PM2.5对人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo迁移与侵袭力的影响及机制研究

目的：探讨PM2.5对人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo存活率以及迁移与侵袭能力的影响,寻找PM2.5致不良妊娠结局可能的机制。方法：不同浓度PM2.5染毒HTR8-SVneo细胞建立实验模型,CCK8（Cell Counting Kit-8）法分析细胞增殖情况,最终选取0、30、60、120和200 μg/mL 5个浓度进行后续实验,其中以0 μg/mL染毒组为对照组。激光全息细胞分析及成像系统分析细胞迁移力;Transwell侵袭实验分析细胞侵袭力;qPCR和Western Blot分别检测基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP9及其组织抑制剂TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表达水平;明胶酶谱法检测细胞分泌的明胶酶MMP2和MMP9活性。结果：PM2.5对HTR8-SVneo细胞增殖有显著抑制作用（P＜0.05）;PM2.5使HTR8-SVneo细胞迁移距离和穿膜细胞数均减少（P＜0.05）;qPCR和Western Blot结果显示,PM2.5使HTR8-SVneo细胞MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的mRNA及蛋白表达水平升高（Ｐ＜0.0５）, 且MMPs升高程度低于TIMPs;明胶酶谱结果显示,HTR8-SVneo细胞MMP9活性在30、60、120和200 μg/mL染毒组均升高（P＜0.05）。结论：PM2.5在造成HTR8-SVneo细胞损伤的同时,可能通过打破MMPs/TIMPs的动态平衡影响人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo的迁移与侵袭力,从而造成不良妊娠结局,而具体信号机制有待深入研究。     

五味子乙素降低PM2.5抑制HTR细胞增殖的作用研究

目的:探索五味子乙素（Schisandrin B,Sch B）是否可以降低PM2.5对人早孕胎盘绒毛膜外滋养层（human trophoblast HTR-8/SVneo,HTR）细胞增殖的抑制作用。方法:体外实验以HTR细胞为载体,利用MTS细胞增殖实验检测不同浓度的细颗粒物（PM2.5）、Sch B单独给药以及PM2.5联合Sch B给药对HTR细胞增殖的影响。结果:10~1 000 μg/mL浓度范围内的PM2.5均抑制了HTR细胞的增殖（P<0.01）,其中150 μg/mL浓度的PM2.5抑制率达到21.97%;0.1~5 μmol/L浓度Sch B均降低了PM2.5的抑制HTR细胞增殖作用,且在0.1~2 μmol/L浓度范围内其降低PM2.5抑制HTR细胞增殖的作用随着Sch B浓度增加而增大（P<0.01）,其中2 μmol/L的Sch B对HTR细胞的保护作用最强,保护率达到14.07%。结论:Sch B可以有效降低PM2.5对HTR细胞增殖的抑制作用,具有体内潜在保护人类滋养细胞的作用。     

灰霾天气细颗粒物对人支气管上皮细胞凋亡的影响

[目的]探讨灰霾天气细颗粒物（PM2.5）对人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cells,16-HBE）凋亡的影响。[方法]分别以8、16、32、64、128μg/mL浓度的PM2.5作用于16-HBE 24、48、72h,检测PM2.5对16-HBE细胞存活率及凋亡率的影响。[结果]染毒24、48、72h后,64、128μg/mL组细胞存活率均明显低于对照组（P〈0.05）,细胞凋亡率均明显高于对照组（P〈0.05）;72h各浓度组细胞存活率均低于24h相应处理组（P〈0.05）,当染毒浓度大于8μg/mL时,72h各浓度组细胞总凋亡率与24h相比均明显增加（P〈0.05）。[结论]灰霾天气细颗粒物PM2.5对16-HBE具有细胞毒性,能诱导其凋亡,且具有剂量和时间反应关系。     

醋酸铅染毒对TK6细胞氧化损伤作用及亚硒酸钠的保护效应

目的 研究亚硒酸钠对醋酸铅致TK6细胞氧化应激损伤的保护效应。方法 培养TK6细胞,调整细胞密度为1×106/ml,试验分3组,正常对照组、醋酸铅染毒组和亚硒酸钠干预组,采用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(ROS)水平,硫代巴比妥酸（TBA）法检测细胞内丙二醛（MDA）含量和高度水溶性四唑盐（WST-1）法检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 在醋酸铅染毒和0.01 μg/ml的亚硒酸钠干预后,3组细胞内ROS含量、MDA含量和SOD含量的比较,差异均有统计学意义(F 分别为36.706,0.050,23.051,均P＜0. 01),其中醋酸铅染毒后,TK6细胞内ROS含量和MDA含量增高,与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）,0.01 μg/ml的亚硒酸钠干预后,细胞内ROS含量和MDA含量下降,与醋酸铅染毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）;醋酸铅染毒后,TK6细胞内SOD含量降低,与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）,0.01 μg/ml的亚硒酸钠干预后,SOD含量上升,与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）,而与醋酸铅染毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 醋酸铅染毒对TK6细胞有氧化损伤作用, 0.01 μg/ml亚硒酸钠对醋酸铅氧化损伤毒性具有拮抗作用。     

大气细颗粒物对人支气管上皮细胞氧化损伤作用的研究

目的 研究大气细颗粒物(PM2.5)对人支气管上皮细胞(16-HBE)氧化损伤的作用.方法 将16-HBE分别暴露于8、16、32、64、128 μg/ml的于广州灰霾天气采集的大气PM2.5中24、48、72 h,采用ELISA法检测细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,并与本课题组前期检测的细胞凋亡和DNA损伤数据进行相关性分析.结果 染毒24、48、72 h后,与对照组相比,64、128 μg/ml染毒组8-OHdG含量均明显增加(P＜0.05)；与染毒24 h相比,128 μg/ml染毒72 h组8-OHdG含量明显增加(P＜0.05).氧化损伤与细胞DNA损伤和凋亡之间存在正相关(P＜0.05),细胞DNA损伤与凋亡之间存在正相关(P＜0.05).结论 大气PM2.5可导致16-HBE氧化损伤,氧化损伤可能是PM2.5引起呼吸道损伤的重要作用机制之一.     

不同剂量亚砷酸钠暴露不同时间对HaCaT细胞活性氧的影响

目的 探索不同剂量亚砷酸钠暴露不同时间对诱导人永生化角质形成(HaCaT)细胞活性氧(ROS)产生的影响以及低剂量亚砷酸钠预处理HaCaT细胞对诱导ROS水平改变的时间效应.方法 设未预处理组[分别加入终浓度为0(对照)、0.15、0.6、2.5、10 μmol/L的亚砷酸钠染毒8、24、72 h]和预处理8h组(加入0.15μmol/L亚砷酸钠预处理8h后,加入10 μmol/L亚砷酸钠染毒8h)及预处理24 h组(加入0.15 μmol/L亚砷酸钠预处理24 h后,加入10 μmol/L亚砷酸钠染毒8h).利用2’,7’-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平.结果 与对照组比较,各浓度亚砷酸钠染毒8h和0.6、2.5、10μmol/L亚砷酸钠染毒24 h及0.6、2.5 μmol/L亚砷酸钠染毒72 h后HaCaT细胞内ROS水平均较高,而0.15、10μmol/L亚砷酸钠染毒72 h后HaCaT细胞内ROS水平均较低,差异有统计学意义(P＜0.05).亚砷酸钠染毒8h时,HaCaT细胞内ROS水平达到峰值;之后,低剂量(0.15、0.6 μmol/L)亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞内ROS水平于24 h下降,72 h有所回升,而高剂量(≥2.5 μmol/L)亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞内ROS水平则呈持续下降.预处理8h组HaCaT细胞内ROS水平高于预处理24h组,差异均有统计学意义(P＜0.05);与10 μmol/L亚砷酸钠染毒未预处理HaCaT细胞8h组比较,预处理8h组HaCaT细胞内ROS水平较高,预处理24 h组HaCaT细胞内ROS水平较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HaCaT细胞急性暴露于亚砷酸钠后能够引起HaCaT细胞内ROS产生增加,而不同剂量亚砷酸钠暴露诱导HaCaT细胞ROS水平的改变与暴露时间密切相关,且低剂量亚砷酸钠暴露对HaCaT细胞产生的适应性反应可能取决于其作用时间.     

滴滴涕与纳米二氧化钛对人胚肝细胞DNA损伤作用的协同效应

[目的]观察滴滴涕（DDT）及纳米二氧化钛（nano-TiO2）单独及联合体外染毒对人胚肝细胞株（L-02）内活性氧（ROS）含量及DNA损伤的影响。[方法]生长良好的L-02细胞,分别加入0.001、0.01、0.1μmol/L的DDT,0.01、0.1、1μg/mL的nano-TiO2,以及上述各浓度的DDT和nano-TiO2联合剂量,染毒时间均为24 h;运用DCFH-DA作为荧光探针,采用流式细胞检测技术检测DDT与nano-TiO2联合作用下L-02细胞内ROS含量,运用碱性和中性两种彗星试验检测各组DNA断裂损伤程度。[结果]0.01μmol/L以上浓度组DDT单独作用24 h引起ROS升高（P〈0.05）和DNA损伤增加（P〈0.05）;各浓度nano-TiO2单独染毒均不能引起DNA损伤增加（P〉0.05）,但1μg/mL单独染毒可引起ROS升高（P〈0.05）。各剂量组单独染毒24 h后均无明显的DNA双链损伤（P〉0.05）,但可导致DNA单链断裂损伤。析因分析结合反应曲面模型显示两种受试物联合染毒可协同增加ROS水平与DNA损伤作用（P〈0.05）。[结论]DDT和nano-TiO2联合作用可协同增加各自对DNA单链断裂水平的影响,诱导产生ROS导致DNA损伤是DDT和nano-TiO2引起机体损伤的主要机制之一。     

纳米二氧化钛对小鼠睾丸支持细胞的细胞毒性研究

目的 探讨纳米二氧化钛对小鼠睾丸支持细胞(TM4)的毒性作用。方法 用浓度为0、25、50和100μg/ml的纳米二氧化钛染毒TM4细胞24h。使用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK8) 检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒检测超氧化歧化酶(SOD)的活性和谷胱甘肽(GSH)的水平。结果 与对照组相比,随着纳米二氧化钛染毒浓度的升高,TM4细胞存活率逐渐下降,当浓度达到100μg/ml时,细胞存活率下降明显(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,与对照组相比,随着染毒剂量的增加,各个染毒组的细胞凋亡率和ROS水平逐渐增加(P<0.05)。细胞SOD活性和GSH含量随着染毒浓度的增加而逐渐降低,且在100 μg/ml 剂量组与对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 纳米二氧化钛可以抑制睾丸支持细胞TM4的活性,诱导细胞凋亡,其毒性机制可能与细胞发生氧化应激有关。     

SOD在五味子乙素降低PM2.5对HTR细胞毒性中的作用

目的: 探讨超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）在五味子乙素（Schisandrin B,Sch B）降低PM2.5对人早孕胎盘绒毛膜外滋养层（human trophoblast HTR-8/SVneo,HTR）细胞毒性中的作用。方法: 体外培养HTR细胞,利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染技术降低SOD蛋白的表达,并以不同浓度PM2.5（0~150 μg/mL）处理细胞。MTS细胞增殖实验观察HTR细胞增殖。实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测SOD mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测SOD蛋白的表达水平。 结果: SOD siRNA转染后,150 μg/mL浓度的PM2.5对HTR细胞增殖的抑制率上升至33.97%,0.25、0.5、1、2 μmol/L Sch B组对HTR细胞的保护率由转染前的2.74%、7.91%、10.31%、14.07%分别降至1.39%、4.98%、7.75%、9.55%。SOD siRNA转染后,0.25、0.5、1、2 μmol/L Sch B组的SOD mRNA的表达量从转染前是对照组的1.26、1.47、1.86、2.25倍分别降至1.13、1.25、1.43、1.77倍。SOD siRNA转染后,0.25、0.5、1、2 μmol/L Sch B组的SOD蛋白表达量从转染前是对照组的1.19、1.36、1.60、1.94倍分别降至1.09、1.16、1.27、1.41倍。 结论: SOD基因的激活在Sch B降低PM2.5对HTR细胞毒性作用中起到重要作用。     

上海市吴淞地区大气PM2.5两种提取成分的细胞毒性研究

[目的]研究上海市吴淞地区大气细颗粒物（PM2.5）两种提取成分（有机和无机提取成分）的细胞毒性。[方法]采用滤膜法采集上海市吴淞地区大气中PM2.5，以中国仓鼠肺成纤维细胞（chinese hamsterfibroblast cell line，CHL）为靶细胞研究PM2.5，有机及无机提取成分对细胞活力、代谢的影响及氧化损伤毒性，具体包括细胞形态、活力和细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LD）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）水平的测定。[结果]上海市吴淞地区大气PM2.5的有机和无机两种提取成分分别以10、50、100、200μg/ml浓度染毒CHL细胞10h，结果显示随着染毒剂量的增加细胞形态损伤加剧，细胞存活率、SOD含量呈下降趋势，LD和MDA则呈上升趋势，LDH则呈现先升后降趋势。与阴性对照组相比，200μg／ml染毒组的LD含量的升高同100、200μg/ml组的LDH和MDA含量的升高及SOD水平的下降均具有统计学显著性（P〈0．05）～除200μg/ml染毒组，有机提取成分要高于无机提取成分所染毒细胞的生长抑制率外，其他各染毒浓度组的氧化损伤及代谢指标水平在两种染毒成分之间尚不能认为有差别。[结论]上海市吴淞地区PM2.5，的有机及无机提取成分均具有一定的细胞毒性。     

菌灵诱导小鼠睾丸支持细胞凋亡及周期阻滞的研究

目的 观察多菌灵对小鼠睾丸支持细胞系（TM4）周期及凋亡的影响,并探讨其凋亡机制。方法 不同浓度(0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml)的多菌灵体外作用TM4细胞48 h,运用MTT法检测OD值及计算细胞存活率,PI染色法检测TM4细胞周期的分布变化,Annexin V/PI双标识标记法检测TM4细胞的凋亡情况,应用荧光探针DCFH - DA法检测TM4细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的相对荧光强度,qRT - PCR法检测TM4细胞内Bax和Bcl - 2 mRNA的表达水平。结果 随着多菌灵浓度的升高,TM4细胞的增殖受到抑制,细胞周期分布发生变化,G2/M期的细胞呈现增加的趋势（P＜0.01）,胞内Bax mRNA和ROS表达水平也逐步升高（P＜0.05,P＜0.01）,而Bcl - 2 mRNA表达则逐步下降（P＜0.01）。结论 多菌灵可诱导TM4细胞凋亡并发生G2/M期阻滞,其作用机制可能与Bax、Bcl - 2 mRNA及ROS的异常表达有关。     

五味子乙素对苯并芘致HTR8-SVneo细胞氧化损伤的保护作用

目的：研究环境污染物苯并芘（BaP）致人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo氧化损伤的作用机制,探讨五味子乙素（Sch B）的可能保护作用。方法：本实验分为空白组、BaP组、Sch B不同浓度组（0.1,0.5,2.0 μmol/L）,以HTR8-SVneo 细胞为载体,构建BaP氧化应激损伤模型,测定氧化和抗氧化指标。结果：与空白组比较,BaP组超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的浓度显著降低,而乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的浓度明显增加（P＜0.05）。不同剂量Sch B组SOD、GSH-Px的浓度明显提高,LDH、MDA、NO、iNOS的浓度减少,与BaP组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：Sch B能调节BaP所致的HTR8-SVneo细胞氧化系统和抗氧化系统的失衡,从而预防BaP致HTR8-SV neo细胞的氧化损伤。     

硒对铅致TK6细胞遗传损伤的拮抗作用

目的 研究亚硒酸钠对铅致TK6细胞遗传毒性损伤的拮抗作用。方法 培养TK6细胞,调整细胞密度为1×106/mL,试验分3组,正常对照组、铅染毒组和亚硒酸钠干预组,采用免疫荧光染色检测细胞DNA双链断裂损伤生物标志物γH2AX、ELISA试剂盒检测细胞DNA氧化损伤生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和染色体畸变试验检测细胞染色体损伤情况。结果 铅染毒后,TK6细胞内γH2AX含量、8-OHdG水平和染色体畸变数明显增高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);0.01 μg/mL的亚硒酸钠干预后,细胞内γH2AX含量和染色体畸变数下降,与铅染毒组比较差异有统计学意义(P<0.01),细胞内8-OHdG水平明显下降,与铅染毒组比较差异有统计学意义(P<0.01),而与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 铅对TK6细胞有遗传毒性损伤作用,0.01 μg/mL的亚硒酸钠具有拮抗铅对TK6细胞遗传毒性损伤的作用。     

Ambient particulate matter on DNA damage in HepG2 cells

Ambient particulate matter (PM) has been reported to be associated with increased respiratory, cardiovascular, and malignant lung diseases. The aim of the present study was to investigate the variability of the DNA-damage induced by thoracic particles (PM( 10)) sampled in different locations and seasons (2006) in Dalian, China, in human hepatoma G2 (HepG2) cells. Significant differences in percentage of tail DNA induced by the extractable organic matter of PM(10) were revealed between summer and winter seasons and among monitoring sites in single cell gel electrophoresis (SCGE) assay. The percentage of tail DNA in HepG2 cells significantly increased in a dose-dependent manner after exposure to 7.5 and 30 μg/mL extractable organic matter of PM(10) for 1 hour. In order to clarify the underlying mechanisms, we evaluated the level of reactive oxygen species (ROS) production with the 2, 7-dichloro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay. Significantly increased level of ROS was observed in HepG2 cells at higher concentrations (15 and 30 μg/mL). Significantly increased levels of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) were also shown in HepG2 cells. In this study, the accumulation of nuclear factor kappa B (NF-κB) p65 protein induced by the extractable organic matter of PM(10) was detected by western blotting in HepG2 cells, and the protein expression of NF-κB p65 significantly increased after the treatment with 30 μg/mL extractable organic matter of PM(10) for 24 hours. These results indicate that the extractable organic matter of PM(10) causes DNA strand breaks in HepG2 cells, and significant differences in percentage of tail DNA in dependence on locality and season are revealed. The extractable organic matter of PM(10) exerts DNA damage effects in HepG2 cells, probably through oxidative DNA damage induced by intracellular ROS, increase of 8-OHdG formation, and protein expression of NF-κB p65.     

Oxidative DNA damage and inflammatory responses in cultured human cells and in humans exposed to traffic-related particles

Particulate pollution is a major public health concern because epidemiological studies have demonstrated that exposure to particles is associated with respiratory diseases and lung cancer. Diesel exhaust particles (DEP), which is classified as a human carcinogen (IARC, 2012), are considered a major contributor to traffic-related particulate matter (PM) in urban areas. DEP consists of various compounds, including PAHs and metals which are the principal components that contribute to the toxicity of PM. The present study aimed to investigate effects of PM on induction of oxidative DNA damage and inflammation by using lymphocytes in vitro and in human exposed to PM in the environment. Human lymphoblasts (RPMI 1788) were treated with DEP (SRM 2975) at various concentrations (25–100 μg/ml) to compare the extent of responses with alveolar epithelial cells (A549). ROS generation was determined in each cell cycle phase of DEP-treated cells in order to investigate the influence of the cell cycle stage on induction of oxidative stress. The oxidative DNA damage was determined by measurement of 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OHdG) whereas the inflammatory responses were determined by mRNA expression of interleukin-6 and -8 (IL-6 and IL-8), Clara cell protein (CC16), and lung surfactant protein-A (SP-A). The results showed that RPMI 1788 and A549 cells had a similar pattern of dose-dependent responses to DEP in terms of particle uptake, ROS generation with highest level found in G2/M phase, 8-OHdG formation, and induction of IL-6 and IL-8 expression. The human study was conducted in 51 healthy subjects residing in traffic-congested areas. The effects of exposure to PM_2.5 and particle-bound PAHs and toxic metals on the levels of 8-OHdG in lymphocyte DNA, IL-8 expression in lymphocytes, and serum CC16 were evaluated. 8-OHdG levels correlated with the exposure levels of PM_2.5 (P < 0.01) and PAHs (P < 0.05), but this was not the case with IL-8. Serum CC16 showed significantly negative correlations with B[a]P equivalent (P < 0.05) levels, but positive correlation with Pb (P < 0.05). In conclusion, a similar pattern of the dose-dependent responses to DEP in the lymphoblasts and lung cells suggests that circulating lymphocytes could be used as a surrogate for assessing PM-induced oxidative DNA damage and inflammatory responses in the lung. Human exposure to PM leads to oxidative DNA damage whereas PM-induced inflammation was not conclusive and should be further investigated.