人脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌免疫应答

目的:研究脐血来源树突状细胞(DC)体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌细胞的免疫效应。方法:自人脐血分离单核细胞诱导DC,制备宫颈癌细胞系CaSki冻融物作为抗原负载DC。ELISA法检测成熟DC上清中IL-12的含量,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的CTL对宫颈癌细胞CaSki和HeLa的杀伤作用。结果:与未经抗原负载的DC相比,抗原负载的DC刺激同种异体T细胞增殖和IL-12分泌的能力均有提高(P<0·05),激活的CTL对CaSki细胞有特异性杀伤,而此CTL对HeLa细胞无特异性杀伤。结论:宫颈癌细胞CaSki冻融抗原负载DC激活的CTL可诱导出特异性杀伤宫颈癌细胞的免疫效应。     

负载宫颈癌肿瘤裂解物的树突状细胞诱导的CTL杀伤效应

目的:利用树突状细胞(DC)递呈肿瘤抗原的生物学特性,提高细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对宫颈癌细胞的杀伤活性。方法:联合应用重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导培养宫颈癌患者外周血DC,以宫颈癌组织肿瘤相关抗原(TAA)激活DC,诱导异体T细胞增殖分化为CTL,以MTT法测定CTL增殖活性及其对宫颈癌Hela细胞株的特异性杀伤活性。结果:宫颈癌患者外周血来源DC负载宫颈癌肿瘤裂解物后,可促进CTL增殖,诱导产生的CTL对宫颈癌细胞具有高效而特异的杀伤率,且显著高于异种肿瘤细胞(P<0.05)。结论:DC能递呈宫颈癌肿瘤抗原,诱导产生抗原特异和高效的CTL,提示负载肿瘤裂解物的DC,具有为宫颈癌患者进行特异性免疫治疗的临床应用前景。     

脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌免疫

目的 :研究脐血来源树突状细胞 (DC)的体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应。方法 :①从脐血中分离单个核细胞 (MNCs)后 ,获得单核细胞 (Mo)。粒单集落刺激因子 (GM -CSF)和白介素 4(IL - 4)诱导分化扩增 ,培养 7天后应用流式细胞仪进行表型分析。②诱导单核细胞分化的第 3天加入人卵巢癌细胞株 3A0的冻融抗原 ,共培养 4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC ;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养 3天 ,获得细胞毒T淋巴细胞 (CTL) ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测CTL及上清液对人卵巢癌细胞株 3A0、人胚肾细胞株 2 93T(对照细胞 )、人肝癌细胞株HCCC - 9810的细胞毒作用。结果 :①脐血来源Mo在GM -CSF和IL - 4作用下 ,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CD1a、CD80 (B7- 1)、CD86 (B7- 2 )、HLA -DR、CD83。②DC可负载并递呈肿瘤抗原 ,激活同种异体T淋巴细胞 ,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对卵巢癌细胞 3A0有特异性杀伤、抑制作用 (P <0 .0 5 )。结论 :脐血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC ,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应。     

树突状细胞与卵巢癌细胞的融合及体外抗肿瘤作用的研究

目的 :比较脐血及以卵巢癌患者外周血来源的树突状细胞 (DC)的特点 ,研究DC 卵巢癌融合瘤苗的体外免疫应答效果。方法 :从脐血及卵巢癌患者外周血中诱导扩增DC ,从数量、形态、细胞表面标志及刺激增殖活性方面进行比较。体外培养卵巢癌患者癌细胞 ,将其与脐血DC在聚乙二醇 (PEG)介导下融合 ,活化自体T细胞 ,MTT法检测杀伤效果。结果 :体外诱导卵巢癌患者外周血DC ,每 2 0ml血能够获得 (0 .6～ 1.6 )× 10 6 个细胞 ;体外诱导脐血DC ,每 2 0ml血能够获得 (1.8～ 3.5 )× 10 6 个细胞 ,二者有明显差异 (P<0 .0 5 )。卵巢癌患者外周血DC在混和淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)中显示了更为显著的刺激增殖活性。两者表达高水平的MHCII类分子和共刺激分子。经脐血DC 自体卵巢癌融合细胞活化的T细胞 ,对卵巢癌细胞株细胞的杀伤没有增加 ,而增强了对自体卵巢癌细胞的杀伤力。结论 :由脐血诱导可以获得更多数量的DC。脐血DC与自体卵巢癌细胞融合 ,能使肿瘤相关抗原有效提呈 ,激活T细胞 ,使它成为抗原特异性CTL ,有效杀伤自体癌细胞     

冻融抗原致敏的树突细胞对裸鼠人卵巢癌移植瘤治疗作用的研究

目的 :研究冻融抗原致敏的树突细胞 (DC)对裸鼠人卵巢癌移植瘤的治疗作用。方法 :联合应用粒性白细胞与巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)及白介素 4 (IL 4 )从正常足月产妇分娩后新生儿脐血中培养出DC ,以人卵巢癌细胞系 3AO细胞冻融抗原激活DC ,测定其诱导的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)对 3AO的杀伤活性 ;CTL预防性接种于裸鼠皮下 ,观察裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生率 ,以DC激活的CTL治疗裸鼠人卵巢癌移植瘤并观察治疗效果。结果 :体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激T淋巴细胞增殖 ,其诱导的CTL对细胞系 3AO具有显著的杀伤作用 ,在效靶比为 4 0 :1、2 0 :1、10 :1、5 :1时 72h杀伤率平均分别为 90 .1%、67.4 %、4 0 .4 %、17.8%。DC激活的CTL能预防裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生 (预防组 16.6% ,对照组 10 0 % ,P <0 .0 0 1) ,并能抑制移植瘤生长 ,对照组、治疗组移植瘤的大小分别为 (5 .6± 1.1)cm3 、(2 .7± 0 .78)cm3 (P <0 .0 1)。结论 :人卵巢癌细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC可作为一种抗癌疫苗在免疫治疗卵巢癌患者中发挥重要作用     

转染B7基因的U14疫苗对小鼠宫颈癌的防治作用研究

目的 :探讨转染B7基因的U14疫苗能否在中国 6 15系小鼠体内诱导抗宫颈癌主动免疫应答。方法 :将小鼠B7 1基因导入 6 15系小鼠宫颈癌U14细胞 ,建立高效表达B7 1的U14细胞株 (B7+U14 )及其细胞疫苗。 (1)用B7+U14疫苗免疫 6 15系小鼠 ,观察U14皮下移植成瘤情况 ;(2 )用B7+U14疫苗治疗 6 15系荷瘤小鼠。设立对照组 ,观察各组小鼠的成瘤情况、生存期 ;(3)体外实验检测经B7+U14和U14疫苗免疫小鼠T细胞杀伤肿瘤的活性。结果 :(1)B7+U14疫苗免疫可有效地预防野生型U14细胞移植瘤的产生 (比较肿瘤大小、生存期 :P <0 .0 1) ;(2 )B7+U14疫苗能治愈部分荷瘤小鼠 ,其效果受荷瘤大小的限制 ,肿瘤直径 >3mm时 ,B7+U14疫苗治疗无效 (P <0 .0 5 ) ;(3)经B7+U14和U 14疫苗免疫小鼠T细胞 ,其不同效靶比杀伤肿瘤效率前者明显高于后者 (P <0 .0 0 1)。结论 :转染B7基因的U14细胞疫苗能诱导机体产生有效的抗宫颈癌主动免疫应答。应用转染B7基因的肿瘤细胞疫苗可能成为临床术后治疗宫颈癌的有效辅助方法。     

树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫的实验研究

目的 观察人外周血树突状细胞(Dendritic cells,DC),体外能否诱导抗卵巢癌免疫应答。方法 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)从健康女性外周血分化诱导DC,以源于人卵巢癌细胞系HO-8910的肿瘤抗原粗提物冲击致敏DC,将致敏DC、同源淋巴细胞和卵巢癌细胞共育,观察负载抗原DC体外诱导淋巴细胞对HO-8910细胞的杀伤作用,同时设不同类型肿瘤细胞(Eca-109和PC-12)作为对照。MTT法测定细胞杀伤活性。结果 经卵巢癌细胞HO-8910肿瘤抗原脉冲致敏的DC能诱导淋巴细胞特异性地杀伤卵巢癌细胞。结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α从人外周血诱生的DC能从卵巢癌细胞HO-8910冻融物有效递呈抗原并诱导出高效而特异的抗卵巢癌免疫反应。     

全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆人酵母表达载体pYES2／NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL／6小鼠。ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答水平。结果全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16-E7蛋白免疫（P〈0．01）。结论全酵母疫苗既能表达HPV16-E7蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答。研究结果为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础。     

卵巢上皮性癌抗独特型抗体6B11T细胞表位的鉴定

目的 鉴定卵巢上皮性癌(卵巢癌)抗独特型抗体6B11的T细胞表位,探讨其诱导抗卵巢癌细胞免疫的分子基础.方法 利用表位预测和12结合力分析实验筛选6B11的互补决定区(CDR)人白细胞抗原(HLA)A0201结合肽.以负载肽的抗原递呈细胞刺激HLA-A2阳性的自体淋巴细胞,获得特异性细胞毒淋巴细胞(CTL),经51Cr释放实验确定6B11的CTL表位.以6B11特异性CTL为反应细胞、负载肽的树突状细胞为刺激细胞,经细胞增殖实验确定6B11的辅助性T细胞(Th)表位.经细胞因子含量测定和干扰素(IFN)γ分泌细胞频数分析,进一步验证获得的表位.结果 6B11轻链可变区CDR3肽(VL CDR3)诱导的CTL能杀伤靶抗原阳性的卵巢癌细胞,该杀伤作用能被抗人主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅰ类分子依赖性,为6B11的CTL表位.6B11重链可变区CDR3肽(VH CDR3)能诱导6B11特异性CTL的增殖,该增殖作用大部分能被抗人MHC-Ⅱ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅱ类分子依赖性,为6B11 Th表位.6B11及其表位联合诱导的CTL与卵巢癌细胞共育后均分泌高水平白细胞介素(IL)2(分别为1630、1503 ng/L)、IFN-γ(分别为5620、5421 ng/L)和低水平IL-4(分别为253、274 ng/L),且存在特异性IFN-γ分泌细胞,细胞频数分别为196个/1 ×106个T细胞和184个/1×106个T细胞.结论 6B11具有模拟卵巢癌抗原的CTL和Th表位,对于抗独特型抗体作为抗肿瘤疫苗应用具有重要的理论和实践价值.     

DC融合瘤苗治疗大鼠腹腔播散性卵巢癌

目的:研究树突状细胞(DC)与卵巢癌融合的融合瘤苗对大鼠腹腔播散性卵巢癌的治疗作用,并观察其体内应用的安全性。方法:用聚乙二醇法将Fischer344(F344)大鼠骨髓来源的DC与卵巢癌上皮细胞株NuTu19细胞在体外融合制备融合瘤苗(DCNuTu19)。流式细胞术检测DCNuTu19的免疫相关表型。将DCNuTu19接种于F344大鼠皮下,观察它在体内的成瘤性。用乳酸脱氢酶释放法检测经过DCNuTu19免疫的大鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对NuTu19细胞的杀伤作用。复制腹腔播散性卵巢癌的F344大鼠模型,观察DCNuTu19对它的治疗作用。结果:DCNuTu19高表达主要组织相容性复合物II(MHCII)分子OX6、共刺激分子B72、细胞间粘附分子ICAM1和大鼠DC的标志性抗原整合素OX62。与NuTu19相比,DCNuTu19在大鼠体内成瘤率降低,成瘤时间延迟,两组平均瘤重具有统计学差异(P<0.05)。经DCNuTu19免疫的大鼠脾CTL对NuTu19细胞的杀伤活性显著增高(P<0.01)。与对照组相比,经DCNuTu19治疗后大鼠的病情发展速度减缓,生存期明显延长(P<0.01)。结论:卵巢癌DC融合瘤苗能显著提高大鼠CTL杀伤活性,诱导高效而特异的抗卵巢癌免疫效应,延长患有腹腔播散性卵巢癌大鼠的生存时间。     

Assessment of fusion cells from patient-derived ovarian carcinoma cells and dendritic cells as a vaccine for clinical use

PURPOSE: To evaluate a protocol that allowed the successful generation of DC and OVCA cells, fusion of these two cell types and assessment of stimulatory ability of the fusion cells for clinical use. PATIENTS AND METHODS: Ovarian cancer (OVCA) cells and dendritic cells (DC) were isolated or generated from 22 patients with OVCA and subsequently fused with PEG. The stimulatory ability of fusion cells including T cell proliferation and induction of cytotocic T lymphocytes (CTL) was assessed. In addition, the impact of radiation, freezing and thawing of the fusion cells was evaluated. RESULTS: OVCA cells derived from 22 patients were successfully fused with autologous DC. The created heterokaryons expressed tumor-associated antigens, such as MUC1 and CA-125, and DC-derived MHC class II and costimulatory molecules. The fusion cells were functional in stimulating the proliferation of autologous T cells. In addition, CD4 and CD8 T cells derived from patients with ovarian cancer were stimulated by fusion cells and produced IFN-gamma as demonstrated with intracellular staining. Significantly, T cells primed by fusion cells produced MHC class I-dependent lysis of autologous ovarian tumor cells. One cycle of fusion-cell stimulation can maintain the CTL activity up to 25 days. CONCLUSIONS: The fusion of human OVCA cells and DC created immunogenic cells capable of stimulating CD4 and CD8 T cells. The effects of the processes required for preparing a vaccine for clinical use, including freezing and thawing and irradiation, do not interfere with the immunogenic properties of the fusion cells.     

葡萄球菌肠毒素激活肿瘤浸润淋巴细胞及外周血淋巴细胞体外抗人卵巢癌的对比研究

目的:探讨葡萄球菌肠毒素A(SEA)对卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及其外周血淋巴细胞(PBL)抗瘤活性的诱导作用。方法:取10例卵巢癌伴腹水患者实体瘤、腹水及外周血标本,分离TIL和PBL。在SEA及IL-2作用下培养,定时计数,了解其增殖情况;流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8表达;噻唑蓝(MTT)比色法测定其对K562及自体肿瘤细胞的细胞毒活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中TNF-a和IFN-γ浓度。结果:10例中8例成功分离实体瘤TIL、腹水TIL及PBL。(1)SEA刺激的实体瘤TIL、腹水TIL及PBL增殖速率明显较IL-2诱导组快(P<0.05),但增殖高峰后出现下降趋势,IL-2组未出现此现象;(2)CD3+CD4+及CD3+CD8+T表达率均明显上升,其中SEA诱导组比IL-2组增加比例明显(P<0.05),以SEA作用的CD3+CD8+T比例增加最快;(3)TIL对自体肿瘤细胞的杀伤活性明显高于对K562细胞的杀伤活性(P<0.05),PBL对自体肿瘤细胞的杀伤活性则明显低于对K562细胞的杀伤活性(P<0.05),SEA激活组比IL-2组杀伤率高(P<0.05);(4)各效应细胞分泌的TNF-a、IFN-γ分别在培养的第2天和第4天达到高峰,高峰后迅速下降,SEA诱导组在前10天明显高于IL-2诱导组(P<0.05)。结论:SEA可高效、迅速诱导卵巢癌TIL的抗瘤活性。     

Study of cellular immunity response of mB7-1 gene transfected mouse ovarian cancer cell line and its tumorigenecities in vivo

Ovariancarcinomaremainsthefourthleadingcauseofcancerdeathsinthefemalepopulationandcarrieswithitadisproportionatelyhighmortalityratecomparedwithotherfemalepelviccancers .Althoughgreatapproacheshavebeengotteninsurgery ,chemotherapyand/orradiotherapy ,noobviousincreaseinfive yearsurvivalrateinthisneoplasmcouldbeseen[1] .Itisreasonableforgynecologiststosearchfornewtreatmentstrategyaswellasperfectthecurrenttherapeuticprocedures .Grossinvestigationshaveshowedthatsomeapproachesmaybeparticularlyeffect…     

化疗后淋巴细胞减少期肿瘤疫苗免疫治疗卵巢上皮性癌的动物实验研究

目的 探索化疗后淋巴细胞减少期行免疫重建及应用GM-CSF基因修饰的卵巢上皮性癌(卵巢癌)肿瘤疫苗过继免疫治疗方案增强抗肿瘤免疫反应的机制及效果.方法 以环磷酰胺化疗引起大鼠淋巴细胞减少,并建立免疫重建大鼠模型,用活肿瘤疫苗GM-CSF/NUTU-19免疫大鼠模型,收集肿瘤疫苗免疫部位引流淋巴结,制备效应T淋巴细胞(T_E),酶联免疫吸附试验测定T_E分泌IL(白细胞介素)2、IL-4的能力,细胞内细胞因子染色法测定肿瘤特异性T_E的频数,流式细胞仪测定T_E对靶细胞的特异性细胞毒杀伤率.并将T_E过继回输给腹腔荷卵巢癌的大鼠,观察其生存期.结果 化疗-免疫重建-肿瘤疫苗免疫大鼠T_E分泌的IL-2水平增高,为(65.7±4.0)pg/ml,IL-d.分泌水平降低,为(277±49)pg/ml;细胞内细胞因子染色法结果提示,能分泌干扰素γ的CD_4~+;T淋巴细胞频数增高,为(13.0±2.1)%;T_E对靶细胞的杀伤率提高,为(86.5±1.1)%;经化疗-免疫重建-肿瘤疫苗免疫大鼠T_E过继免疫治疗的荷瘤大鼠生存期延长,平均生存时间为(110±16)d.结论 化疗-免疫重建-肿瘤疫苗免疫治疗能使肿瘤特异性T_E频数增加、功能增强,提高肿瘤特异性杀伤能力,有助于改善肿瘤特异性T_E细胞对肿瘤抗原弱刺激的反应性,增强抗肿瘤免疫反应.