质粒DNA的快速提取及其在重组子大量筛选中的应用

[目的 ]介绍一种质粒DNA的快速提取方法及其在重组子大量筛选中的应用。[方法 ]利用微量碱变性一步法快速提取质粒DNA。[结果 ]应用该法能在大量的重组菌株中筛选出所需的重组质粒。[结论 ]本法便捷、经济 ,适合于在大量DNA文库中筛选出所需目的基因     

一种快速提取质粒DNA的方法

分子生物学技术发展迅猛,提取质粒DNA方法向着高通量、快速高效、广泛适用的方向发展.本实验采用二氧化硅修饰的磁珠设计了一种快速分离质粒DNA的试剂盒,并设计了多种引物,探索同一质粒DNA对两对引物,同一基因组DNA对两对引物进行PCR验证.结果表明:含磁性磁珠的试剂盒能够在10min内完成提取,产量较高;且样品对PCR无抑制作用,并适用于多种样品,应用此方法提取的DNA还可用于多重PCR.     

肺炎支原体克隆基因的鉴定

我室在提取和纯化肺炎支原体DNA的基础上,将其DNA酶切片段重组到pBR~(322)的PstI位点再转入E.CoLi RR_1建立了肺炎支原体克隆基因重组菌株。我们采用快速抽提方法,证明了所检测的质粒为重组质粒。用限制性内切酶酶切重组质粒显示出外源DNA片段。进一步用肺炎支原体DNA探针证明此外源DNA片段为肺炎支原体DNA片段,从而证明所检测的质粒为肺炎支原体重组质粒。为分了流行病学调查及病原学诊断提供了依据。     

Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG的应用体会

目的探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒,将环状质性DNA酶切为线性,0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD（A260/A280）比较差异无统计学意义[分别为（1.8±0.6）,（1.9±0.4）,P〉0.05],经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA,Chelex-100法简便、省时,值得推广。     

沙门氏菌毒力相关质粒的研究

质粒是细菌染色体外具有遗传功能的环形链DNA,它有自主复制的能力。在细菌分裂时,可以伴随染色体分配到子细胞,并在细菌的后代存续。虽然质粒DNA上有某些基因,可编码控制细菌某些特性。但质粒并不是细菌生存所必需物质。因此,质粒的研究工作对于细菌生物学理论及实际应用都有重要意义。 质粒提取程序多样,其原理是利用宿主细胞染色体与质粒DNA的差异。对于大多数沙门氏菌菌株,一般都采用     

德国小蠊DNA的提取方法

德国小蠊DNA的提取通常采用破碎细胞方法，包括匀浆法、液氮破碎法、超声波法及生殖细胞冰片法。在提取DNA过程中破碎细胞这一步非常重要，它直接影响到下面的提取步骤和DNA的提取质量。为了提取高质量的DNA，我们对德国小蠊的DNA提取方法做了改进，该方法能相对快速、简洁、方便地提取高质量的德国小蠊基因组DNA。     

质粒DNA的转化、提取及酶切分析

目的:构建人Bcl-2基因原核表达载体,并对其酶切鉴定.方法:将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选培养充分克隆,然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA,最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA,并跑电泳鉴定.     

乙肝病毒共价闭合环状DNA标准品制备及鉴定

目的通过构建乙肝病毒(HBV)重组质粒来制备共价闭合环状DNA(cccDNA),为cccDNA定量检测提供合适的标准品。方法选择本院就诊的2名慢性乙肝患者,采取蛋白酶K消化法提取其血清病毒DNA,运用高保真聚合酶扩增HBV DNA,然后将扩增片段插入克隆载体构建HBV重组质粒。以重组质粒为模板制备环状DNA,经测序鉴定和PCR定量检测。结果 HBV DNA全长序列被成功扩增,并顺利构建重组质粒。2个重组质粒经内切酶消化均能得到预期的HBV DNA片段(约3.2 kb)和载体DNA片段(约2.7 kb);经测序鉴定,2个质粒分别为HBV B和C基因型,其插入序列保真性好,错配率低,每kb分别为1.24 bp和1.56 bp;以重组质粒为模板制备的2个环状DNA长度均约为2.1 kb,测序证实为HBV cccDNA;经定量检测,其纯度高,浓度分别为1.05×10~(10)IU/ml和6.19×10~9IU/ml。结论利用重组质粒方式制备的HBV cccDNA具有纯度高、获取量大等优点,可作为cccDNA定量检测和方法性能验证的标准品。     

淋病奈瑟球菌毒力岛基因与耐药性的相关性分析

目的探讨淋病奈瑟球菌毒力岛基因与耐药性的相关性。方法应用琼脂稀释法检测淋病奈瑟球菌的耐药性,碘量法检测产β-内酰胺酶淋病奈瑟球菌(PPNG);分别提取其染色体DNA和质粒DNA,采用PCR方法 ,检测淋病奈瑟球菌毒力岛中的atl A、traG和traH基因。结果淋病奈瑟球菌的耐药现状非常严重;毒力岛基因广泛存在,染色体DNA上atl A、traG和traH阳性检出率分别为74.60%、34.92%和68.25%;质粒DNA上atl A、traG和traH阳性检出率分别为74.60%、63.49%和63.49%。结论淋病奈瑟球菌的毒力岛基因与耐药性之间存在一定相关性;染色体traH和质粒atl A多见于β-内酰胺酶阴性菌株,而染色体traG则更多见于高水平耐四环素菌株(TRNG)。     

医学媒介生物微量组织直接扩增DNA条形码序列方法的研究

目的 为保证DNA条形码序列模板DNA来源的单一性,和最大程度减少凭证标本的形态破坏,建立一种从医学媒介生物微量组织中免提取,直接扩增DNA条形码序列的方法。方法 以螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块为材料,通过优化裂解液浓度、裂解液和缓冲液配比,优化反应体系和反应条件,用KOD FX DNA聚合酶进行DNA条形码序列的直接扩增,反应产物测序,与NCBI基因库中的序列进行比较以验证其是否被污染。结果 裂解液优化为NaOH 50 mmol/L;裂解液和缓冲液配比优化为9∶1;反应体积优化为每50μl反应体系中2×KOD FX DNA聚合酶buffer（含Mg2 ＋）25μl、2mmol/LdNTP10μl、KOD FX DNA聚合酶（1U/μl）1μl、正向引物LCO1490（20μmol/L）、反向引物HCO2198（20μmol/L）各1μl;反应条件优化为：95℃3 min;98℃10 s,50℃30 s,68℃1 min,35个循环;68℃7 min。测序结果显示无污染,均为有效序列。结论 该方法操作简单而且省去了DNA提取的步骤,节约了时间和费用,适合螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块DNA条形码序列的直接扩增。     

二氧化氯对细菌DNA作用的观察

[目的]观察二氧化氯(ClO2)对细菌DNA损伤与致死效应之间的关系。[方法]联合运用凝胶电泳谱带分析、圆二色光谱和质粒转化率法。[结果]10mg/L和100mg/LClO2作用的总DNA电泳条带没有明显改变,1000mg/LClO2使DNA条带变窄但无弥散现象;100mg/LClO2作用后,DNA圆二色光谱两个负峰的振幅均有明显下降;分别以1、3和5倍于最小致死浓度的ClO2作用于含质粒的大肠杆菌,所提取的相应质粒对大肠杆菌DH5α的转化率分别降至对照组的(40.3±12.71)%、(31.261±5.57)%、(11±8.2)%。[结论]ClO2作用可导致DNA二级结构改变和菌内质粒转化率下降,但DNA可能不是二氧化氯杀菌作用的致死靶点。     

人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV ll)E7与共刺激分子CDS0嵌合DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV ll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPV llE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80融合基因真核表达质粒。结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功。结论:HPV ll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础。     

使用中消毒剂污染菌的质粒谱和耐药谱研究

目的 了解消毒剂在使用过程中污染菌的质粒谱和耐药谱。方法 采用Kado-liu改良法提取质粒DNA，药敏试验采用WHO推荐的K-B法。结果 选取从深圳市龙岗区各医疗卫生单位常用的5种使用中消毒剂中分离到的48株细菌进行质粒图谱分析发现：消毒剂在使用过程中的污染菌质粒与标准菌株相比较，质粒谱发生了改变；质粒均在6.3-11.2MD之间，但在此范围外常伴有1个或多个质粒同时出现。污染菌对CRO、AM、P耐药。结论 消毒剂在使用过程中污染菌的质粒谱和耐药谱发生了改变。     

嗜麦芽寡养单胞菌金属酶基因及整合子检测分析

目的 分析金属酶基因与整合子在嗜麦芽寡养单胞菌中存在情况.方法 以细菌耐药鉴定系统及改良K-B法进行药敏试验.提取不同标本的DNA与质粒,以PCR反应扩增金属酶基因与整合子.结果 L1、L2金属酶均存在于嗜麦芽寡养单胞菌染色体DNA及质粒DNA中,检测出少数菌株携带整合子Ⅰ、Ⅱ.结论 L1、L2型金属酶基因为嗜麦芽寡养单胞菌多药耐药的重要原因之一,嗜麦芽寡养单胞菌能接受整合子,其耐药特性具有可获得性的.     

人乳头瘤病毒11型L1 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-L1基因,将L1基因经双酶切后克隆到pcDNA3 1(+)中,测序鉴定。结果:从病变组织中扩增出了全长HPV11-L1基因,并正向插入表达载体pcDNA3 1(+)中,转化JM109扩增后经酶切和测序鉴定,证实克隆成功。结论:HPV11-L1DNA疫苗质粒的构建为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础。     

快速检测质粒DNA及其在流行病学分析上的应用

参照前人的经验,作者建立了快速检测质粒 DNA 的方法。检测步骤为:在室温下,以3,600rpm 离心5分钟,收集培养物的菌体。然后,根据菌种分别加入不同试剂,如革兰氏阴性细菌加入缓冲液 A 200μl,金黄色葡萄球菌加入溶葡萄球菌素溶液200μl。     

蔗糖曲拉通X—100裂解G~+、G~-菌质粒提取方法

本文报告一种质粒DNA的提取方法,该法首先用100％蔗糖处理细菌,然后用tritonX—100—脱氧胆酸盐裂解,无需溶菌酶也不需昂贵的仪器。结果表明,该法对标准质粒菌E、coliV517的质粒检出显示很好的重复性。对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌的质粒检测结果分别为88.5％(23/26)、67.4％(31/46)、100％(7/7)、对金黄色葡萄球菌的大、小质粒都能检出。本方法简便经济,是兼适用G~+和G~-菌的质粒分析方法。特别适于流行病学调查。     

消毒剂在使用过程中污染菌的质粒图谱研究

目的 :了解消毒剂在使用过程中污染菌的质粒谱情况。方法 :采用 Kado- liu改良法提取质粒 DNA,琼脂糖电泳。结果 :选取从深圳市龙岗区各医疗卫生单位常用的五种使用中消毒剂中分离到的 4 8株细菌 ,进行质粒图谱分析发现 :消毒剂在使用过程中的污染菌质粒与标准菌株相比较 ,质粒谱发生了改变 ;不同消毒剂中同种污染菌的质粒谱不同 ;相同消毒剂中不同的污染菌质粒谱也不同。质粒均在 6 .1～ 11.2 MD之间 ,但在此范围外常伴有一个或多个质粒同时出现。结论 :消毒剂在使用过程中污染菌的质粒谱发生了改变。这种改变是否与其对抗生素耐药性或对消毒剂抗性有关 ,需进一步研究     

肠道菌群总DNA提取方法的研究

[目的]通过实验得出提取DNA的最佳方法,并对样品处理等实验条件进行优化,为PCR检测中模板DNA的制备提供实验依据。[方法]一.样品处理;二.DNA提取:1.醋酸钠-乙醇沉淀法;2.水煮法;3.水煮法-试剂盒法;4.试剂盒法;5.CTAB法;三.DNA的检测。[结果]实验效果最佳的DNA提取方法是试剂盒法,所得到的结果(包括DNA纯度和浓度)是几种提取方法中最好的;水煮法-试剂盒法结果较试剂盒法相近,但操作较烦琐;醋酸钠-乙醇沉淀法、CTAB法和水煮法得到的DNA中含有较多的蛋白质、RNA等杂质。[结论]试剂盒法是提取DNA最佳方法。     

铜绿假单胞菌外毒素A原核表达载体的构建及鉴定

[目的]对铜绿假单胞菌外毒素A (PEA)全基因进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.[方法]从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出带信号肽的PEA目的基因,经Hind Ⅲ和EcoRⅠ消化后,与PET-32a载体进行连接重组.[结果]PET-32a-PEA原核表达质粒构建完成后.用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.[结论]PET-32a-PEA原核表达质粒的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗和用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础.