siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响

目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。方法：设计合成VEGFsiRNA1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果。结果：转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显。结论：VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同。作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法。     

HPV18E6基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响

目的：观察RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达对宫颈癌Hela细胞牛长和凋亡的影响，探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法：针对HPV18E6 mRNA序列合成一对60bp的编码siRNA的DNA模板和一对60bp的非特异性对照DNA模板，构建pSUPER—siRNA和pSUPER—com重组质粒，瞬时转染Hela细胞；采用RT—PCR法检测质粒转染后细胞HPV18E6基因表达的变化，用蛋白免疫印迹法检测转染后Hela细胞p53、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达变化，以细胞计数法检测细胞生长情况，Hoechest／PI双荧光活细胞染色法检测细胞凋亡。结果：pSUPER—siRNA质粒转染能有效降低HPV18E6在mRNA水平的表达，转染后48小时，抑制效率达70％以上；转染后细胞053、p21和Bax蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达减少。RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达后，Hela细胞增殖受到明显抑制，细胞凋亡率明显增加。结论：pSUPER—siRNA质粒转染可有效抑制HPV18E6在人宫颈癌Hela细胞中的表达，抑制Hela细胞生长并促进其凋亡。以HPV18E6为靶点的RNA干扰技术可望成为宫颈癌基因治疗的新途径。     

siRNA沉默YAP1对宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭的影响

目的:用小干扰RNA(siRNA)沉默宫颈癌Hela细胞中YAP1基因的表达,观察YAP1表达降低对细胞增殖和侵袭能力的影响,初步探讨YAP1在宫颈癌中的作用。方法:qRT-PCR和Western blot方法检测宫颈癌Hela细胞及正常宫颈上皮细胞H8中YAP1的表达,siRNA YAP1转染Hela细胞沉默YAP1表达,并以转染control siRNA的细胞作为对照,转染48h后,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测沉默效果。用MTT法检测沉默后细胞增殖情况。Transwell 检测细胞侵袭能力。结果:YAP1在宫颈癌细胞中高表达。siRNA能够有效沉默Hela细胞中YAP1的mRNA 及蛋白的表达。沉默YAP1表达能够明显抑制Hela细胞的增殖及侵袭能力。结论:YAP1蛋白在宫颈癌细胞中高表达并具有促进细胞增殖及侵袭的能力。     

肝癌细胞系中Oct4与Wnt/β-catenin 和TGF-β信号通路的相互影响

 目的 探讨干细胞相关基因Oct4与Wnt/β-catenin 及TGF-β信号通路在肝癌细胞系中的相互作用。方法 应用RT PCR法检测Oct4、Wnt/β-catenin及TGF-β信号通路相关基因β-catenin、Wnt10b、TCF3及 ELF、Smad3和 Smad4在肝癌组织及细胞系中的表达;使用siRNA 沉默人肝癌HepG2细胞Oct4和TCF3的表达,实时荧光定量RT PCR法检测Wnt10b、β-catenin、 TCF3及 ELF、Smad3和 Smad4等基因的表达变化。结果 Oct4和β catenin、Wnt10b、TCF3及 ELF、Smad3和 Smad4在肝癌组织及细胞系中同时表达; siRNA-Oct4 沉默人肝癌HepG2细胞Oct4后,Oct4表达明显下调,β-catenin、Wnt10b随之下调达40%~50%左右,而TCF3表达升高到3倍左右;同时ELF、Smad3和 Smad4均下降到原来的1%以下;而siRNA-TCF3 沉默TCF3后,Oct4的表达也升高2~3倍;ELF升高亦达2~3倍,Smad3和 Smad4也略有升高。结论 Oct4和β-catenin、Wnt10b、TCF3及 ELF、Smad3和 Smad4在肝癌组织及细胞系中同时表达提示彼此之间有相互作用。RNAi实验证明Oct4对Wnt/β-catenin及TGF-β信号通路的成员有调控作用;Oct4 与TCF3之间的负反馈作用值得深入研究。     

小干扰RNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达

目的:以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对宫颈癌Hela细胞株HPV18基因组中恶性转化基因E6、E7的抑制作用及对细胞内P53蛋白表达的影响。方法:实验分细胞培养液阴性对照组(阴性对照组),无关序列siRNA对照组(无关序列对照组)及转染HPV18 E6-siRNA实验组(siRNA实验组)。设计并合成HPV18 E6-siRNA及无关序列siRNA,转染Hela细胞后,RT-PCR检测转染后48、120 h细胞内HPV18E6、E7mRNA的变化,Western blotting检测转染后48 h细胞内HPV18 E7和P53蛋白的变化。结果:siRNA转染Hela细胞的效率约为85%。siRNA转染后48 h,实验组细胞内HPV18E6、E7mRNA及E7蛋白含量降低,其含量分别为阴性对照组的33.33%、36.78%及33.84%;实验组细胞内P53蛋白含量增加,其含量为阴性对照组的2.194倍。siRNA转染后120 h,实验组细胞HPV18E6、E7mRNA含量恢复为阴性对照组的90.91%、101.60%。结论:HPV18 E6-siRNA体外能明显抑制宫颈癌Hela细胞HPV18E6、E7基因的表达,增加细胞内肿瘤抑制因子P53蛋白的水平。     

RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因对细胞生物学特点的影响

目的:通过RNA干扰技术沉默宫颈癌Hela细胞中的Survivin基因,观察干扰后核酸表达及细胞凋亡情况发生的变化,为进行宫颈癌的基因治疗提供理论依据.方法:设定空白组、阴性对照组及实验组,空白组Hela细胞未进行基因干扰,阴性对照组为非特异序列干扰,实验组为针对Survivin基因设计的干扰RNA(siRNA)干扰,每组均设三个平行标本.转染后48h收集细胞,RT-PCR技术检测Survivin mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果:转染siRNA 48h后,Hela细胞中Survivin mRNA拷贝数明显减少,实验组mRNA表达量为空白组的23.4％,存在显著性差别(P＜0.01);为阴性对照组的23.3％,存在显著性差别(P＜0.01).流式细胞术检测结果表明,实验组Hela细胞凋亡率是空白组的3.08倍(P＜0.01);是阴性对照组的2.69倍(P＜0.01),均有显著性差异.结论:通过RNA干扰沉默宫颈癌Hela细胞Survivin基因能够促进细胞凋亡的发生,Survivin可能成为基因治疗宫颈癌的理想靶基因.     

RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对ECV304细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨利用RNA干扰技术下调Smad4基因表达对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响，初步了解Smad4在血管生成中的作用。方法：设计并合成靶向人Smad4基因的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）片段siRNA1和siRNA2，脂质体介导转染入人脐静脉内皮细胞株ECV304。应用实时定量RT-PCR和Western印迹法检测转染前后Smad4基因表达水平；应用细胞周期分析和羧乙基锗倍半氧化物（6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）－流式细胞仪检测ECV304细胞转染前后细胞增殖能力的变化；通过单层细胞划痕实验观察细胞转染前后迁移能力的变化。结果：从2条siRNA中成功筛选出1条siRNA，于RNA和蛋白水平可明显下调Smad4基因的表达；ECV304细胞转染Smad4的siRNA后，细胞的增殖和迂移能力明显增强。结论：利用RNA干扰技术能够筛选出高效的特异阻断Smad4基因表达的siRNA；Smad4基因表达下调能够明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移。     

调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响

目的:探究调控TGF-β1/Smad4通路对宫颈癌SiHa细胞自噬基因LC3的影响。方法:取对数生长期的宫颈癌SiHa细胞加入不同浓度的TGF-β1和SIS3干预24小时后收取细胞,采用实时荧光定量PCR法及免疫印迹法检测自噬基因LC3在mRNA水平及蛋白水平上的表达量变化。结果:不同浓度的TGF-β1作用SiHa细胞24小时后,随TGF-β1浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐增高（P＜0.05）。不同浓度的SIS3作用SiHa细胞24小时后,随SIS3浓度升高,LC3 mRNA及蛋白的表达量逐渐降低（P＜0.05）。结论:外源性的TGF-β1/Smad4通路激活剂TGF-β1可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量升高,诱导宫颈癌SiHa细胞发生自噬;外源性的TGF-β1/Smad4通路抑制剂SIS3可使宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白表达量降低,抑制宫颈癌SiHa细胞发生自噬;且随TGF-β1和SIS3浓度的增加,LC3的表达量出现变化,具有一定的浓度依赖性。     

HPV16E7基因沉默对宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响

[目的]探讨脂质体转染HPVl6E7siRNA对人宫颈癌CaSki细胞增殖的影响。[方法]人工合成抑制HPVl6E7基因的siRNA片段,通过脂质体转染到CaSki细胞内,显微镜下观察其形态学变化;流式细胞术检测各组细胞周期变化;RT-PCR检测HPVl6E7mRNA的表达;Westernblot检测HPVl6E7蛋白表达。[结果]转染siRNA后的CaSki细胞,细胞增殖受到显著抑制．HPVl6E7mRNA表达显著下降,HPVl6E7蛋白水平显著下降。[结论]应用RNA干扰靶向抑制HPVl6E7基因可以显著抑制CaSki细胞增殖。     

慢病毒介导Stathmin-1基因沉默对宫颈Hela细胞p53蛋白的影响

[目的]研究宫颈癌Hela细胞中Stathmin-1表达对p53蛋白的影响及对细胞增殖的作用。[方法]构建Stathmin-1 siRNA慢病毒载体,包装重组慢病毒,感染宫颈癌Hela细胞株,沉默Stathmin-1表达为干扰组,采用导入阴性片段的慢病毒感染Hela细胞作为对照组。MTT法检测细胞增殖,蛋白印迹法(Western-blot)检测细胞p53蛋白的表达。[结果 ]感染重组慢病毒及阴性病毒后,Stathmin-1基因干扰组Hela细胞增殖24h后较对照组抑制明显(P<0.05)。与对照组相比,干扰组中p53蛋白表达明显减少(P<0.05)。[结论]宫颈癌Hela细胞中Stathmin-1影响p53蛋白表达,沉默Stathmin-1可抑制细胞增殖。     

ANRIL对胃癌细胞增殖的影响

目的:研究在胃癌细胞系SGC-7901中，ANRIL对其增殖的影响，并探讨该作用是否与TGF-β/Smad通路相关。方法:采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术对SGC-7901细胞中的ANRIL基因、TGF-β1基因分别进行干预，并对ANRIL基因及TGF-β1基因进行联合干预；应用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测各实验组中细胞增殖能力的变化；采用Western blot法检测各实验组中TGF-β1蛋白和p-Smad蛋白的表达情况。结果:胃癌细胞系SGC-7901经转染24 h、48 h后，siANRIL组OD值明显低于NC组、MOCK组及BLANK组（P＜0.05）。siANRIL＋siTGF-β1组、siTGF-β1组OD值高于NC组、MOCK组及BLANK组（P＜0.05）。siANRIL＋siTGF-β1组OD值介于siANRIL组与siTGF-β1组之间（P＜0.05）。siANRIL组TGF-β1蛋白和p-Smad蛋白的表达高于NC组、MOCK组及BLANK组（P＜0.05）。在siTGF-β1组及siANRIL＋siTGF-β1组中TGF-β1蛋白和p-Smad蛋白的表达低于NC组、MOCK组及BLANK组（P＜0.05）。siANRIL＋siTGF-β1组TGF-β1蛋白和p-Smad蛋白的表达介于siANRIL组与siTGF-β1组之间（P＜0.05）。结论:在胃癌细胞系SGC-7901中，ANRIL对其细胞增殖发挥促进作用，且ANRIL可能是通过TGF-β/Smad信号传导通路发挥促进作用的。     

在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF-β1对Smad7表达的调节

背景与目的:细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF-β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因.方法:培养BEP2D细胞及BERP35T-2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF-β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF-β1的细胞组作为对照,用Northernblot杂交比较两组细胞Smad7mRNA表达的差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性.同时提取BEP2D及BERP35T-2细胞蛋白,用Westernblot方法比较两组细胞内源性TGF-β1表达的差异.结果:Smad7mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF-β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7mRNA表达增高,BERP35T-2细胞表达水平改变不明显.而内源性TGF-β1的表达水平,BERP35T-2细胞稍高于BEP2D细胞.结论:Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF-β1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一.     

沉默Ku86基因对Hela细胞放射敏感性影响

目的 探讨siRNA沉默Ku86基因表达对宫颈癌Hela细胞放射敏感性的影响。方法 X射线照射后采用qRT-PCR、蛋白印迹法检测Ku86基因在Hela细胞中的表达水平,利用siRNA沉默Ku86基因表达。将si-NC、si-KU86转染到宫颈癌Hela细胞中,0、2、4、6、8、10 GyX射线照射。CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,克隆形成实验分析转染前后细胞放射敏感性变化,检测p53、Caspase-8表达分析沉默Ku86基因表达对放射诱导的细胞凋亡影响。结果 X线照射后Ku86 mRNA和蛋白表达水平上调,沉默Ku86表达降低了Hela细胞的增殖能力和克隆形成能力,放射增敏比为1.57。沉默Ku86表达上调了p53和Caspase-8表达,细胞凋亡增加。结论 siRNA沉默Ku86表达提高了宫颈癌Hela细胞的放射敏感性。     

NDRG2 siRNA对宫颈癌Hela细胞顺铂化疗敏感性影响的研究

目的：探讨人源N-myc下游调节基因2（N-Myc downstream-regulated gene 2,NDRG2）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对宫颈癌Hela细胞的化疗增敏作用。方法：利用化学合成的针对NDRG2特异性siRNA借助脂质体转染宫颈癌Hela细胞。采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测NDRG2mRNA和蛋白在宫颈癌Hela细胞的表达情况。通过MTT法检测该细胞在顺铂作用下的体外存活率。结果：化学合成的NDRG2特异性siRNA oligomer可使Hela细胞的NDRG2表达水平明显降低,增强了顺铂对Hela细胞体外生存的抑制能力。转染Negative-control oligomer的Hela细胞与转染NDRG2siRNA oligomer HSS126269的Hela细胞相比,其存活情况出现明显差异,IC50值分别为（6.69±0.33）和（1.69±0.25）μg/L,差异有统计学意义,t=17.311,P=0.003。结论：抑制NDRG2表达可以提高宫颈癌Hela细胞对顺铂的化疗敏感性,具有一定的临床应用前景。     

Bmi-1 shRNA对膀胱癌5637细胞的侵袭和转移抑制及其机制

目的:探讨特异性抑制Bmi-1基因表达对膀胱癌5637细胞侵袭和转移的影响.方法:将Bmi-1短发夹RNA(shRNA)真核表达载体、脂质体转染膀胱癌5637细胞.Transwell侵袭实验和细胞划痕实验观察Bmi-1 shRNA对膀胱癌5637细胞侵袭和转移的影响.RT-PCR方法检测Bmi-1shRNA对基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA表达的影响.蛋白质印迹法检测Bmi-1 shRNA对E-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.结果:Transwell侵袭实验结果显示,实验组细胞的穿膜细胞数为78.0±5.8,空质粒组为158.0±6.7,未转染组为153.0±4.6.细胞划痕实验结果显示,实验组细胞迁移能力明显降低,P＜0.05.RT-PCR结果显示,与不加转化生长因子-β(TGF-β1)组相比,TGF-β1作用后,未转染组和空质粒组中MMP-2表达明显升高,P＜0.05.蛋白质印迹结果显示,与不加TGF-β1组相比,TGF-β1作用后,未转染组和空质粒组中E-cadherin表达明显降低,α-SMA表达明显升高,P＜0.05.结论:Bmi-1 shRNA可以抑制膀胱癌5637细胞侵袭和转移,其机制是通过阻断TGF-β1促进肿瘤细胞侵袭和转移作用完成的.     

Smad7基因过表达的促增殖作用机制探讨

目的 研究Smad7过表达使人支气管上皮细胞系增殖能力增强的机制。方法 用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo同携带有报告基因碱性磷酸酶的c-myc顺式增强子元件pMyc-SEAP共转染,检测Smad7基因对增殖信号通路的影响。用RT-PCR方法,检测稳定转染Smad7基因前后永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系BEP2D和BERF35T2细胞内c-myc、p15、p21表达水平的变化,调查Smad7基因对TGF-β介导的抗增殖基因反应的调控。结果 报告基因检测结果表明,Smad7基因可使参与增殖信号通路的c-myc顺式增强子元件活性增强。RT-PCR结果表明,在稳定转染Smad7基因的细胞中,c-myc表达上调,p15表达降低,对TGV-β刺激的应答丧失,p21表达降低。结论 Smad7基因可通过调控TGF-β介导的抗增殖基因应答来影响细胞的生长、增殖能力。     

沉默p53的表达对妇科肿瘤细胞系中STAT3的表达影响

[目的]通过siRNA干扰序列沉默p53蛋白的表达,以探讨p53蛋白表达水平的变化对宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、CasKi)、卵巢癌细胞系(HO8910、OVR3)以及子宫内膜癌细胞系HEC-1-A中核转录因子STAT3蛋白的表达影响。[方法]将p53siRNA及阴性对照siRNA通过脂质体分别转染入HeLa、SiHa、CasKi、HO8910、OVR3、HEC-1-A细胞48h后,通过WesternBlot检测STAT3、p-STAT3的表达情况。[结果]通过siRNA沉默上述细胞p53的表达后,发现在HeLa、HO8910以及HEC-1-A中STAT3和p-STAT3的表达明显升高(P<0.05),而在Si-Ha、CasKi以及OVR3细胞中STAT3和p-STAT3的表达无明显变化(P>0.05)。[结论]p53对STAT3的表达调控作用在不同的妇科肿瘤细胞系中作用机制不同。     

TIZ基因mRNA在卵巢癌细胞系中的表达及其RNA干扰载体构建

目的检测卵巢癌细胞株中TIZ基因的mRNA表达水平,并构建TIZ基因的特异性RNA干扰（RNAi）载体。方法通过RT-PCR方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、SKOV3顺铂耐药细胞、SKOV3卡铂耐药细胞、A2780、A2780卡铂耐药细胞、H08910）中TIZmRNA的表达;根据Genebank上TIZ的mRNA序列,设计5对siRNA干扰片段,采用脂质体转染法介导siRNA干扰片段并下调卵巢癌细胞系中TIZmRNA的表达。采用pTG19-T质粒构建TIZ和β-actintmRNA表达重组质粒并制备其标准品。采用实时定量PCR（QRT—PCR）检测siRNA干扰片段对TIZ基因的下降效率,并筛选最佳siRNA干扰片段。以pGPU6／GFP／Neo载体和质粒DNA测序方法构建pGPU6／GFP／Neo-siRNA—TIZ-573重组质粒。结果①除卵巢癌细胞H08910细胞无TIZ基因mRNA表达外,其余细胞均有TIZ基因mRNA表达。②细胞siRNA干扰片段筛选结果显示介导TIZ-573片段后可下调60％细胞TIZmRNA表达。③成功构建了TIZ基因RNAi载体pG-PU6／GFP／Neo-TIZ-573。结论多数卵巢癌细胞系表达TIZmRNA。siRNA-TIZ-573为最佳下调细胞TIZmRNA片段。构建的pGPU6／GFP／Neo-TIZ-573重组质粒可用于下一步的实验研究。     

血管内皮生长因子受体-3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究

目的研究血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法用基因重组方法构建人反义VEGFR-3基因真核表达载体,用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用WesternBlot分析转染前后细胞中VEGFR-3蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果转染反义VEGFR-3质粒后,Hela细胞VEGFR-3的蛋白表达水平明显下降,细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论抑制VEGFR-3的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡,VEGFR-3可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。     

RNA干扰抑制Skp2表达对人喉癌细胞系Hep-2的影响

[目的]研究RNA干扰抑制Skp2表达对喉癌鳞状细胞p27表达、细胞增殖和凋亡的作用.[方法]利用脂质体将重组质粒转染Hep-2细胞,用慢病毒系统建立干扰Skp2基团的稳定细胞株;荧光实时定量PCR和Western blot法检测转染细胞株中Skp2和p27mRNA及其蛋白表达;采用MTr法和流式细胞仪检测转染细胞的增殖和凋亡情况.[结果]通过慢病毒siRNA技术,Skp2可持续稳定抑制Hep2喉癌细胞,siRNA可诱导抑制Skp2,增加p27表达,降低细胞增殖,增加喉癌细胞的凋亡.[结论]靶向Skp2基因的siRNA对Hep-2细胞的抑制作用可能是通过上调p27基因水平来实现的,Skp2是基因疗法治疗喉癌的有利靶点.