肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型技术的联合应用

Objective To type Klebsiella pneumonia through methods including pulse-field gel electrophoresis (PFGE) in combination with multilocus sequence typing. Methods Four selected different Eps, referring to the Standard Operating Procedure of PulseNet China, were used. The single colony of Klebsiella pneumonia was quantified after enriched culture. Embedding organisms in agarose and genome DNA were lysed with Proteinase K and then digested by restriction endonuclease Xba Ⅰ , to produce agarose gel. Fingerprint was obtained through PFGE and bands were marked with their molecular weights and then analyzed by BioNumerics software. Using MLST to analyze the strains that were highly similar, by PFGE typing Results By comparing the four results from each Eps, fk3 (switch time from 6s to 36s,total run time is 18.5 hours) seemed to be better than the others.59 strains of Klebsiella pneumonia were divided into 47 PFGE types and 19 PFGE clusters. The highly similar strains could be typed into ST-340、ST-342、ST-343、ST-344、ST-345 by MLST. Among them, ST-342、 ST-343、 ST-344、 ST-345 types were all new MLST types that were reported in China.Conclusion Highly similar Klebsiella pneumonias typed by PFGE could also be typed by MLST.     

肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型技术的联合应用

Objective To type Klebsiella pneumonia through methods including pulse-field gel electrophoresis (PFGE) in combination with multilocus sequence typing. Methods Four selected different Eps, referring to the Standard Operating Procedure of PulseNet China, were used. The single colony of Klebsiella pneumonia was quantified after enriched culture. Embedding organisms in agarose and genome DNA were lysed with Proteinase K and then digested by restriction endonuclease Xba Ⅰ , to produce agarose gel. Fingerprint was obtained through PFGE and bands were marked with their molecular weights and then analyzed by BioNumerics software. Using MLST to analyze the strains that were highly similar, by PFGE typing Results By comparing the four results from each Eps, fk3 (switch time from 6s to 36s,total run time is 18.5 hours) seemed to be better than the others.59 strains of Klebsiella pneumonia were divided into 47 PFGE types and 19 PFGE clusters. The highly similar strains could be typed into ST-340、ST-342、ST-343、ST-344、ST-345 by MLST. Among them, ST-342、 ST-343、 ST-344、 ST-345 types were all new MLST types that were reported in China.Conclusion Highly similar Klebsiella pneumonias typed by PFGE could also be typed by MLST.     

2011-2012年杭州市肠道沙门菌临床分离株的分子型别分析

目的研究2011-2012年杭州市肠道沙门菌临床分离株的型别,了解本地菌株分子流行病学特征。方法对66株肠道沙门菌临床分离株进行血清分型和多位点序列分型(MLST)。对其中主要血清型:鼠伤寒、甲型副伤寒、萨雷甲尼和肠炎沙门菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。结果分布于21个血清型的66株沙门菌分成26个ST型别。发现一株纽波特沙门菌为新型ST1690。菌株血清型与MLST型别数据库中所对应的血清型符合率为100.00%。9株甲型副伤寒沙门菌的PFGE带型完全一致(P7型),与先前杭州流行菌株有差异(P1-P6型)。6株肠炎沙门菌分成4个PFGE型,型间最小相似性为92.70%。13株鼠伤寒沙门菌分为11个PFGE型,型间最小相似性为71.70%。7株萨雷甲尼沙门菌分成4个PFGE型别,型间最小相似性为91.00%。结论近年杭州腹泻病人中流行的肠道沙门菌菌株主要血清型为鼠伤寒、甲型副伤寒、萨雷甲尼和肠炎等。甲型副伤寒沙门菌菌株在杭州出现了新PFGE型别。MLST数据可以对沙门菌血清学鉴定提供一定的帮助。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药表型及同源性分析

目的了解医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分离株的耐药表型、携带blaKPC基因的型别及菌株同源性,为控制耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌传播及临床治疗提供科学依据。方法收集35株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌临床分离株,用K-B纸片法进行药敏试验;应用PCR方法检测blaKPC基因,并通过测序进行分型;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对菌株进行分子分型,建立医院PFGE指纹图谱库,运用BioNumeries7.0生物分析软件对菌株之间的亲缘关系及同源性进行分析。结果 35株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对18种临床常用抗菌药物呈广泛耐药,耐药机制主要是携带blaKPC-2类耐药基因,携带率达82.86%;PFGE分子分型共分为10个谱型,优势型别为KPN01.002型(11株);各菌株间相似性系数达93.00%以上。结论产KPC-2型碳青霉烯酶为医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯细菌的主要耐药机制;不同病区菌株呈高度同源性分布;且可能存在院内的同源暴发,应加强细菌耐药性监测和医院感染的监控。     

肺炎克雷伯菌基因分型及碳青霉烯类耐药关系研究

目的研究肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药表型及耐药基因和同源性之间的关系。方法对来源于2016年-2017年扬州2家医院患者血培养的47株肺炎克雷伯菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,采用微量肉汤稀释法对氨苄西林、美罗培南、亚胺培南等23种药物进行敏感性实验,同时检测碳青霉烯酶耐药基因。结果 47株肺炎克雷伯菌经过PFGE分型,有4组相似性系数70%。耐药表型检测结果显示,对碳青霉烯类药物美罗培南和亚胺培南的耐药率分别为8.51%(4/47)和6.38%(3/47)。结合耐药基因检测结果分析,其中有3株肺炎克雷伯菌含有碳青霉烯酶耐药基因,均分离于同一家医院,高度同源(相似性系数85%)。结论 PFGE对肺炎克雷伯菌分型具有很好的分型能力和分辨力,能够将对碳青霉烯类耐药菌株聚成一簇,本研究为肺炎克雷伯菌快速基因型分型以及耐药率相关性提供了技术支撑和实验基础。     

肺炎克雷伯菌单基因分子进化分析及多位点序列分型与基因组系统学研究

目的比较7株已完成全基因组测序的肺炎克雷伯菌单基因分子进化分析及多位点序列(MLST)分型与基因组系统学研究的结果,研究其亲缘关系。方法采用Roche 454高通量测序技术对1株泛耐药肺炎克雷伯菌JM45株做全基因组测序(完成图),再与NCBI已完成全基因组测序的6株肺炎克雷伯菌9种看家基因进行单个基因分子进化分析,将该9个基因序列串联作MLST分型,并将7株肺炎克雷伯菌的全基因组序列作聚类分析(为Fast Minimum Evolutin法)。结果 JM45株测得一条完整的基因组(染色体)序列及两条质粒序列;因为不同的基因进化率不同,7株肺炎克雷伯菌9种看家基因单个基因序列的分子进化图并不一致;7株肺炎克雷伯菌MLST分型可见JM45株与HS11286株相同(即为同一型),1084株与NTUH-K2044株相同,但7株肺炎克雷伯菌基因组系统学分析可见,JM45株与HS11286株并不相同(即非为同一型),JM45株与HS11286株距离最近,与342株距离最远,其他各株介于二者之间。结论采用单个基因序列的分子进化分析法及MLST分型用作菌株亲缘性关系分析法并不可靠,本研究为国内首个单个看家基因分子进化分析及MLST分型与基因组系统学研究的比较报道。     

云南省首例人感染猪链球菌病的病原学分析

目的 对猪链球菌菌株进行鉴定,了解其病原学特征.方法 对菌株进行了菌落形态、生化鉴定、血清凝集、PCR 检测、16S rRNA 细菌种属鉴定、PFGE 检测和MLST 分型.结果 菌落形态、生化鉴定、血清凝集、16S rRNA 细菌种属鉴定,证明此菌株为猪链球菌2 型;经PCR 检测16SrRNA 和毒力基因均为阳性;PFGE 检测结果表明此株菌同3 株参考菌株相似性很低;MLST 分型属于高致病性ST1 型.结论 此次分离到菌株的为云南省首例人感染的猪链球菌2 型,是强毒力株.     

中国2000-2008年间甲型副伤寒沙门菌脉冲场凝胶电泳和多位点序列分析

目的 分析我国2000-2008年间甲型副伤寒沙门菌流行株的分子分型及病原进化上的特征.方法 应用以Spe Ⅰ为限制性内切酶的脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法 和基于9个管家基因位点(aroC、thrA、hisD、purE、sucA、dnaN、hemD、adk和purA)的多位点序列分析(multilocus sequence typing,MLST)分型方法 ,对我国2000-2008年间分离自10个地区的118株甲型副伤寒沙门菌流行株进行分析.结果 应用PFGE方法 将118株甲型副伤寒沙门菌分为32个型,其中包含5株以上的优势PFGE带型有5种.而应用MLST方法 ,所有菌株只分出了2个序列分型(sequence type,ST),各菌株的管家基因序列高度保守,呈现高度克隆化.结论 中国2000-2008年间甲型副伤寒沙门菌菌株应用MLST这种分型方法 很难区分,MLST不适于甲型副伤寒沙门菌的暴发调查和流行病学监测.目前中国的甲型副伤寒是由高度克隆化的菌株引起全国范围的扩散 流行.随着年份的变迁,也积累了散在的变异.     

MLST和PFGE在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌医院感染监测中的应用

 目的 探讨某院重症监护病房(ICU)患者、医院环境中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)菌株的同源性,为医院感染防控提供理论依据。方法 收集2017年9—12月某三甲医院ICU患者、环境中连续分离的CRKP菌株,进行耐药表型、碳青霉烯酶基因检测,采用多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子同源性分析。结果 共收集10株CRKP菌株,其中9株分离自5例患者的临床感染标本,1株分离自气压治疗仪面板。10株菌均携带产KPC酶基因;MLST分型均为ST11型;共有5种PFGE带型,其中5株带型完全一致,为流行菌株,1株菌株与流行菌株带型仅相差1条条带,其余4株菌带型相近,但与流行株带型差异较大。气压治疗仪面板分离的1株CRKP菌株与患者来源的4株CRKP菌株耐药表型、PFGE型别及ST型别完全一致,考虑为仪器共用造成的医院感染。分离自同一重症胰腺炎患者腹腔引流液、血标本的CRKP菌株PFGE带型完全一致,推测CRKP可能通过腹腔感染入血。结论 PFGE和MLST对明确医院感染细菌传播路径,个体细菌感染路径以及遗传变异有重要意义,有助于从切断感染途径方面入手指导控制多重耐药菌的传播。     

儿童感染ST2735型产NDM-5碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学和耐药机制

目的 探讨儿童感染ST2735型产NDM-5碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)流行病学特征及耐药机制。方法 收集徐州医科大学附属医院2018年3月-2022年3月临床首次分离的儿童感染的亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌24株，改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)和乙二胺四乙酸碳青霉烯灭活试验(eCIM)检测碳青霉烯酶，聚合酶链式反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因，多位点序列分型(MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法检测其同源性。结果 2018年3月-2022年3月分离出24株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌，其中发现NDM-5型CRKP 15株，检出率62.50%,这15株CRKP感染患儿均有基础疾病和抗菌药物使用史；15株NDM-5型CRKP菌株对头孢菌素类、碳青霉烯类和头孢他啶/阿维巴坦均耐药。MLST分型以ST2735型(25.00%)为主，PFGE分析显示6株ST2735型CRKP具有高度同源性，且均来自于新生儿重症监护室(NICU)。结论 医院NICU存在ST2735型产NDM-5 CRKP的克隆流行，应当加强院感监测及预防，防止其产生新的流行危害。     

多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳在肠炎沙门菌分子分型的比较

目的 比较多位点序列分型技术和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术在肠炎沙门菌菌株间分型的分辨率。方法 分别建立肠炎沙门菌的6个管家基因thrA、pure、sucA、aroC、hemD、dnaN和一个特异性的DNA标记Sdf Ⅰ的多位点序列分型技术，及以寡切点的XbaⅠ、SpeⅠ作为限制性内切酶的PFGE方法，并应用上述方法对食品中的分离株进行分型，比较两种方法的分辨率。结果 PFGE可以将50株肠炎沙门菌分为11个型。并且通过双酶系统的双重PFGE分型，还可以将PFGE型别再精细划分为亚型；MLST则揭示了在同一血清型内部，各菌株之间的管家基因碱基序列高度保守，而在沙门菌不同血清型的核苷酸序列之间，则分别存在不同数量的碱基差异。即MLST方法只能用于血清型之间，不能在血清型内部进行分型研究。结论 与MLST比较，PFGE方法在肠炎沙门菌的分型方面显示了比较高的分辨率。     

杭州市2002-2008年甲型副伤寒沙门菌分子分型研究

目的研究2002-2008年杭州市甲型副伤寒疫情分离株的亲缘性,并探讨脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）在甲型副伤寒沙门菌分子分型中的应用。方法对404株甲型副伤寒沙门菌运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行分子分型,并用K-B法测定菌株抗生素敏感性。挑选9株甲型副伤寒沙门菌进行多位点序列分型（MLST）以及稳定性试验。结果 404株甲型副伤寒沙门菌可分为6个PFGE型和4个耐药型,P1型和P2型属于同一个克隆系,该克隆系菌株占试验菌株数的99%,分离自临安市的310株菌均为P1型,分离自杭州市西湖区的主要菌型是P2型和P1型。9株甲型副伤寒沙门菌根据SucA位点的差异可分为2个MLST型。结论杭州市2002-2008年的甲型副伤寒疫情由同一克隆系的菌株主导。PFGE、MLST分型方法各有侧重,可互为补充。     

Antimicrobial susceptibility, pulsed-field gel electrophoresis, and multi-locus sequence typing of Campylobacter coli in swine before, during, and after the slaughter process

The objective of this study was to determine persistence of clonal strains from farm to retail by assessing the clonal relatedness of Campylobacter coli isolated on farm, peri-harvest, and at processing from 11 individually identified pigs. Phenotypic (antimicrobial susceptibility) and genotypic (pulsed field gel electrophoresis [PFGE] and multi-locus sequence typing [MLST]) characterization of isolates was conducted. There was high genetic diversity of Campylobacter isolates from on-farm fecal samples. Campylobacter isolates from farm, post-evisceration, hide, and carcass samples showed similar phenotypes and belonged to the same genotypic clusters based on PFGE and sequence types (STs) based on MLST. Five STs that have not been previously reported were identified (ST-4083, ST-4084, ST-4085, ST-4086, ST-4087). Despite high genotypic diversity of C. coli on farm, retail meat products were consistently contaminated with isolates of the same STs, particularly ST854 and ST1056, as isolates collected from previous stages confirming persistence of strains from pre- to post-harvest.     

食品及环境阪崎肠杆菌分离株的MLST和PFGE分型方法比较

目的:对PFGE和MLST方法在阪崎肠杆菌分型研究中的分辨力和潜在价值进行了比较研究和论述。方法:采用PFGE和MLST方法对本实验室分离的19株阪崎肠杆菌和一株标准菌株ATCC51329进行分型研究。结果:PFGE方法可将20株阪崎肠杆菌分为6大类群,共16个PFGE型,分辨力为0.9474。而MLST方法可将20株菌株分为12个ST型,分辨力为0.9263。结论:PFGE法较MLST法具有较高的分辨力,可用于阪崎肠杆菌的溯源研究,而MLST分型方法能通过全球比对数据库得到更多的关于进化和亲缘关系的分析资料,在致病研究、流行病学调查、进化研究方面优于PFGE法。     

Assessment of molecular typing methods to determine invasiveness and to differentiate clones of Streptococcus pneumoniae

In the United States, Streptococcus pneumoniae is the leading cause of community-acquired pneumonia and invasive bacterial disease. As antimicrobial resistance increases, it will become critical to determine if strains circulating in a population are likely to cause invasive pneumococcal disease (IPD). This is possible by comparison of an isolate's genotype to strains known to be invasive. In this work, we compared pulse-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST), comparative genomic hybridization (CGH) and multi-invasive-locus sequence typing (MILST) for their ability to distinguish between known IPD causing and carrier strains using phylogenetic analyses. In addition, we assess the ability of these techniques to determine true clones from highly related strains. The resulting trees suggest that despite similar overall topologies, the clearest picture of invasiveness and genetic relatedness can be viewed when typing methods are used collectively.     

Genotypic characterization of Streptococcus pneumoniae serotype 19F in Malaysia

Streptococcus pneumoniae is an epidemiologically important bacterial pathogen. Recently, we reported the antibiotic susceptibility patterns of a limited collection of pneumococcal isolates in Malaysia with a high prevalence of erythromycin resistant strains. In the present study, 55 of the pneumococcal isolates of serotype 19F were further analysed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). The generated genotypic patterns were then correlated with the antibiograms previously reported. Forty-seven different PFGE profiles (PTs) were obtained, showing that the isolates were genetically diverse. MLST identified 16 sequence types (STs) with ST-236 being predominant (58.2%), followed by ST-81 (10.3%). Among the ST-236 isolates, 22 were erythromycin resistant S. pneumoniae (ERSP) and 15 were trimethoprim/sulfamethoxazole (TMP/SMX) resistant, while among ST-81, four isolates were ERSP and two were TMP/SMX resistant. The high prevalence of erythromycin resistant serotype 19F isolates of ST-236 in this study has also been reported in other North and South East Asian countries.     

我国九省（市、区）82株嗜肺军团菌血清1型菌株的序列分型

目的 了解我国环境水中嗜肺军团菌血清1型（Lp1）菌株的序列分型特征,并初步建立我国军团菌序列分型数据库。方法 采用序列分型(SBT)方法,对我国9个省（市、自治区）2005-2008年间环境水中分离的82株Lp1菌株进行分型,同时采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对这些菌株进行分型,并采用BioNumerics 5.1软件对2种方法的分型结果进行聚类分析和比较。结果 82株Lp1菌株分为22种序列(ST)型,其中17种ST型是新序列型,新发现1个等位基因;ST-1型为主要的序列型,在8个省（市、自治区）均有发现,该型菌株占所有菌株的46.3％ (38/82);ST-1、ST-150、ST-154、ST-159、ST-160和ST-630出现于2个以上的分离地点,5个分离位点(B4、B5、B6、S3和S8)发现2种以上ST型;通过聚类分析,15种ST型被分为3个序列群（ST-1序列群、ST-154序列群和ST-149序列群）,其余7种ST型没有序列群归类。采用PFGE分型方法,这些菌株可被分为46种带型。SBT和PFGE两种方法结合可将82株菌株分为54种分子型别。两种方法的聚类分析结果具有良好的一致性。结论 我国环境水中Lp1菌株具有独特的SBT分布;通过研究,初步建立了我国军团菌序列分型数据库。     

云南省6株C群脑膜炎奈瑟菌分子生物学特征分析

目的了解云南省分离出的C群脑膜炎奈瑟菌的分子特征。方法对C群菌株进行脉冲场凝胶电泳分型（PF-GE）、多位点测序技术（MLST）分型。结果对6株C群脑膜炎奈瑟菌进行脉冲场凝胶电泳,发现6种带型;6株C群做了MLST分型,分属5种,有4种MLST在当时的数据库中未找。结论云南省C群脑膜炎奈瑟菌的基因具有高度多样性,且没有典型的流行菌群。     

青岛地区医院内感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型研究

目的 探讨青岛地区医院内感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分子流行病学特征及脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别与菌株表型、一般临床资料间的关系.方法 收集2003-2007年间青岛地区主要医院内感染MRSA 360株,Sma Ⅰ酶切菌株染色体DNA后,进行PFGE电泳,用Bionumericus 2.0软件对电泳图谱进行比较和聚类分析,绘制进化树.同时对患者的性别、年龄、菌株来源等进行多变量统计分析.应用纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感谱,并与PFGE型别进行比较分析.PCR扩增不同PFGE型别MRSA代表株25株分离株的7个管家基因进行序列测定和多位点测序分型分析(MLST).结果 所有菌株经PFGE电泳后共分为5型(M0～M4型),其中M1型为优势菌型,M2型次之,M4型相对少见,M0为独特型,明显不同于其他已知PFGE型别.统计学分析发现5种PFGE型别在患者性别、年龄分布上的差异无统计学意义,但在菌株分离部位、来源有统计学的差异:M2型多分离自伤口感染,而M3型菌株多来自ICU病房,5种PFGE型在不同医院间及医院内的分布存在差异.M1与M2两型构成各医院分离菌株的主要型别.抗生素敏感性测定中未发现万古霉素耐药菌株,亦未发现某种PFGE型别与某种特定抗生紊抗性之间的直接相关性.MIST分型发现优势型M1与M3共属于国内常见ST239型,M2型则归类于ST5,M4型属于ST240,独特型中的2种PFGE谱型则分属于ST45及ST398.结论 ST239菌株为青岛地区医院内感染MRSA优势菌株;医院内MRSA的PFGE分型与菌株来源明显相关,与患者年龄、性别无关,MRSA感染普遍存在于各年龄人群中.