HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

GBP1基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和迁移的影响

目的:观察人类鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和迁移的影响。方法:细胞免疫荧光法检测CaSki细胞中GBP1表达。人工合成针对GBP1基因的小干扰RNA(GBP1-siRNA),体外瞬时转染CaSki细胞。Western blot法检测转染后GBP1蛋白水平变化,CCK-8法检测细胞增殖变化,Transwell小室法检测细胞迁移变化。结果:GBP1主要定位于CaSki细胞胞浆。与对照组比较,GBP1-siRNA转染后细胞中GBP1蛋白水平明显下降(P0.01),细胞增殖能力增高(P0.01),平均细胞穿膜数增高(P0.001)。结论:GBP1基因沉默能促进宫颈癌CaSki细胞的增殖和迁移,GBP1基因的存在可能为宫颈癌的发生发展提供了一道防线,这将为宫颈癌的治疗提供新的思路。     

MTA1基因表达与子宫颈癌细胞侵袭转移的关系

目的：探讨MTA1基因表达与宫颈癌细胞侵袭转移的关系。方法将真核细胞表达载体pcDNA3质粒、MTA1基因表达载体pcDNA3-MTA1质粒、MTA1基因RNA干扰载体pSilencer3.1-MTA1-siRNA质粒稳定转染宫颈癌细胞株CaSki细胞（分别命名为对照组、MTA1组、MTA1 -siRNA组）,逆转录(RT) -PCR技术和蛋白印迹法检测CaSki细胞中MTA1 mRNA和蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及平板集落形成实验检测CaSki细胞的增殖情况,划痕实验、穿膜实验检测CaSki细胞的迁移能力,基质黏附实验检测CaSki细胞的黏附能力,细胞侵袭实验检测CaSki细胞的侵袭能力,流式细胞仪检测CaSki细胞的细胞周期比例。将3组CaSki细胞接种于裸鼠腋下,观察其在裸鼠体内的生长情况。结果 MTA1组细胞中MTA1 mRNA和蛋白的表达强度均明显高于对照组,而MTA1 -siRNA组细胞中MTA1 mRNA和蛋白的表达强度均明显低于对照组。MTT比色法检测显示,与对照组比较,自第2天起,MTA1组细胞的生长速度加快,而MTA1-siRNA组细胞的生长速度减慢,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);平板集落形成实验显示,对照组、MTA1组、MTA1 -siRNA组的克隆数分别为( 133±6)、(169±10)和(57±5)个,MTA1组明显多于对照组（P＜0.05）,而MTA1-siRNA组明显少于对照组(P＜0.05)。划痕实验显示,MTA1组细胞的迁移能力明显增强,而MTA1 -siRNA组细胞的迁移能力明显减弱;穿膜实验显示,对照组、MTA1组、MTA1-siRNA组穿膜细胞数分别为( 153±17)、( 247±38)和(82±10)个,MTA1组明显多于对照组(P＜0.05),而MTA1-siRNA组明显少于对照组(P＜0.05)。基质黏附实验显示,孵育90 min时,对照组、MTA1组、MTA1-siRNA组细胞的黏附率分别为(69.3±3.6)％、(80.4±5.6)％、(39.2±7.4)％,MTA1组明显高于对照组(P＜0.05),而MTA1 -siRNA组明显低于对照组（P＜0.05）。细胞侵袭实验显示,对照组、MTA1组、MTA1 -siRNA组穿膜细胞数分别为(231±19)、(354±36)和(76±7)个,MTA1组明显多于对照组(P＜0.05),而MTA1-siRNA组明显少于对照组(P＜0.05)。流式细胞仪检测显示,对照组、MTA1组、MTA1-siRNA组细胞的G1、S、G2期细胞比例分别比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。裸鼠接种CaSki细胞30d后,对照组、MTA1组、MTA 1-siRNA组裸鼠肿瘤体积分别为(519 ±236)、(2245±780)、(111±65) mm3,肿瘤质量分别为(0.41 ±0.19)、(2.10±0.39)、(0.11±0.08)g,MTA1组均明显高于对照组(P＜0.05),而MTA1 -siRNA组均明显低于对照组(P＜0.05)。结论MTA1基因促进宫颈癌细胞的侵袭转移,沉默MTA1基因表达能使宫颈癌细胞生长减慢,细胞侵袭及转移能力下降,从而逆转宫颈癌细胞的恶性表型,为进一步研究MTA1基因的作用机制以及应用RNA干扰技术进行以MTA1基因为靶点的治疗打下了一定的基础。     

Egr1信号途径参与NDRG1表达调节的机制研究

目的:研究人宫颈癌细胞中早期生长反应基因1(Egr1)信号途径参与N-myc下游调节基因1(NDRG1)表达调节的机制。方法:以人宫颈癌细胞株SiHa为研究对象,利用siRNA干扰技术使Egr1基因沉默,用RT-PCR和W estern blot检测转染前后Egr1表达的变化。通过RT-PCR和W estern blot检测细胞在低氧条件下,以及转染siRNA-Egr1后在低氧或低氧模拟物(DFX)条件下,Egr1与NDRG1表达的变化。结果:siRNA能有效地抑制Egr1基因表达(P0.001)。低氧条件下,Egr1、NDRG1的蛋白水平均明显升高(P0.001)。转染siRNA-Egr1 48h后,细胞在低氧条件下作用1h,Egr1 mRNA表达显著下降(P0.05)。细胞转染siRNA-Egr1 48h后,在低氧及DFX条件下作用24h,结果显示DFX使NDRG1 mRNA的表达显著高于低氧条件(P0.05)。同时也显示siRNA-Egr1能够使NDRG1 mRNA水平明显减少(P0.05)。结论:体内环境因素如低氧、DFX等上调NDRG1基因的表达,通过Egr1信号途径参与NDRG1在宫颈癌细胞中表达的调节。     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义

目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据。方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响。结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07;转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P<0.01)。流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)%、(7.46±2.93)%,差异显著(P<0.01)。结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

野生型p53抑制宫颈癌HeLa细胞的研究

目的:研究外源性野生型p53(wtp53)基因对宫颈癌HeLa细胞中的致癌基因环氧合酶-2(COX-2)的影响,以及抑制HeLa细胞生长的作用。方法:用脂质体介导的转染技术将野生型p53基因转染到HeLa细胞。实验分为2组,p53转染组(p53-HeLa组)和空白对照组(HeLa组),wtp53表达用逆转录-多聚酶链反应鉴定,并检测p53mR-NA和COX-2mRNA瞬时转染及稳定转染前后表达的变化。CCK-8染色法绘制细胞生长曲线。结果:野生型p53基因转染后HeLa细胞中的p53mRNA表达增加,COX-2mRNA表达减少。通过对细胞生长曲线的分析,转染后与转染前相比,生长明显减慢(P<0.01),wtp53对HeLa细胞有抑制作用。结论:外源性wtp53基因表达可抑制宫颈癌He-La细胞中COX-2mRNA的表达;wtp53可能通过抑制COX-2对宫颈癌HeLa细胞产生抑制作用,进而阻碍肿瘤的生长。     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

RNA干扰技术抑制HLX1基因表达对滋养细胞生物学性能的影响

目的:研究小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人类同源异型盒基因HLX1的表达对胎盘滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞生物学性能的影响。方法:常规体外培养HTR-8/SVneo细胞,设实验组(转染HLX1基因的特异性siRNA)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)及空白对照组(除不含siRNA片段,余试剂与另两组相同)3组分别进行瞬时转染。用流式细胞术测定siRNA转染效率,应用实时定量PCR技术和蛋白印迹法测定转染后各组HTR-8/SVneo细胞中HLX1 mRNA和蛋白的表达;应用MTT比色实验、Matrigel侵袭实验分别检测转染后各组细胞的增殖能力与侵袭能力的变化。结果:(1)转染24h后测得siRNA转染效率达(86.3±2.6)%。(2)转染48h后HLX1 mRNA的表达水平下调(77.0±1.2)%(P<0.01),转染72h后HLX1蛋白的表达水平下调(82.6±1.2)%(P<0.01),与HLX1 mRNA的表达水平下调相一致。(3)转染HLX1 siRNA 24h后,HTR-8/SVneo细胞的增殖活性已受到抑制,转染72h后细胞增殖抑制最显著,抑制率达到(58.1±4.4)%(P<0.01)。(4)转染HLX1 siRNA后,HTR-8/SVneo细胞侵袭Matrigel基质胶的能力受到显著抑制,其穿膜细胞数为(29±3)个,与空白对照组(穿膜细胞数为[53±8]个)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HLX1基因表达水平的下降可以显著抑制滋养细胞的增殖活性与侵袭能力;HLX1基因表达异常可能通过影响滋养细胞增殖、侵袭等过程参与IFGR、子痫前期等疾病的发生。     

KiSS-1基因对滋养细胞生物学行为影响的实验研究

目的 :探讨KiSS 1基因对滋养细胞生物学行为的直接影响 ,进一步证实妊娠高血压综合征患者胎盘“浅着床”与滋养细胞中肿瘤转移抑制基因KiSS 1表达增高有关。方法 :含有人KiSS 1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3 KiSS 1经酶切和测序鉴定正确后 ,转染滋养细胞株JAR ,观察其KiSS 1mRNA表达、细胞生长和增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果 :pcDNA3 KiSS 1成功转染JAR细胞 ,KiSS 1mRNA表达阳性 ,而亲本JAR细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无差异 ,但细胞侵袭能力明显下降 ,穿透Matrigel膜细胞数明显少于未转染组。结论 :KiSS 1基因对滋养细胞的生长、增殖能力无影响 ,但抑制其侵袭能力 ,这可能是导致妊高征“浅着床”的原因     

Development of anticancer gene vaccine interact with human papillomavirus oncoprotein inhibition

Adeno-associated virus (AAV) Rep 78 protein is known to inhibit the promoter site of several oncogenes and viral genes, including the human papillomavirus (HPV) type 16 E6 transforming genes. The biochemical studies of Rep 78 have been reported, but the effects of Rep 78 gene-mediated inhibition of HPV 16 E6 promoter activity on the various human cervical carcinoma cells have not been characterized. pEGFP-N1 vector, cloned by AAV-mediated Rep 78, is transfected into cervical carcinoma cells. Transfection efficiency of Rep 78 was approximately 30-60% different. Messenger RNA (mRNA) and protein expression of Rep 78 gene was significantly higher on day 1 of the transfection of Rep 78 DNA in CaSki cells, and DNA level of HPV 16 E6 was decreased on day 1 of the transfection. The growth of CaSki cervical cancer cells was only 10-15% inhibited by Rep 78, and the other cervical cells, HeLa, HeLaS3, HT3, and QGU, were unaffected by Rep 78 transfection. In spite of the high efficiency of Rep 78 gene transformation and expression rate, we could not show the significant growth inhibition in various cervical cancer cell lines. Taken together, long-term expression of Rep 78 strategy might be needed for cervical carcinoma gene therapy using AAV vector.     

Retrovirus-Mediated Delivery of HPV16 E7 Antisense RNA Inhibited Tumorigenicity of CaSki Cells

Objective. In cervical cancer, high-risk human papillomavirus (HPV) genes are expressed solely in cancerous cells and have been proposed to be the most important etiological factors for cervical cancer, thus making them suitable targets for gene therapy. In this study, we aim to inactivate the HPV16 E7 in CaSki cells and test the possibility of reducing the tumorigenicity of these cells.Methods. The full-length HPV16 E7 cDNA was cloned in the pBabe-puro or pWZL-Hygro retrovirus vector in reverse orientation and was stably transfected into CaSki cells by replication-defective retrovirus infection giving rise to CaSki-E7AS and CaSki-E7AS2X cells. Immunoprecipitation/Western analysis and real-time RT-PCR were performed to document the levels of HPV16 E7 gene product. Flow cytometry was performed to study changes in the cell cycle in response to reduced E7 protein. The expression of bcl-2, RB, and E2F-1 was studied using Western blot analysis. Tumorigenicity of CaSki, CaSki-E7AS, and CaSki-E7AS2X cells was assayed with subepidermal tumor growth in nude mice.Results. We have documented that the delivery of the antisense gene construct resulted in the reduction of HPV16 E7 protein expression and cell proliferation in CaSki cells. Furthermore, we demonstrated that these changes were accompanied by cell cycle arrest, up-regulation of RB, and down-regulation of E2F-1 and bcl-2 proteins. More importantly, dose-dependent transduction of the antisense HPV16E7 construct was able to inhibit and/or retard the tumorigenicity of CaSki cells in vivo.Conclusions. Down-regulation of HPV16 E7 with antisense RNA is beneficial in reducing the tumorigenicity of CaSki cells and can potentially be useful for HPV-associated malignancy gene therapy.     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

信号诱导增殖相关蛋白1和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白在宫颈癌中的表达及临床意义

目的:探讨信号诱导增殖相关蛋白1(SIPA1)和16、18型人乳头瘤病毒E6蛋白(HPV16/18E6)在宫颈癌中的表达及其与临床病理之间的关系。方法:Western blot检测宫颈癌C33A、HT3、SiHa、HeLa和CaSki细胞株中HPV16/18E6和SIPA1蛋白表达;免疫组织化学Envi-sion法检测正常宫颈组织(40例)和宫颈癌组织(174例)石蜡标本中HPV16/18E6和SIPA1蛋白;分析SIPA1和HPV16/18E6相互之间及其与宫颈癌盆腔淋巴结转移之间的关系。结果:宫颈癌细胞系中SIPA1与HPV16/18E6表达呈负相关。SIPA1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中阳性率分别为87.5%和58.6%,差异有高度统计学意义(χ2=11.78,P=0.001);SIPA1蛋白在有和无盆腔淋巴结转移时阳性率分别为19.0%和71.2%,差异有高度统计学意义(χ2=21.45,P=0.000),且SIPA1阴性者发生淋巴结转移风险高于阳性者(OR=5.011,95%CI2.311～10.866,P<0.01)。HPV16/18E6在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的阳性率分别为30.0%和79....