乙型肝炎病毒cccDNA检测方法及临床应用研究进展

共价闭合环状DNA（covalently closed circular．DNA，cccDNA）是HBV DNA在宿主细胞核内的存在形式，是HBV复制和转录的模板，长期存在于细胞核中且药物难以清除，成为HBV慢性感染的主要因素之一。由于目前尚无成熟的便于推广应用的cccDNA检测方法，学者们对HBV cccDNA检测方法及临床应用进行了广泛的研究。本文综述了近年来该方面的研究进展。     

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBcVccDNA

目的:建立套式聚合酶链反应法(nPCR)检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)。方法:根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列,设计两套相对保守的引物,建立HBV cccDNA套式PCR,并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果:该法检测200例慢性乙型肝炎患者,HBV cccDNA阳性率为60%。结论:套式PCR法简便、灵敏,可用于测定PBMC中HBV cccDNA。     

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBV cccDNA

目的：建立套式聚合酶链反应法（nPCR）检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）。方法：根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列，设计两套相对保守的引物，建立HBV cccDNA套式PCR，并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果：该法检测200例慢性乙型肝炎患者，HBV cccDNA阳性率为60％。结论：套式PCR法简便、灵敏，可用于测定PBMC中HBV cccDNA。     

荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立

目的:建立特异、灵敏的荧光PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法.方法:首先用煮沸法提取血清中的HBVDNA,然后用绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)消化松弛环状HBV DNA(rcDNA),保留共价闭合环状DNA(cccDNA).设计一条嵌合引物,该引物分为两部分序列,近5'部分为人为设定的序列,近3'部分是与正链缺口下游互补序列.先用该嵌合引物以正链为模板,自HBV cccDNA1590nt开始向上游延伸,然后以嵌合引物中人为设定的序列为下游引物、与负链互补的上游引物以及一条在两引物之间与正链互补的Taqman探针,扩增检测嵌合引物延伸的产物.由于带有缺口的HBV rcDNA无法被嵌合引物延伸,因此最终只能扩增检测到cccDNA.结果:用含有相应HBV DNA片端的PUC19质粒模拟HBV cccDNA,该检测方法的检测灵敏度为1×103拷贝/ml;以模拟松弛环状DNA(rcDNA)与模拟HBV cccDNA按不同比例混合,在rcDNA与cccDNA的比为1×109拷贝/ml:1×103拷贝/ml时,该方法仍可检测到模拟cccDNA;单独检测模拟rcDNA浓度为1 × 109拷贝/ml时,该方法检测未出现假阳性.结论:该检测乙型肝炎病毒cccDNA的方法操作简单、灵敏、特异.适用于检测血清中HBV cccDNA.     

HBV感染患者外周血单个核细胞HBV DNA和cccDNA的检测

目的 探讨乙型肝炎患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）能否感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）并进行复制。方法 选取 137例住院患者作为研究对象,采集血液标本,分离提取外周血单个核细胞,使用细胞甩片法固定细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR）和滚环扩增结合原位跨缺口原位聚合酶链式反应技术检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）;免疫组织化学染色法检测HBV DNA和HBV cccDNA表达。结果 137例标本中,68.6%（94/137）的标本经免疫组化染色后检测出HBV DNA的表达;83.9%（115/137）的标本原位杂交和滚环扩增PCR后检出HBV cccDNA阳性信号;血清HBV DNA浓度高于106 copies/ml的患者PBMC中HBV cccDNA阳性率为95.1%,低于106 copies/ml的阳性率为51.4%。结论 高浓度外周血HBV DNA是HBV感染外周血单个核细胞的危险因素,通过原位聚合酶链式反应方法能够更灵敏地检测HBV DNA和cccDNA在PBMC中的表达,为进一步研究证实PBMC感染导致HBV母婴传播途径的分子机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒前基因组RNA检测在乙型肝炎治疗中的临床研究

目的探讨乙型肝炎病毒前基因组RNA(HBV-pgRNA)的检测在乙型肝炎治疗中的临床价值。方法选取怀化市第一人民医院2017年5月-2018年10月收治的乙型肝炎患者80例,采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测不同感染阶段及治疗期间患者血清HBV pgRNA、HBV DNA水平,用化学发光法检测血清乙肝表面抗原(HBsAg)滴度,肝活检组织中提取DNA后检测共价闭合环状DNA(cccDNA),分析HBV pgRNA与HBV DNA、HBsAg、cccDNA的相关性及预测患者治疗的价值。结果血清HBV pgRNA、HBV DNA在乙肝e抗原(HBeAg)阳性慢性HBV感染期(Ⅰ+Ⅱ)最高,HBeAg阴性慢性HBV感染期(Ⅲ+Ⅳ)最低,血清HBsAg水平和肝内cccDNA水平在四个阶段保持相对稳定。对总体患者、Ⅰ期和II期患者,HBV pgRNA与HBV DNA、HBsAg、cccDNA均成正相关(P<0.05);HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg、cccDNA水平治疗后均下降,除HBsAg治疗后12个月与6个月无统计学差异外,其他各指标治疗后与前一治疗阶段差异均有统计学意义(P<0.05);HBV cccDNA水平(AUC=0.773)是HBsAg血清转换的最佳预测指标,其次是HBV pgRNA水平(AUC=0.743)。HBV pgRNA水平对HBsAg血清转换预测敏感度89.11%,特异度81.23%,准确度85.72%。结论HBV pgRNA的动态变化可以作为一种新的标志物来预测HBeAg阳性患者治疗。     

乙肝病毒共价闭合环状DNA标准品制备及鉴定

目的通过构建乙肝病毒(HBV)重组质粒来制备共价闭合环状DNA(cccDNA),为cccDNA定量检测提供合适的标准品。方法选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒。以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测。结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒。2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段(约3.2 kb)和载体DNA片段(约2.7 kb);经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×10~(10)IU/ml和6.19×10~9IU/ml。结论利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×100-3.44×109copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 100-3.44×109 copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×100copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 102倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.

Abstract：

Objective To establish and optimize a sensitive and specific quantitative realtime polymerase chain reaction(PCR)method for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA(HBV cccDNA)in liver tissue. Methods Specific primers and probes were designed to detect HBV DNA(tDNA)and cccDNA. A series of plasmids(3.44 × 100-3.44 × 109 copies/μl)containing a full double-stranded copies of HBV genome(genotype C)were used to establish the standard curve of real-time PCR. Liver samples of 33 patients with HBV related hepatocellular carcinoma(HCC), 13 Chronic hepatitis B patients(CHB)and 10 non-HBV patients were collected to verify the sensitivity and specificity of the assay. A fraction of extracted DNA was digested with a Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase(PSAD)for HBV cccDNA detection and the remaining was used for tDNA and β-globin detection. The amount(copies/cell)of HBV cccDNA and tDNA were measured by a real-time PCR, using β-globin housekeeping gene as a quantitation standard. Results The standard curves of real-time PCR with a linear range of 3.44 × 100 to 3.44 × 109 copies/μl were established for detecting HBV cccDNA and tDNA, and both of the lowest detection limits of HBV cccDNA and tDNA were 3.44 × 100 copies/μl. The lowest quantitation levels of HBV cccDNA in liver tissues tested in 33 HBV related HCC patients and 13 CHB patients were 0.003 copies/cell and 0.031copies/cell, respectively. HBV cccDNA and tDNA in liver tissue of 10 non-HBV patient appeared to be negative. The true positive rate was increasing through the digestion of HBV DNA by PSAD, and the analytic specificity of cccDNA detection improved by 7.24 × 102 times. Liver tissues of 2 patients were retested 5 times in the PCR for detecting cccDNA and the coefficience of variations on cycle threshold (Ct)were between 0.224%-0.609%. Conclusion A highly sensitive and specific quantitative real time PCR method for the detection of HBV cccDNA in liver tissue was established and could be used for clinical and epidemiological studies.     

人卵巢组织中HBV DNA和HBV cccDNA的表达与HBV宫内感染的相关性研究

目的研究人卵巢组织中乙型肝炎病毒(HBV)DNA、HBV共价闭合脱氧核糖核酸(cccDNA)表达与HBV宫内感染的相关性。方法采用荧光定量聚合酶链反应方法(FQ-PCR)检测33例HBV DNA阳性孕妇卵巢组织中的HBV DNA和HBV cccDNA。采用化学发光法检测相应33例婴儿出生当日和1月龄外周血血清乙型肝炎病毒标志物(HBVM),FQ．PCR法检测婴儿血清HBVDNA含量。结果33例卵巢组织中HBVDNA和HBV cccDNA总阳性率为51．52%(17/33)。婴儿宫内感染率为12．12%(4/33,4例均为肝功能正常的孕妇)。婴儿母亲卵巢组织中HBVDNA和HBV cccDNA均阳性时,宫内感染率比HBVDNA、HBV cccDNA均阴性时显著升高(P<0．05)。宫内感染婴儿较非宫内感染婴儿母亲卵巢组织中HBV cccDNA的表达水平和阳性率明显升高(P<0．01和P<0．05)。结论HBV可感染人卵巢组织并在其中复制,且有可能通过卵细胞垂直传播至子代。     

肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立

目的 建立和优化一种灵敏、特异的检测肝组织中乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)荧光定量聚合酶链反应(荧光定量PCR).方法 设计检测HBV DNA(tDNA)和cccDNA特异性引物及探针,用3.44×10⁰-3.44×10⁹copies/μl含HBV全基因组序列(C基因型)质粒作为标准品,建立荧光定量PCR检测标准曲线.取33例乙肝肝癌患者肝组织标本、13例慢性乙肝患者肝活检组织标本和10例非乙肝患者肝组织标本,验证该法灵敏度和特异度.提取肝组织中DNA,取一部分进行质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切;另一部分不酶切作为tDNA和β-globin检测样本,分别进行HBV cccDNA、tDNA和p-globin定量检测,以β-globin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和tDNA含量进行标准化.结果 检测肝组织中HBV cccDNA和tDNA定量的线型范围均为3.44 × 10⁰-3.44×10⁹ copies/μl.检测HBV cccDNA和HBV DNA下限均为3.44×10⁰copies/μl.33例乙肝肝癌患者和13例慢性乙肝患者的肝组织中HBV cccDNA最低含量分别为0.003 copies/cell和0.031 copies/cell;检测10份非乙肝肝癌患者的肝组织标本均为阴性.应用PSAD消化肝组织中提取的DNA可减少假阳性,提高cccDNA检测法特异度达7.24× 10²倍.对2例乙肝肝癌患者的肝组织标本重复检测5次,Ct值的变异系数为0.224%～0.609%.结论 该方法灵敏度和特异度高,重复性好,可用于检测肝组织中HBV cccDNA.