胃癌干细胞中差异表达microRNA对其生物学特性的影响

[目的]探讨胃癌干细胞中差异表达microRNA及其对胃癌干细胞生物学特性(自我更新、侵袭、耐药能力)的调控作用.[方法]采用无血清悬浮培养法和干细胞标志物流式分选术分离人胃癌干细胞;分别采用胃癌细胞球形成实验、体外侵袭、耐药实验鉴定胃癌干细胞的生物学特性;microRNA表达谱芯片检测人胃癌干细胞中差异表达microRNA;采用定量逆转录PCR(qRT-PCR)技术检测相关差异表达microRNA的表达情况,验证microRNA芯片结果;相关microRNA抑制剂干扰后,分别进行胃癌细胞球形成实验、体外侵袭与耐药实验检测microRNA对人胃癌干细胞自我更新、侵袭、耐药能力的影响.[结果]成功分离得到人胃癌干细胞CD44(+)亚群,其具有典型的肿瘤干细胞生物学特性:较强的自我更新能力、侵袭和耐药能力.与CD44(-)细胞亚群相比,人胃癌干细胞CD44(+)细胞亚群高表达miRNAs共有17个;低表达miRNAs共有33个.采用qPCR技术验证microRNA表达谱芯片相关结果,得到:CD44(+)亚群中miR-196a-5p、miR-155-5p、miR-30a、miR-30b、miR-30c表达上调,miR-1246、miR-195-5b表达下调.抑制相关高表达microRNA(miR-196a-5p、miR-155-5p,miR-30a,miR-30b、miR-30c)表达后,肿瘤干细胞的自我更新能力、侵袭和耐药能力均下降.[结论]胃癌干细胞中具有多种差异表达microRNA,microRNA对胃癌干细胞生物学特性具有调控作用.     

miRNA在有无淋巴结转移结肠癌中的表达

[目的]分析miRNA在有无淋巴结转移的结肠癌中的差异表达,筛选出与结肠癌淋巴结转移有关miRNA。[方法]选取6例结肠癌患者的冰冻组织标本,其中3例有淋巴结转移,3例无淋巴结转移。提取肿瘤组织标本的miRNAs,采用微阵列法分析有无淋巴结转移结肠癌的miRNAs表达谱。为验证微阵列表达谱的结果,选择miR-142-3p做qRT-PCR。[结果]有淋巴结转移结肠癌与无淋巴结转移的结肠癌相比,上调表达的miRNA有4个,为miR-21＊,miR-212,miR-33b＊和miR-886-3p;下调表达的miRNA有3个,为miR-142-3p,miR-142-5p和miR-362-5p。qRT-PCR结果显示miR-142-3p在有淋巴结转移的结肠癌组织中表达明显下降,与miRNAs微阵列检测结果一致。[结论]有无淋巴结转移的结肠癌具有不同的miRNAs表达谱。     

microRNA-21通过Bcl-2通路调节胃癌紫杉醇化疗耐药性

目的:研究miR-21在胃癌组织中的表达水平及对胃癌生物学行为的影响,探讨miR-21与紫杉醇化疗耐药性的关系及机制。方法:实时荧光定量（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）比较25例胃癌组织和癌旁组织中miR-21的表达差异;细胞实验探讨miR-21对胃癌细胞增殖、凋亡能力的影响;MTT法测定紫杉醇对SGC-7901细胞的生长抑制率;Western blot验证Bcl-2、Bax、PTEN蛋白表达和miR-21的关系。结果:miR-21在胃癌组织中表达水平高于癌旁正常组织（P=0.015）;与NC组比较,转染miR-21模拟物的胃癌SGC-7901细胞增殖能力（P＜0.05）增强,下调miR-21表达水平可促进胃癌细胞凋亡(P＜0.05);转染miR-21 mimic组的紫杉醇对胃癌细胞的抑制率明显低于miR-21 inhibitor组;miR-21 inhibitor组较NC组中Bcl-2的蛋白水平下降（P=0.000）,而PTEN（P=0.039）、Bax（P=0.037）表达升高。结论:miR-21在胃癌组织中过表达,且过表达的miR-21可能通过升高Bcl-2表达并降低Bax、PTEN蛋白表达从而促进胃癌细胞增殖,抑制胃癌细胞凋亡,并增加紫杉醇化疗耐药性。     

肝细胞癌组织microRNA-187-3p表达预后意义

目的 微小RNA (microRNA,miRNA)差异表达与多种肿瘤的发生发展密切相关,但微小RNA-187-3p(miR-187-3p)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及预后意义研究较少.本研究检测HCC组织中microRNA的表达谱,分析miR-187-3p在HCC组织中的表达及其与临床病理特征之间的关系,探讨miR-187-3p表达在其发生、发展及预后中的作用.方法 利用microRNA芯片杂交技术筛选5例HCC组织及相应癌旁组织中差异表达的microRNA,然后通过实时荧光定量PCR(real-time fuorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)法验证86例HCC组织及相应癌旁组织中miR-187-3p表达水平,并统计临床病理资料,随访生存期.结果 148个microRNAs在HCC组织中差异表达,其中102个microRNAs在HCC组织较相应癌旁组织表达下调,46个microRNAs在HCC组织较相应癌旁组织表达上调.RFQ-PCR结果显示,miR-187-3p在HCC组织中表达水平明显低于相应癌旁组织,差异有统计学意义,Z=-2.244,P=0.025.HCC中miR-187-3p表达状态与肿瘤大小(x2=5.031,P=0.025)相关,而与性别(x2=3.648,P=0.056)、年龄(x2=0.003,P=0.956)、是否转移(x2=0.005,P=0.943)、TNM分期(x2=0.129,P=0.719)、肿瘤数目(x2 =0.126,P=0.722)、乙肝表面抗原(x2=0.019,P=0.890)、AFP水平(x2=0.187,P=0.665)和Child分级(x2=1.665,P=0.197)无关.miR-187-3p低表达的HCC患者总生存期较高表达者明显缩短,x2=7.684,P=0.006.且多因素分析发现,miR-187-3p表达水平和TNM分期是影响HCC患者生存预后的独立危险因素.结论 miR-187-3p在一定程度上参与了HCC的发生发展,其有望成为HCC新的潜在的治疗靶点以及诊断、判断病情和预测预后的分子标志物.     

miR-141-3p在胃癌组织和患者血浆中的表达及其临床意义

目的:检测miR-141-3p在胃癌组织及患者血浆中的表达水平,探讨其表达水平与患者病理特征和预后的关系.方法:收集河北医科大学第四医院普外科2012年5月至2013年1月胃癌根治性手术切除的组织标本及术前外周静脉血标本44例,每例标本采集肿瘤组织(非坏死部分)和配对的癌旁组织.采用实时荧光定量PCR法检测miR-141-3p在胃癌组织、癌旁组织、血浆及健康志愿者血浆(25例)的表达情况,分析miR-141-3p的表达水平与胃癌患者DFS及临床病理特征的关系.结果:miR-141-3p在胃癌组织中的表达明显降低,在血浆中的表达水平明显升高(均P＜0.01).在胃癌组织中miR-141-3p高表达组DFS明显高于低表达组(21.8 vs 10.3个月,P＜0.01),且miR-141-3p在癌组织中的表达水平与患者DFS呈正相关(P＜0.01).在血浆中miR-141-3p的高表达组DFS明显低于低表达组(9.1 vs 21.0个月,P＜0.01),且miR-141-3p血浆中的表达水平与患者DFS呈负相关(P＜0.01).miR-141-3p在胃癌患者血浆中表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及脉管瘤栓相关(P＜0.01).结论:miR-141-3p在胃癌组织中表达显著降低且与患者预后呈正相关,其在患者血浆中表达显著升高且与患者预后呈负相关,表明miR-141-3p可作为胃癌早诊早治及患者临床预后判定的潜在标志物.     

miR-125a-5p通过下调BAG4表达抑制胃癌细胞迁移和侵袭

目的：探讨miR-125a-5p通过调控Bcl-2相关永生基因4（Bcl-2-associated athanogene 4,BAG4）的表达抑制胃癌细胞 迁移和侵袭的分子机制。方法：选用2014年1月至2015年12月兰州大学第一医院手术切除的82例胃癌组织标本及配对的癌旁 组织以及人胃癌细胞系MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及人胃黏膜上皮细胞（GES-1）,qPCR法检测胃癌组织、癌旁组织及 胃癌细胞系中miR-125a-5p的表达水平。分别将miR-125a-5p mimic、miR-125a-5p inhibitor、（si-BAG4）siRNA-BAG4及阴性对照 质粒转染至胃癌细胞,划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别检测miR-125a-5p/BAG4信号轴对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影 响。WB检测胃癌细胞中BAG4蛋白的表达。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p和BAG4之间的靶向调控关系。结果： miR-125a-5p在胃癌组织和细胞系中均低表达（均P<0.01）。miR-125a-5p的表达与患者的性别（P=0.953）、年龄（P=0.772）、肿瘤 部位(P=0.867)、组织学分级（P=0.745）和肿瘤大小（P=0.088）无相关性 ,与胃癌患者的 T 分期（P=0.003）、N 分期（P=0.001）、 M分期（P=0.027）和TNM分期（P=0.035）显著相关,差异有统计学意义。miR-125a-5p低表达是胃癌患者总生存时间的独立危险 因素。过表达miR-125a-5p显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.01）。敲降BAG4可逆转miR-125a-5p inhibitor对胃癌细 胞迁移和侵袭能力的抑制作用。荧光素酶报告基因实验证实miR-125a-5p可与BAG4 3''非翻译区（untranslated regions,UTR）结 合抑制其表达。结论：miR-125a-5p通过靶向下调BAG4的表达水平进而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。的表达抑制胃癌细胞 迁移和侵袭的分子机制。方法：选用2014年1月至2015年12月兰州大学第一医院手术切除的82例胃癌组织标本及配对的癌旁 组织以及人胃癌细胞系MGC803、BGC823、SGC7901、HGC27及人胃黏膜上皮细胞（GES-1）,qPCR法检测胃癌组织、癌旁组织及 胃癌细胞系中miR-125a-5p的表达水平。分别将miR-125a-5p mimic、miR-125a-5p inhibitor、（si-BAG4）siRNA-BAG4及阴性对照 质粒转染至胃癌细胞,划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别检测miR-125a-5p/BAG4信号轴对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影 响。WB检测胃癌细胞中BAG4蛋白的表达。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p和BAG4之间的靶向调控关系。结果： miR-125a-5p在胃癌组织和细胞系中均低表达（均P<0.01）。miR-125a-5p的表达与患者的性别（P=0.953）、年龄（P=0.772）、肿瘤 部位(P=0.867)、组织学分级（P=0.745）和肿瘤大小（P=0.088）无相关性 ,与胃癌患者的 T 分期（P=0.003）、N 分期（P=0.001）、 M分期（P=0.027）和TNM分期（P=0.035）显著相关,差异有统计学意义。miR-125a-5p低表达是胃癌患者总生存时间的独立危险 因素。过表达miR-125a-5p显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力（均P<0.01）。敲降BAG4可逆转miR-125a-5p inhibitor对胃癌细 胞迁移和侵袭能力的抑制作用。荧光素酶报告基因实验证实miR-125a-5p可与BAG4 3''非翻译区（untranslated regions,UTR）结 合抑制其表达。结论：miR-125a-5p通过靶向下调BAG4的表达水平进而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。     

靶向PIK3CA候选miRNAs在胃癌细胞与血清中表达的分析

目的:预测和筛选靶向PIK3CA的候选miRNAs并检测其在胃癌细胞和血清中的表达.方法:采用生物信息学并结合既往文献和前期研究,预测和筛选出靶向PIK3CA的候选miRNAs(miR-203和miR-506).常规提取胃癌细胞和血清总RNA,并用DNase Ⅰ进行消化.以miRNAs特异性茎-环引物引导反转录,通过实时荧光定量PCR对miR-203、miR-506和内参U6进行检测,并采用琼脂糖凝胶电泳检测定量PCR产物.结果:电泳检测细胞和血清中RNA纯度较好；胃癌细胞和血清中miR-203、miR-506和内参U6均能实现特异性扩增.miR-203在胃癌细胞SGC-7901及MGC-803中表达分别为1.360±0.102和1.241±0.110,差异无统计学意义,t=3.125,P=0.09;miR-203在胃癌患者血清中表达为1.420±0.122,明显低于健康人的3.450--0.206,t=2.521,P=0.02.miR-506在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803及胃癌患者和健康人血清中表达水平分别为1.256±0.113、1.158±0.109、1.735±0.220和1.592±0.134,差异无统计学意义,P＞0.05.结论:miR-203可能是调控PIK3CA基因的miRNAs之一.PIK3CA在胃癌中的高表达可能与miR-203的异常低表达有关,而与miR-506无关.胃癌患者血清中miR-203的表达有望成为预测胃癌发生或发展的一个重要的分子标志.     

肝X受体α在胃癌组织中表达的临床意义

[目的]探讨肝X受体α(LXRα)在胃癌组织中表达的临床意义.[方法]收集2011年5月至2014年5月在上海市第五人民医院手术的胃癌组织及癌旁正常组织各65例,利用免疫组化和荧光定量PCR方法检测各组织中LXRα的表达,分析LXRα表达与胃癌临床病理特征的关系.[结果] LXRα蛋白在胃癌组织中表达高于癌旁正常组织(P=0.000);LXRα在超过5cm的胃癌组织中表达高于5cm以下的肿瘤(x2=6.744,P=0.011),有淋巴结转移高于无淋巴结转移(x2=28.765,P=0.000),有远处转移高于无远处转移(x2=5.647,P =0.024),T分期越高表达越高(x2=13.965,P=0.003);LXRα表达与年龄(x2=0.018,p=1.000)、性别(x2=0.492,P=0.728)、肿瘤部位(x2=1.400,P=0.266)及病理分型(x2=0.376,P=0.945)无明显相关.[结论]LXRα蛋白在胃癌组织中表达更高,与胃癌大小、淋巴结转移、远处转移和T分期相关;推测LXRα参与调控胃癌生长转移.     

胃癌组织中p53蛋白及Rasp21蛋白的表达及意义

目的:联合检测p53蛋白及Ras p21蛋白在正常胃组织及胃癌组织中的表达,探讨二者与胃癌分化程度及5年生存率间的关系。方法:应用流式细胞术(FCM)对13例正常胃组织及27例胃癌组织细胞进行p53蛋白及Ras p21蛋白含量的定量检测。结果:p53蛋白在正常胃组织的表达均为阴性,85.2%(23/27)的胃癌组织p53表达阳性,p53蛋白表达量(FI值)和p53蛋白阳性表达率与胃癌组织分化程度及5年生存率有明显相关性(P<0.01)。Ras p21蛋白在正常胃组织中表达均为阴性,71.45%的胃癌组织Ras p21蛋白表达阳性;胃癌组织Ras p21蛋白表达量(FI)和Ras p21蛋白阳性表达率与胃癌组织分化程度及5年生存率有明显相关性(P<0.05)。p53蛋白表达与Ras p21蛋白表达呈正相关(r=0.755)。结论:p53蛋白及Ras p21蛋白过表达与胃癌组织的分化程度及预后有明显相关性,p53蛋白及Ras p21蛋白的高表达与胃癌的发生、发展有密切关系,联合检测p53及Ras p21蛋白可作为判断胃癌恶性程度及预后的有效指标。     

microRNA-21表达水平与胃癌患者新辅助化疗敏感性的研究

目的:探讨microRNA-21表达水平与胃癌患者新辅助化疗敏感性的关系。方法:选择新疆医科大学第三临床医学院（附属肿瘤医院）消化内科2016年1月到2018年1月就诊胃癌患者90例，按照化疗治疗结果分为敏感组及非敏感组。所有患者按照SOX方案进行化疗，21 d为一个周期，持续治疗4个周期，所有患者均在化疗后1个月进行手术治疗，并在术中获得组织标本。检测患者癌变组织及正常胃部上皮组织中miR-21表达水平，统计不同临床病理特征患者中癌变组织miR-21表达水平，检测化疗前后敏感组及非敏感组患者癌变组织中miR-21表达水平。结果:胃癌患者癌变组织中miR-21水平为4.68±0.49，明显高于正常胃部组织中miR-21水平（3.35±0.37）（P＜0.05）；患者在不同分化程度、T分期、N分期上miR-21表达水平有差异（P＜0.05）；化疗后，两组患者miR-21表达水平均降低（P＜0.05）；化疗前后，敏感组miR-21表达水平均低于非敏感组（P＜0.05）。结论:microRNA-21低表达水平患者采用SOX新辅助化疗效果更好。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

MRI of transgene expression: correlation to therapeutic gene expression

Magnetic resonance imaging (MRI) can provide high-resolution 3D maps of structural and functional information, yet its use of mapping in vivo gene expression has only recently been explored. A potential application for this technology is to noninvasively image transgene expression. The current study explores the latter using a nonregulatable internalizing engineered transferrin receptor (ETR) whose expression can be probed for with a superparamagnetic Tf-CLIO probe. Using an HSV-based amplicon vector system for transgene delivery, we demonstrate that: 1) ETR is a sensitive MR marker gene; 2) several transgenes can be efficiently expressed from a single amplicon; 3) expression of each transgene results in functional gene product; and 4) ETR gene expression correlates with expression of therapeutic genes when the latter are contained within the same amplicon. These data, taken together, suggest that MRI of ETR expression can serve as a surrogate for measuring therapeutic transgene expression.     

血液肿瘤基因表达和基因表达模式研究进展

基因表达失调与血液肿瘤的生物学特性、治疗反应和预后密切相关。近年迅速发展的转录组测序、单细胞转录组测序等技术为发现疾病诊疗相关的标志性基因和研究基因表达模式提供了强有力的工具。文章结合第62届美国血液学会(ASH)年会中的报道介绍相关研究进展。     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

哺乳动物细胞CDK2系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶2（cyclin-dependent kinase 2,CDK2）在哺乳动物细胞的表达载体,为研究CDK2的功能和修饰提供实验材料。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增CDK2编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK2片段分别亚克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;最后,将获得的表达载体PEGFP/CDK2转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行初步的CDK2表达分析。结果：RT-PCR扩增获得约900 bp的目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析,显示重组片段是人CDK2基因序列;CDK2片段分别亚克隆入上述4种载体后获得相应表达载体;运用构建的PEGFP/CDK2表达载体,在NIH3T3细胞中表达出CDK2蛋白。结论：成功构建了CDK2的哺乳动物细胞系列表达载体,并在NIH3T3细胞中成功表达目的蛋白。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.