H295R细胞系类固醇生成试验的研究进展

2011年新修订的经济合作与发展组织（OECD）化学品测试指南中增添了指南456——H295R细胞系类固醇生成试验，用来筛选和检测潜在的内分泌干扰物。H295R细胞能表达类固醇激素生成过程中涉及的所有酶类，已作为有效的体外筛选环境类固醇激素干扰物的模型，也可作为研究肾上腺皮质分化及其类固醇激素的分泌与调控以及雄激素产生的调节作用的模型。H295R试验已用于美国内分泌干扰物筛选项目（EDSP）的一级筛选，还发展了高通量H295R细胞系类固醇生成试验方法。本文主要就H295R细胞系的建立，在环境类固醇激素干扰中的应用，以及目前存在的问题作一综述。     

双酚A与肿瘤相关性的研究进展

双酚A（BPA）是一种常见的、具有显著类雌激素作用的环境内分泌干扰物，被认为与多种疾病的发生有关。恶性肿瘤作为严重影响人类健康的一类疾病，其与BPA的关联性受到了研究者的广泛关注并开展了深入的研究。本文总结了BPA与恶性肿瘤相关研究的最新进展，包括激素依赖性及非激素依赖性肿瘤，以及相应的流行病学研究或体内、外实验研究证据；同时，归纳了BPA促进恶性肿瘤发生发展的分子机制；此外，还分析了当前研究中存在的问题和不足。以上内容将为进一步研究BPA对恶性肿瘤发生发展的影响，为寻找预防或降低BPA健康损伤的措施提供有益信息。     

双酚A与肿瘤相关性的研究进展

双酚A（BPA）是一种常见的、具有显著类雌激素作用的环境内分泌干扰物，被认为与多种疾病的发生有关。恶性肿瘤作为严重影响人类健康的一类疾病，其与BPA的关联性受到了研究者的广泛关注并开展了深入的研究。本文总结了BPA与恶性肿瘤相关研究的最新进展，包括激素依赖性及非激素依赖性肿瘤，以及相应的流行病学研究或体内、外实验研究证据；同时，归纳了BPA促进恶性肿瘤发生发展的分子机制；此外，还分析了当前研究中存在的问题和不足。以上内容将为进一步研究BPA对恶性肿瘤发生发展的影响，为寻找预防或降低BPA健康损伤的措施提供有益信息。     

siRNA 干扰胰岛素样生长因子1 受体表达对缺氧环境下肝癌HepG2 细胞周期及凋亡的影响

目的：探讨siRNA技术干扰胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factors-1 receptors, IGF-1R）表达对缺氧环境下肝癌HepG2 细胞周期和凋亡的影响。方法：采用氯化钴处理制备实验所需的肝癌缺氧细胞模型。设计并合成3 对siRNA序列和1 对阴性对照序列，转染缺氧的肝癌HepG2 细胞24 h 后以荧光显微镜观察转染效果，采用WB法检测IGF-1R蛋白表达筛选出干扰效率最高的siRNA序列。选用该序列再次转染缺氧肝癌细胞，以流式细胞术、MTT法检测细胞的周期、凋亡和增殖变化，以WB法检测HepG2 细胞中CDK1、CDK2 和Caspase-3 蛋白的表达。结果：成功建立缺氧HepG2 细胞模型，siRNA转染缺氧HepG2 细胞后以IGF-1R-siRNA-2 转染效率最高且敲减IGF-1R表达最明显（均P<0.01）。IGF-1R-siRNA-2 转染的HepG2 细胞的增殖被明显抑制（P<0.05 或P<0.01）、细胞周期被阻滞在G0/G1（P<0.05）、细胞凋亡率明显增加至（25.3±1.3）%（P<0.01），同时发现敲减IGF-1R后缺氧HepG2 细胞中CDK1、CDK2 蛋白表达明显降低而Caspase-3 表达则明显增加（P<0.05或P<0.01）。结论：siRNA干扰IGF-1R表达通过调控细胞周期和凋亡相关蛋白而抑制缺氧环境中HepG2细胞的恶性生物学行为，IGF-1R可能是HCC潜在的治疗靶点。     

环境内分泌干扰化学物与人类健康

有越来越多的证据表明人类生殖卫生受到损害，例如男人睾丸肿瘤增多，妇女患乳房癌增加。环境中一系列具有激素作用的化学物首先受怀疑。环境中有些外源物质（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ）进入身体后，能干扰内分泌系统，引起不良健康效应，通称为内分泌干扰化学物（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇｃｈｍｉｃａｌｓ，ＥＤＣ），亦称为激素类似物（ｈｏｒｍｏｎｅｍｉｎｅｔｉｃｓ）。１ＥＤＣ的来源：ＥＤＣ来自天然物质或人工合成（１）天然食物中的植物雌激素（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ）。多为非类固醇化合物，如异黄酮类。…     

TIZ基因mRNA在卵巢癌细胞系中的表达及其RNA干扰载体构建

目的检测卵巢癌细胞株中TIZ基因的mRNA表达水平,并构建TIZ基因的特异性RNA干扰（RNAi）载体。方法通过RT-PCR方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、SKOV3顺铂耐药细胞、SKOV3卡铂耐药细胞、A2780、A2780卡铂耐药细胞、H08910）中TIZmRNA的表达;根据Genebank上TIZ的mRNA序列,设计5对siRNA干扰片段,采用脂质体转染法介导siRNA干扰片段并下调卵巢癌细胞系中TIZmRNA的表达。采用pTG19-T质粒构建TIZ和β-actintmRNA表达重组质粒并制备其标准品。采用实时定量PCR（QRT—PCR）检测siRNA干扰片段对TIZ基因的下降效率,并筛选最佳siRNA干扰片段。以pGPU6／GFP／Neo载体和质粒DNA测序方法构建pGPU6／GFP／Neo-siRNA—TIZ-573重组质粒。结果①除卵巢癌细胞H08910细胞无TIZ基因mRNA表达外,其余细胞均有TIZ基因mRNA表达。②细胞siRNA干扰片段筛选结果显示介导TIZ-573片段后可下调60％细胞TIZmRNA表达。③成功构建了TIZ基因RNAi载体pG-PU6／GFP／Neo-TIZ-573。结论多数卵巢癌细胞系表达TIZmRNA。siRNA-TIZ-573为最佳下调细胞TIZmRNA片段。构建的pGPU6／GFP／Neo-TIZ-573重组质粒可用于下一步的实验研究。     

滋养细胞及其肿瘤的单克隆抗体研究进展

滋养细胞及其肿瘤的单克隆抗体研究进展郑颂国，许良中上海医科大学肿瘤医院病理研究室（上海２０００３２）滋养细胞及其肿瘤具有独特的内分泌功能，它们可以分泌各种酶、类固醇激素、糖蛋白，胎盘蛋白和结合蛋白等。根据形态和功能、滋养细胞可以分为细胞滋养细胞（Ｃｙ...     

胃小细胞神经内分泌癌的内科治疗进展

胃神经内分泌肿瘤是一类源自类肠嗜铬细胞（即胃神经内分泌细胞）的肿瘤，能分泌多种激素，引起相应的临床症状。根据其分化程度分为高分化（Ⅰ型）及低分化（Ⅱ型）两种类型。Ⅰ型分为ⅠA：高分化神经内分泌肿瘤（well—differentiated neuroendocrine tumours），ⅠB：高分化神经内分泌癌（well—differentiated neuroendocrine carcinomas）；Ⅱ型即低分化神经内分泌癌（poorly—differentiated neuroendocrine carcinomas），亦称为胃小细胞神经内分泌癌。胃小细胞神经内分泌癌虽然发病率较低，但是其分化差，     

邻苯二甲酸酯类化合物的生殖毒性及其环境内分泌干扰效应

邻苯二甲酸酯类(PAEs)增塑剂是广泛存在于人类生活环境中的化合物之一。由于其环境内分泌干扰效应受到全球相关领域的高度关注。它经过食物链进入人体并蓄积在体内,影响人类生殖健康,对生殖、发育、激素分泌以及基因表达造成损害。目前的研究表明,PAEs可引起生殖能力受损,并对后代发育产生影响。且PAEs通过内分泌干扰效应,干扰体内相关激素的分泌与功能,其在血液和尿液中的代谢物与糖尿病的发生密切相关。因此,本文主要对PAEs的生殖毒性及其环境内分泌干扰效应的研究进展作一综述。     

RNA干扰抑制血管内皮生长因子影响舌癌耐药细胞移植瘤增殖及血管生成

目的研究RNA干扰抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达对舌癌耐药细胞移植瘤增殖及血管生成的影响。方法用顺铂体外连续诱导法诱导舌癌Tca8113细胞系获得耐药细胞,将耐药细胞接种裸鼠皮下建立移植瘤模型,并随机分为空白对照组、空载体组、无关片段组、干扰质粒组。以脂质体法对空载体组、无关片段组、干扰质粒组进行瘤内及瘤周注射转染,RNA干扰抑制VEGF的表达,测量瘤体重量及体积,免疫组化法检测移植瘤PCNA、CD34,比较肿瘤增殖性及微血管参数,原位杂交法检测VEGFmRNA,免疫印迹法检测VEGF蛋白。结果干扰质粒组的瘤体体积、重量、PCNA平均光密度值、微血管参数均小于其他各组（P〈0．05）。干扰质粒组中VEGFmRNA及蛋白表达水平较其他各组明显下降（P〈0．05）。结论通过靶向VEGF的RNA干扰下调VEGF的表达,能抑制人舌癌耐药细胞移植瘤的增殖及血管生成,提示RNA干扰抑制VEGF可能为临床治疗耐药舌痛柽供新途径。     

巨核白血病细胞系(HI—Meg)对抗癌药物敏感性的测定及其意义

应用~3H—TdR掺入、死活细胞计数和集落形成试验三种体外药物检测方法,测定了人巨核白血病细胞系(HI—Meg)对6种临床抗癌药物的敏感性,并用人早幼粒白血病细胞系(HL—60)作比较。结果表明6种药物对两株细胞均有较好的剂量效应曲线和较高的敏感性。HI—Meg的建立为抗癌药物筛选提供了一个新的模型,并可用于寻找和筛选有效的抗巨核细胞白血病的药物。     

DcR3-RNAi对人SW-480结肠癌细胞系恶性表型的影响

目的:观察研究抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.方法:应用RNA干扰(RNAi)技术,构建小双链DNA,克隆入表达载体,转染进入SW480结肠癌细胞系(DcR3高表达细胞),在细胞内形成小干扰双链RNA;识别并降解DcR3 mRNA.筛选DcR3低表达转染癌细胞,3H观测其体外DcR3-SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.结果:转染的DcR3-SW480-RNAi-F1R1细胞可降低DcR3 mRNA的转录,凝胶电泳反应产物显示与对照组相比,DcR3-SW480-RN-Ai-F1R1细胞组条带明显减弱;3H掺入细胞的定量分析显示DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞的数量明显减少,P<0.001;Western 印记检测显示凋亡抗体Caspase-3及PARP表达增加.结论:经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低.肿瘤细胞的生长数量减少,凋亡表达增加, 有一定可探索性抗癌前景.     

Lewis y抗原促进卵巢癌细胞RMG—I血管内皮生长因子受体的表达

目的：探讨α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT）基因转染对卵巢癌细胞系RMG—I血管内皮生长因子受体（VEGFR）的影响。方法：利用已经建立的α1,2-岩藻糖转移酶及LewisY稳定高表达的RMG—I—H细胞系、裸鼠移植瘤模型,采用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）测定基因转染前后细胞中VEGFRmRNA的变化,采用免疫组织化学法测定基因转染前后细胞及裸鼠移植瘤组织中VEGFR蛋白的变化。结果：基因转染后细胞中KDRmRNA表达明显增高（P〈0．01）,细胞、裸鼠移植瘤组织中KI）R蛋白表达也明显增高,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：LewisY抗原可能通过VEGF的自分泌和旁分泌途径引起KDR受体数目增多,从而促进肿瘤血管生成,介导卵巢癌的生长、侵袭、转移和耐药等生物学行为。     

南方红豆杉水提物逆转非小细胞肺癌干细胞耐药作用的实验

目的 研究南方红豆杉水提物逆转非小细胞肺癌干细胞耐药作用的机制。方法 选取人非小细胞肺癌H460细胞为实验细胞,以侧群细胞及细胞表面标志物鉴定法筛选出其中的干细胞;CCK8（cell counting kit-8）法检测红豆杉水提物对H460干细胞的毒性,并检测红豆杉水提物逆转H460干细胞对顺铂的耐药性;流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测红豆杉水提物逆转H460干细胞耐药的作用机制。结果 红豆杉水提物对H460干细胞有细胞毒性,测得H460干细胞的IC50为1 449.5 μg/ml;用红豆杉水提物预处理后的H460干细胞进行实验发现,顺铂的抗肿瘤效应明显增强,其作用机制为抑制细胞膜上的P-gp蛋白来降低有效药物排出量。结论 南方红豆杉水提物能够较强的逆转非小细胞肺癌干细胞的耐药性。     

特异性沉默Eca109 细胞系stat hmin 基因siRNA 表达载体的构建

 目的 构建并筛选特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞克隆。方法 用DNA重组技术,将64nt能转录产生靶向stathmin小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER-EGFP,应用脂质体将重组逆转录病毒载体pSUPER-S转染细胞系Eca109,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,RT-PCR检测转染细胞stathminmR-NA的表达。结果 重组逆转录病毒载体经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,可见4692nt和285nt条带;测序结果表明插入序列正确;重组载体转染Eca109细胞,可表达绿色荧光蛋白（EGFP）,经G418筛选得到抗性细胞克隆,转染细胞stathmin mRNA的表达较对照组明显减弱。结论 特异性沉默stathmin基因的pSUPER-S逆转录病毒载体以及稳定表达的细胞系构建和筛选成功。     

稳定敲降NF-YB基因HeLa细胞系的构建

目的：利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术，构建稳定敲降NF-YB基因的HeLa细胞系。方法：设计shRNA-NF-YB引物，利用分子克隆技术构建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB质粒，转染293T后收集病毒感染HeLa细胞；用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定敲降细胞株；利用Western blot和实时荧光定量PCR对细胞系进行鉴定。结果：构建的质粒经测序后与设计的引物对比序列一致，Western blot和实时荧光定量PCR结果表明构建细胞的NF-YB蛋白和mRNA表达抑制效果明显。结论：本实验成功构建了NF-YB-shRNA-HeLa细胞系，获得了特异性NF-YB基因敲降的HeLa细胞。     

稳定敲降NF-YB基因HeLa细胞系的构建

目的：利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术,构建稳定敲降NF-YB基因的HeLa细胞系。方法：设计shRNA-NF-YB引物,利用分子克隆技术构建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB质粒,转染293T后收集病毒感染HeLa细胞;用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定敲降细胞株;利用Western blot和实时荧光定量PCR对细胞系进行鉴定。结果：构建的质粒经测序后与设计的引物对比序列一致,Western blot和实时荧光定量PCR结果表明构建细胞的NF-YB蛋白和mRNA表达抑制效果明显。结论：本实验成功构建了NF-YB-shRNA-HeLa细胞系,获得了特异性NF-YB基因敲降的HeLa细胞。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂15d-PGJ2抑制垂体腺瘤细胞生长的研究

目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）激动剂15d—PGJ2对垂体腺瘤细胞生长和激素分泌的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：采用MTT和ELISA法检测15d—PGJ2对大鼠垂体腺瘤细胞系GH3细胞增殖和生长激素分泌的抑制效应，进一步应用电镜、FCM及Western blot分别检测细胞凋亡、细胞周期以及caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果：15d—PGJ2呈剂量和时间依赖性方式抑制GH3细胞增殖和GH分泌，与对照组相比，差异有统计学意义，P〈0．05。15d-PGJ2干预后，GH3细胞出现典型的凋亡形态学表现；Q和S期的细胞比例下降，而G1期的细胞比例明显增加；细胞中Bax和caspase-3蛋白表达水平明显增加，而Bcl-2蛋白表达水平下调，且表现出剂量依赖效应。与对照组相比，差异均有统计学意义，P〈0．05。结论：15d-PGJ2可能通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞来抑制垂体腺瘤细胞生长和激素分泌，这为垂体腺瘤的防治提供一个新的分子靶点。     

RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的：应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法：将VEGF基因作为RNA干扰的靶区，通过E—RNAi网上提供的服务，设计两个特异的RNA干扰序列，将其装入含U6启动子的载体上，构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体，再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2，通过RT—PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果：成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体，RT—PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中，能明显抑制VEGF基因的表达，抑制率分别为72％和42％。但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28％和13％；Northern杂交显示，在HEK293细胞和HT29细胞中，VEGF mRNA明显受抑，抑制率达88％和89％；免疫荧光显示，在HT29细胞中，VEGF蛋白表达的受抑制率为73％。结论：针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达，但在不同细胞系中的作用强度存在差别。     

肿瘤细胞分泌物抑制树突状细胞的生成和功能

目的：探讨肿瘤细胞对人单个核细胞源树突状细胞（dendritic cells,DC）的生成和功能的影响。方法：培养外周血单个核细胞源DC，体系中加入人肝癌细胞系H7402，结肠癌细胞系HCT－8及正常人骨髓基质细胞系HFCL的培养上清液，以正常培养体系为对照。应用流式技术检测DC的细胞表面标志及吞噬功能；通过[^3H]－TdR掺入法检测DC激活同种异体T淋巴细胞活化的能力。结果：H7402和HCT－8细胞培养上清液作为条件培养的DC，低表达CD1a抗原、共刺激分子（CD86）及MHC-Ⅱ类分子，与对照及基质细胞组比较有明显差异。DC成熟也受到抑制。此外，DC对葡聚糖（Dextran）的吞噬功能下降，对同种异常T淋巴细胞激活的能力较低。结论：肿瘤细胞分泌的某些物质可抑制DC的生成及其相关功能，这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一。