in the cells.     

Differentiation of rat mesenchymal stem cells transplanted into the subretinal space of sodium iodate-injected rats

Purpose: The differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) was investigated in a retinal pigment epithelium (RPE) damage model induced by the administration of sodium iodate. Methods: Cultured rat MSCs were transfected with enhanced green fluorescent protein and transplanted into the subretinal space of rats injected 4 days earlier with sodium iodate. Immunofluorescence analysis was performed 5 weeks later. Results: The transduction efficiency was 99.9%. Viable MSCs were detected 5 weeks after transplantation, mainly in the subretinal space. The cells expressed pan‐cytokeratin, glial fibrillary acidic protein and rhodopsin. Conclusions: Bone marrow MSCs transplanted into the subretinal space of sodium iodate‐injected rats have the ability to differentiate into RPE, photoreceptor and glial lineage cells.     

种植人骨髓间充质干细胞的猪角膜板层移植治疗兔角膜损伤的初步研究

目的研究种植人骨髓间充质干细胞（MSCs）的猪角膜基质治疗兔角膜损伤的可能性。方法用全骨髓贴壁法分离纯化人MSCs并传代,流式细胞仪检测免疫表型及诱导成脂、成骨分化鉴定。12只新西兰白兔随机分为2组,实验组取第3代MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4 d后移植到广泛损伤的兔角膜上,对照组单纯移植去上皮猪角膜基质。术后2、4、8周,取各实验眼行组织学检查,观察移植的MSCs及猪角膜基质的存活、转归及移植局部的反应。免疫组织化学、免疫荧光染色检测移植后角膜上皮细胞角蛋白12的表达。结果培养获得的MSCs中CD29阳性者占95.97%,CD44阳性者占96.49%,CD90阳性者占92.79%,CD105阳性者占94.66%,CD34阳性者占0.59%,CD45阳性者占0.36%,符合MCSs的免疫表型,并可以诱导成脂及成骨分化。实验组MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,无排斥反应,角膜较对照组透明,新生血管少,而对照组在移植后发生排斥反应。实验组角膜免疫组织化学及免疫荧光染色均检测出CK12阳性细胞。结论种植MSCs的猪角膜基质移植到损伤兔角膜后可以存活,MSCs可以分化为角膜上皮样细胞,具有构建组织工程角膜的潜能。     

人牙周膜干细胞、脐带间充质干细胞对体外培养角膜缘干细胞的影响

目的　比较人牙周膜干细胞（ｈｕｍａｎｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＨＰＤＬＳＣｓ）、人脐带间充质干细胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＨＵＣＭＳＣｓ）作为饲养层培养角膜缘干细胞（ｌｉｍｂａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＬＳＣｓ）的优越性,从而筛选出扩增ＬＳＣｓ的最佳饲养层。方法　体外分离培养ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ,诱导细胞成脂、成骨分化,并检测细胞表面标志物的表达;将兔ＬＳＣｓ与ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ、ＮＩＨ-３Ｔ３共培养和无饲养层单独培养,比较各组克隆形成率,免疫荧光比较各组ＬＳＣｓ克隆团ＡＢＣＢ５、ＩＰＯ１３、ＣＫ３／１２的表达情况。结果　体外培养ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ均可向脂肪、成骨细胞分化,两种细胞均高表达间充质来源的表面标志ＣＤ９０,不表达ＣＤ４５;三组饲养层与兔ＬＳＣｓ共培养均可形成小克隆团, ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组、ＮＩＨ-３Ｔ３组、无饲养层组克隆形成率分别为（４．９０±０．９６）％、（４．１０±０．５６）％、（４．６７±０．７６）％、（０．８３±０．３５）％,四组间总体比较差异有统计学意义（Ｆ＝２２．０４７,Ｐ＝０．００）;ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组与ＮＩＨ-３Ｔ３组的克隆形成率差异均无统计学意义（均为Ｐ＞０．０５）;ＨＰＤＬＳＣｓ组、ＨＵＣＭＳＣｓ组、ＮＩＨ-３Ｔ３组与无饲养层组间差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．０１）。免疫荧光化学检测三种饲养层ＬＳＣｓ标志物ＡＢＣＢ５、ＩＰＯ１３呈高表达,ＣＫ３／１２呈低表达。结论　ＨＰＤＬＳＣｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ均可作为替代饲养层用以培养ＬＳＣｓ。