Cx50 V64G突变的生物信息学分析及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达载体,用生物信息学软件分析V64G突变对人缝隙连接蛋白Cx50的影响。方法:经PCR获得Cx50基因片段,重组至真核表达载体pcDNA3.1/Amp( )中,经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了具有V64G突变的Cx50的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。并证明64位缬氨酸在不同物种的Cx50及在人的多种缝隙连接蛋白是高度保守的区域,与白内障的发生高度相关。结论:pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达质粒的成功构建和鉴定为进一步研究白内障机理奠定了基础。     

LEDGFp52-siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的: 构建 LEDGFp52 基因 RNA 干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法: 以 LEDGFp52 为靶基因, 以 pGenSil-l 质粒为载体, 设计构建重组体, 根据 GenBank 数据库提供的LEDGFp52 基因核苷酸序列, 按照 Tuschl 设计原则, 选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列, 克隆到空载体pGenSil-l 中, 转化 DH5α菌株, 提取质粒, 进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果: 经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致, 重组载体构建成功,重组质粒转染 HeLa 细胞48h, Western blotting 检测到 LEDGFp52 蛋白表达的改变。结论: 利用 RNAi 技术可成功构建抑制 LEDGFp52 表达的小干扰 RNA 重组体。     

A546D突变型TGFBI基因真核表达载体的构建及体外表达

目的 构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体和体外转染体系,为研究野生型及A546D突变型TGFBI基因的功能提供实验基础.方法 应用重叠延伸PCR法定点诱变,构建A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人角膜上皮(human corneal epithelium,HCE)细胞,Western Blot法检测转染后培养基中HCE细胞分泌的TGFBI蛋白的表达.结果 重组质粒总长约7.5 kb,由HindⅢ、Xba Ⅰ双酶切鉴定产生5.4 kb和2.1 kb两条片段者为克隆正确质粒.测序鉴定证实了TGFBI基因编码区完整插入到载体pcDNA3.1的多克隆位点中,突变载体的第1685位碱基由C替换为A,使其编码的第546个氨基酸由Ala突变为Asp即A546D突变.野生型及A546D突变型载体转粢入HCE细胞后,TGFBI蛋白有效表达.结论 成功构建了A546D突变型TGFBI基因真核表达载体,为TGFBI基因相关性角膜营养不良致病机制的研究奠定了基础.     

先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8（mGJA8）,研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF—T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP—N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP—N1-mGJA8和pEGFP—N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达。结果经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达。结论成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础。     

pEGFP-N1-Endostatin重组质粒的构建及其体外表达

目的构建分泌型人内皮抑素（ES）的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒。利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Westernblot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达。结果通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确。采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20 000的人ES蛋白表达。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白。     

POAG相关基因MYOC cDNA的克隆及MYOC/GFP融合蛋白在真核细胞的表达与定位

目的克隆原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）相关基因MYOC cDNA．研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法用RT—PCR法，从人眼组织（角膜缘、睫状体）中扩增MYOC cDNA，克隆入载体pGEM-T，然后酶切．定向克隆到真核表达质粒pEGFP—N3中，构建pEGFP—N3-MYOC重纽旅达质粒，然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后通过脂质体包埋转染法，用pEGFP-N3-MYOC和pEGFP-N3质粒转染Hela和COS-7细胞，用荧光显微镜观察它们在Hela和COS-7细胞内的表达和定位。结果经酶切和DNA序列测定，证实重组质粒构建正确，荧光显微镜观察MYOC／GFP融合蛋白能在Hela和COS-7细胞中表达并且定位在细胞质中．而GFP分布在整个细胞内。结论成功克隆POAG相关基因MYOC cDNA．并且MYOC／GFP融合蛋白只表达在Hela和COS-7细胞质中，这为进一步研究POAG发病机制奠定了基础。     

蛋白酶体β5亚单位基因真核表达载体的构建

目的:构建蛋白酶体亚单位β5基因真核表达质粒。方法:从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA,经RT-PCR扩增获得β5亚单位的全长cDNA片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。结果:RT-PCR法扩增出约792bp的β5亚单位基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的β5亚单位的基因序列完全正确。结论:成功构建了蛋白酶体β5亚单位基因真核表达重组质粒。     

siRNA-LEDGFp52真核表达载体的构建和鉴定

目的构建晶状体来源的上皮生长因子p52（lens epithelium deftved growth factor p52，LEDGFp52）基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）的真核细胞表达载体。方法以LEDGVpS2为靶基因，以pCensil-1质粒为载体，设计构建重组体，根据GenBank数据库提供的LEDGFp52基因核苷酸序列，按照Tuschl设计原则，选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列，克隆到空载体pGensil-1中，转化DH50t菌株，提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。结果经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致，重组载体构建成功，重组质粒转染HeLa细胞48h，Western blotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变。结论利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体。[眼科新进展2,007；27（3）：184．187]     

人TGF-β2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。     

人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区,将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中,进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中.经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.结果:获得了人TGFBI的编码基因,并成功建了其真核表达载体.结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定.     

小鼠B、T淋巴细胞衰减因子真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建小鼠B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）的真核表达载体,并分析其在人胚肾HEK293细胞中的表达,为单纯疱疹性角膜基质炎的免疫治疗奠定基础。方法应用PCR法获得小鼠BTLA胞外功能区的cDNA片段,将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得重组表达质粒pBTLA,经酶切鉴定和测序正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光法、实时定量PCR（real-time PCR）、Western blot技术检测BTLA在细胞中的表达。结果重组质粒pBTLA经酶切鉴定和测序,确认插入序列正确,与基因文库中提供的基因序列同源性达98%～100%。Real-time PCR检测可见转染了重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA mRNA表达增强（P=0.00）,3个组间HEK293细胞内BTLA mRNA表达差异有统计学意义（F=167.83,P=0.00）;Western blot结果显示,转染重组质粒pBTLA的HEK293细胞内BTLA蛋白表达明显增强,转染后24～48 h表达最强。间接免疫荧光结果显示BTLA蛋白主要表达在HEK293细胞的细胞膜和细胞质中。结论成功构建了BTLA的真核表达载体,该重组质粒在HEK293细胞中能够表达BTLA,为后续研究BTLA在抗病毒免疫中的作用奠定基础。     

hTERT启动的双自杀基因CDTK载体的构建

目的:构建hTERT启动子启动的双自杀基因载体CDTK(pc-ChCDTK)。方法:利用PCR扩增CMV增强子、hTERT启动子、yCD及TKgly4种元件,并构建过渡载体T-CMV,T-hTERT,T-yCD,T-TKgly,连至pc-DNA3.1(-)质粒载体上构建成双自杀基因载体pc-DNA3.1-CMV-hTERT-CDTK(pc-ChCDTK);对各个元件、过渡载体及最终载体进行琼脂糖凝胶电泳、酶切和测序鉴定。结果:实验所构建的最终载体的酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得片段大小分别为6773bp和288bp,与预期片段一致;测序证实最终载体与pc-ChCDTK序列一致。结论:成功构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性双自杀基因载体pc-ChCDTK。     

小鼠TGFBI基因真核表达载体的构建和表达

目的构建小鼠TGFBI基因的真核表达载体,为研究角膜营养不良的发病机制奠定基础。方法提取BALB/cBy小鼠正常角膜组织总RNA,经反转录-PCR合成TGFBI cDNA,克隆入真核表达载体pcDNA3.1并测序验证。用不同剂量重组质粒pcDNA3.1-TGFBI转染NIH3T3细胞,通过SYBR荧光实时定量PCR和Western blot检测TGFBI在细胞中的表达。结果测序结果显示扩增到的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,实时定量PCR和Western blot结果显示TGFBI在NIH3T3细胞中表达增强。结论成功构建了小鼠TGFBI基因真核表达载体,并在细胞中进行表达,为进一步研究TGFBI在角膜内的生理、病理功能奠定基础。     

单纯疱疹病毒I型截短糖蛋白B基因序列的克隆及鉴定

目的构建单纯疱疹病毒I型（herpes simplex virusI，HSV—I）SM44株截短糖蛋白B基因序列，为研制联合基因疫苗奠定基础，用于角膜炎的防治。方法利用聚合酶链反应（polymerase chain response，PCR）技术从感染HSV—I SM44株的vero细胞中扩增出HSV-gBt编码基因，经双酶切鉴定后将目的基因定向插入真核表达质粒pcDNA，载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，并对其进行酶切分析和测序鉴定。结果对pcDNA3-gBt双酶切后，电泳可见目的基因（1．5kb）和线性质粒pcDNA3（5．4kb）两条带；测序结果表明，克隆基因插入方向正确，与基因库中登录的HSV-1 F株gB基因序列比较，同源性达99．5％。结论经证实成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3-gBt，为进一步研究其免疫学效应及构建病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎的预防和治疗奠定理论基础.     

内皮抑素基因定点突变体的构建

目的:内皮抑素是一种内源性的血管生成抑制剂。运用定点突变技术对人内皮抑素基因进行改造,将内皮抑素中的RGAD改为RGD序列。构建野生型和突变型RGD-en-dostatin基因的真核表达载体,为进一步探讨其对角膜新生血管的影响奠定基础。方法:以pMD18-T/endostatin载体为模板扩增野生型内皮抑素基因全长编码序列,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP上,采用快速体外定点诱变技术获得RGD突变体。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:PCR成功扩增了野生型和RGD突变型的内皮抑素基因,并成功构建了其真核表达载体。结论:改造的含有RGD结构的内皮抑素基因真核表达质粒的成功构建并鉴定。     

视网膜特异性表达人血管内皮生长因子 基因载体的构建

目的构建在视网膜组织特异性表达的人血管内皮生长因子（VEGF）₁₆₅基因。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从BLAB/C鼠全基因组扩增能在视网膜组织特异性表达的rho启动子，经限制性内切酶纯化后克隆于质粒pcDNA^3.1+-VEGF₁₆₅中，建立重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅,由jetPEI介导转染人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞，并通过免疫组织化学染色以及绘制细胞生长曲线检测在人视网膜色素上皮细胞和人脐静脉内皮细胞中VEGF蛋白的表达。结果在人视网膜色素上皮细胞中，重组质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅比质粒pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅的VEGF蛋白表达强，在人脐静脉内皮细胞，两者的表达量无明显差别。结论pcDNA^3.1+-rho-VEGF₁₆₅载体的构建为进一步研究VEGF在视网膜新生血管形成中的致病机理提供基础材料，并为进一步建立视网膜特异性表达VEGF转基因鼠模型建立了基础。(中华眼底病杂志,2005,21:106-109)     

基质金属蛋白酶3在晶状体上皮细胞中的表达及其意义

背景 后发性白内障是现代白内障囊外摘出术后导致视力下降的常见并发症.基质金属蛋白酶(MMPs)是参与降解除多糖以外全部细胞外基质(ECM)的重要蛋白酶,探讨MMP-3对后发性白内障的基因治疗一直是研究热点,而纤连蛋白(FN)是MMP-3的主要降解底物,能间接反映MMP-3的表达情况.目的 构建pEGFP-N1-MMP-3真核重组质粒并转染晶状体上皮细胞(LECs),观察MMP-3在LECs中的表达,探讨后发性白内障基因治疗的可能性.方法 取6只新鲜猪晶状体,将囊膜用组织块法进行原代培养,获得LECs.用E.coli DH5α MMP-3和E.coli DH5α pEGFP-N1质粒构建MMP-3的真核表达重组质粒pEGFP-N1-MMP-3,通过双酶切,DNA测序分析鉴定人MMP-3片段的准确性.将构建的pEGFP-N1-MMP-3转染至猪LECs中,通过绿色荧光蛋白(GFP)间接观察MMP-3在猪LECs中的表达,用Western blot法检测pEGFP-N1-MMP-3真核重组质粒转染后LECs表达产物FN的相对表达量,间接评估MMP-3的表达量. 结果 双酶切鉴定结果符合质粒pEGFP-N1及目的片段MMP-3大小.软件分析测序结果表明,重组质粒pEGFP-N1-MMP-3中的MMP-3基因与GenBank中的人MMP基因序列相似性达99.6％,表示目的片段已正确插入pEGFP-N1载体.原代培养猪LECs,将重组质粒pEGFP-N1-MMP-3转染入猪LECs,荧光显微镜下可见明显的GFP绿色荧光.Western blot检测表明,FN在pEGFP-N1 -MMP-3真核重组质粒转染组的表达量为0.666±0.008,空质粒转染组FN的表达量为0.326±0.071,差异有统计学意义(P=0.000). 结论 成功构建了pEGFP-N1-MMP-3质粒,并能够在猪LECs中表达,为进一步研究该蛋白在LECs中的表达与功能奠定了基础.