膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义的研究

目的:探讨膀胱移行细胞癌(BTCC)患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测42例BTCC患者、40例对照者尿脱落细胞中MUC7的mRNA表达,β-actin作为内参照.结果:40例对照组中有2例MUC7 mRNA表达阳性,阳性率为5.0%;42例BTCC患者中36例尿脱落细胞中MUC7 mRNA表达阳性,阳性率为85.7%,其诊断特异性为95%.不同临床分期尿脱落细胞中MUC7 mRNA的阳性表达率:Ta-T1期为64.3%(9/14),T2-4期为96.4%(27/28).浸润性BTCCMUC7的阳性表达率显著高于浅表性BTCC(P＜0.05).不同病理分级BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的mRNA的阳性表达率为G158.3%(7/12),G2 93.8%(15/16),G3 100%(14/14).MUC7mRNA的表达与BTCC的病理分级呈正相关.MUC7诊断BTCC的阳性预测值为94.7%,阴性预测值为86.3%.结论:BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率明显高于对照组.尿脱落细胞中MUC7表达与临床分期、病理分级呈正相关.采用RT-PCR法检测尿脱落细胞中MUC7表达诊断BTCC的敏感性和特异性好、阳性预测值高,特别对T2-4期肿瘤的诊断敏感性好.     

膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义的研究

目的:探讨膀胱移行细胞癌(BTCC)患者尿脱落细胞中MUC7的表达及其临床意义。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测42例BTCC患者、40例对照者尿脱落细胞中MUC7的mRNA表达,β-actin作为内参照。结果:40例对照组中有2例MUC7 mRNA表达阳性,阳性率为5．0％;42例BTCC患者中36例尿脱落细胞中MUC7 mRNA表达阳性,阳性率为85．7％,其诊断特异性为95％。不同临床分期尿脱落细胞中MUC7 mRNA 的阳性表达率:Ta-T1期为64．3％(9／14),T2-4期为96．4％(27／28)。浸润性BTCC MUC7的阳性表达率显著高于浅表性BTEC(P<0．05)。不同病理分级BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的mRNA的阳性表达率为C1 58．3％(7／ 12),C2 93．8％(15／16),G3 100％(14／14)。MUC7 mRNA的表达与BTCC的病理分级呈正相关。MUC7诊断BTCC 的阳性预测值为94．7％,阴性预测值为86．3％。结论:BTCC患者尿脱落细胞中MUC7的阳性表达率明显高于对照组。尿脱落细胞中MUC7表达与临床分期、病理分级呈正相关。采用RT-PCR法检测尿脱落细胞中MUC7表达诊断BTCC的敏感性和特异性好、阳性预测值高,特别对T2-4期肿瘤的诊断敏感性好。     

宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响

背景与目的：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31,STK31)基因在人类多种癌症中扮演重要角色,且STK31基因的表达受其启动子及第一外显子区甲基化状态的影响;病毒感染与肿瘤组织中某些抑癌基因启动子区高甲基化有关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响,以及不同种类甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潜在作用。方法：构建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表达慢病毒,分别感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)阴性宫颈癌细胞系HT-3及C33A,获得稳定转染的细胞系;采用亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)和甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)检测3种HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C33A转染前后STK31基因的甲基化状态;RT-PCR及蛋白［质］印迹法(Western blot)检测上述宫颈癌细胞系中STK31基因的表达以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16转染前后宫颈癌细胞系及HPV阳性、HPV阴性宫颈癌组织中的表达情况。结果：外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV阴性宫颈癌细胞系中稳定表达。3种HPV阳性细胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达阳性;2种HPV阴性细胞系HT-3、C33A中STK31基因则表现为高甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达缺失;与未感染慢病毒HT-3和C33A细胞系比较,外源性HPV16 E7以及E6/E7表达的HT-3和C33A细胞系STK31基因甲基化程度降低,其mRNA及蛋白质重新表达。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA水平分别高于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(P<0.001)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16阳性宫颈癌组织中的表达高于其在HPV阴性宫颈癌组织中的表达,差异有统计学意义(t=5.997,P<0.001;t=6.743,P<0.001;t=7.926,P<0.001)。DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA表达水平分别低于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(t=7.451,P<0.001;t=2.451,P<0.05);DNMT2基因转录水平在HPV16阳性宫颈癌组织中低于HPV阴性宫颈癌组织(t=9.134,P<0.001)。DNMT3LmRNA表达水平在宫颈癌细胞系转染前后及HPV阴阳性宫颈癌组织中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：HPV感染可导致STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态降低,低甲基化状态促进该基因表达。STK31基因的表达受其启动子及第1外显子区甲基化状态的调控。HPV16 E7、E6/E7基因可能通过影响DNMT2的表达参与调控癌基因STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态。     

新疆维吾尔族妇女子宫颈癌DBC1基因启动子甲基化分析

背景与目的：近年来,表观遗传学研究已经成为癌症研究的一个新方向。大量研究结果显示,表观遗传修饰的异常改变与癌症有着十分密切的联系,全基因组范围内的表观遗传修饰改变已经成为癌症的新标志。该研究旨在探讨膀胱癌缺失基因1(deleted in bladder cancer 1,DBC1)启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的关系及与人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染的相关性,分析其能否作为高敏感性及特异性的工具用于子宫颈癌筛选。方法：用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对43例正常子宫颈组织、35例子宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织以及54例子宫颈癌组织进行HPV16、HPV18感染的检测;运用甲基化特异性PCR方法检测上述组织DBC1基因启动子甲基化状况;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)方法检测10例甲基化阴性的正常子宫颈组织和10例甲基化阳性的子宫颈癌组织中DBC1基因mRNA表达情况。结果：正常子宫颈组织、CIN组织及子宫颈癌组织中HPV16的感染率分别为18.6%、34.3%和68.5%;HPV18的感染率分别为2.3%、8.6%和16.7%;DBC1基因发生甲基化率分别为23.3%、40.0%和87.0%;在79例高级别宫颈损伤及子宫颈癌样本中,其中50例HPV16/18感染阳性,29例HPV16/18感染阴性;阳性组中DBC1基因发生甲基化率88.0%,阴性组甲基化率为55.2%(P<0.05);10例甲基化阳性子宫颈癌组织中DBC1基因mRNA表达水平明显低于10例甲基化阴性正常子宫颈组织(P<0.05)。结论：DBC1基因甲基化可能作为新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的分子标志物,结合HPV16/18感染检测有助于子宫颈癌的诊断。     

宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态的研究

背景与目的：抑癌基因Ras相关区域家族1A (Ras association domain family 1A,RASSF1A)启动子及第1外显子区CG位点高甲基化导致该基因沉默与多种恶性肿瘤的发生发展相关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态以及甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine,5-Aza-dc)作用对RASSFIA基因表达的影响。方法：采用5 μmol/L(低浓度)和10 μmol/L(高浓度)的5-Aza-dc作用于HeLa、Caski、HT-3以及C-33A等4种宫颈癌细胞系,分别采用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR,MSP)和亚硫酸盐基因组测序法(bisulfite genome sequencing,BGS)检测5-Aza-dc处理前后RASSF1A基因启动子及第1外显子区甲基化状态,RT-PCR检测干预前后RASSF1A基因mRNA的转录表达。结果：HeLa和Caski两种HPV阳性细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区均呈低甲基化状态,mRNA表达阳性。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后,mRNA表达未见明显改变(F_HeLa=3.003,P=0.125;F_Caski=0.045,P=0.956)。HT-3和C-33A两种HPV阴性宫颈癌细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区则表现为高度甲基化状态,mRNA表达受到抑制。低浓度和高浓度5-Aza-dc作用后,HT-3和C-33A细胞系RASSF1A基因启动子及第1外显子区CG位点甲基化程度降低,检测到其mRNA表达,高浓度5-Aza-dc作用组表达水平明显高于低浓度组和细胞对照组(F_HT-3=18.002,P=0.03;F_C-33A=17.179,P=0.03),LSD-t检验显示差异有统计学意义(P<0.05)。结论：HPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞系中RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态不同;RASSF1A基因启动子及第1外显子区的高甲基化可抑制该基因表达;5-Aza-dc处理可使RASSF1A基因启动子及第1外显子区去甲基化,重新激活基因的表达,这种作用在一定范围内有剂量依赖性。     

TMS1/ASC基因CpG岛甲基化与膀胱移行细胞癌发生的关系

目的检测抑癌基因TMS1/ASC启动子区5′CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌（BTCC）中mRNA和蛋白表达水平。方法应用MSP技术检测膀胱移行细胞癌中TMS1/ASC基因启动子区甲基化状态,RT-PCR和Western blot法分别检测其mRNA和蛋白表达水平。结果TMS1/ASC基因在正常膀胱组织中未发生甲基化,而在癌组织中甲基化频率为46.9%（15/32）,并且随着肿瘤分级、分期的增加,其甲基化水平逐渐升高（χ^2=23.106,P〈0.05）。在15例启动子异常甲基化的BTCC标本中,14例同时伴有TMS1/ASC基因表达缺失或下调,两者存在明显的相关性（γ=0.5842,P〈0.05）。TMS1/ASC mRNA和蛋白表达在正常膀胱组织和BTCC组织中分别为81.3%（26/32）、18.8%（6/32）（P〈0.01）,不同病理分级、临床分期间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论TMS1/ASC基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活,使其mRNA和蛋白表达减少,甚至缺失,这可能是膀胱癌发生、发展的原因之一。     

MAGE-A1 和MAGE-A3在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义

[摘要] 目的：探讨黑色素瘤抗原基因-A1（MAGE-A1）和MAGE-A3 在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法：选取2006 年1 月至2010 年1 月河北医科大学第四医院神经外科手术切除的78 例脑胶质瘤组织标本和15 例车祸死亡捐献者的正常脑组织标本。用RT-PCR法检测胶质瘤组织中MAGE-A1 和MAGE-A3 的表达,分析其表达水平与患者预后的关系;用MSP-PCR术检测MAGE-A1 和MAGE-A3 基因启动子区的甲基化状态,分析两者表达与甲基化之间的关系;用RT-PCR法检测胶质瘤U251 和U87 细胞中MAGE-A1 和MAGE-A3 表达以及经DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2''-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）联合作用后两者的表达水平。结果：78 例胶质瘤组织中MAGE-A1 和MAGE-A3 mRNA阳性表达率分别为65.34%和38.46%,而在15 例正常脑组织中未发现2 种mRNA表达。MAGE-A1 阳性组患者5 年生存率较阴性组低（P<0.05）。MAGE-A1 和MAGE-A3 基因启动子区去甲基化水平与其在mRNA水平上的表达均有显著的相关性（均P<0.01）。未经5-Aza-CdR 和TSA处理的U87 细胞未见MAGE-A1 和MAGE-A3 mRNA的表达,U251 细胞则有少量表达。单独给予TSA不能引起MAGE-A1 和MAGE-A3 基因的表达激活,单独给予5-Aza-CdR 或与TSA合用可以引起该2 个基因的表达激活,且两者合用的作用优于单独给药。结论：脑胶质瘤组织中有不同程度的MAGE-A1 和MAGE-A3 基因表达,MAGE-A1 基因表达与患者的预后不良相关。DNA启动子区甲基化和组蛋白乙酰化是MAGE-A1和MAGE-A3基因表达激活的重要机制。     

MAGE-A3基因及其产物在肾透明细胞癌组织中的表达

目的:探讨肿瘤特异性黑色素瘤抗原(MAGE-A3)基因mRNA及MAGE-A3蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达及其临床意义.方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测45例肾透明细胞癌患者癌组织(新鲜标本,T1期14例,T2期12例,T3期11例,T4期8例;G1 18例,G2 15例,G3 12例)及其中10例患者癌旁组织MAGE-A3基因mRNA表达;Western-blot技术检测上述组织中MAGE-A3蛋白的表达.结果:45例肾透明细胞癌组织中,24例(53%)MAGE-A3 mRNA表达阳性,10例癌旁组织表达均阴性;21例(47%)MAGE-A3蛋白表达阳性,10例癌旁组织表达均阴性.肿瘤不同分期、不同分级之间MAGE-A3基因mRNA及MAGE-A3蛋白表达的差异均无统计学意义(Pearson χ2 检验法,P> 0.05).结论:MAGE-A3基因在肾透明细胞癌中有较高表达,可望成为肾透明细胞癌特异性免疫治疗的靶基因.     

CAGE? MAGE-A1和MAGE-A3去甲基化在胃癌发生发展中的作用

探讨肿瘤相关抗原基因（CAGE）、黑色素瘤抗原基因-A1（MAGE-A1）和黑色素瘤抗原基因-A3（MAGE-A3）启动子区去甲基化状态改变在胃癌早期发生、发展中的作用及意义。方法:87例内镜活检标本分为胃癌组、癌前病变组和正常对照组,应用甲基化特异性PCR方法分别检测各组中3种基因启动子区的去甲基化状态。结果:胃癌组、癌前病变组和正常对照组中,各基因启动子区的去甲基化阳性率分别为:CAGE:80.0%（24/30）、37.5%（12/32）和4.0%（1/25）;MAGE-A1:60.0%（18/30）、21.9%（7/32）和0（0/25）;MAGE-A3:46.7%（14/30）、12.5%（4/32）和8.0%（2/25）,呈下降趋势。3种基因启动子区去甲基化阳性率在3组间比较,差异有统计学意义（P<0.05）。30例胃癌至少发生1种基因启动子区去甲基化的有27例;至少发生2种基因启动子区去甲基化23例;7例同时发生了3种基因启动子区的去甲基化。结论:这3种基因启动子区去甲基化改变可能发生于胃癌发病早期,且贯穿于胃癌发生、发展的全过程并起到一定的作用,联合检测可能有助于提高胃癌去甲基化诊断的阳性率。      

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及DNA甲基化的影响

背景与目的:顺铂能造成细胞内DNA的损伤,而DNA错配修复蛋白能发现顺铂导致的DNA损伤,产生损伤信号,诱导细胞凋亡,从而摧毁肿瘤细胞.hMLH1是DNA错配修复系统的一个重要成员,其缺失能导致肿瘤对顺铂的耐受.本研究目的在于探讨卵巢癌顺铂耐药细胞中hMLH1表达及其基因启动子区DNA甲基化状态,同时探讨去甲基化制剂——5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对hMLH1表达及DNA甲基化的逆转作用.方法:应用5-Aza-dC和TSA作用于卵巢癌细胞COC1与其顺铂耐药细胞COC1/DDP,应用甲基化特异性PCR、RT-PCR和Western blot检测上述两种细胞中hMLH1基因启动子区DNA甲基化、hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的变化.MTT法检测药物对细胞增殖的影响.结果:COC1细胞存在hMLH1 mRNA和蛋白的表达,其启动子区域表现为DNA非甲基化.单独应用5-Aza-dC、TSA及联合应用5-Aza-dC和TSA对COC1细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05),细胞形态变化不明显.COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白表达缺失,启动子区域表现为DNA甲基化.5-Aza-dC不但能使COC1/DDP细胞中hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且能使表达缺失的hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白重新表达.TSA对COC1/DDP细胞中hMLH1 mRNA、hMLH1蛋白表达和DNA甲基化均没有影响(P>0.05).联合应用5-Aza-dC和TSA不但能使hMLH1基因发生DNA去甲基化,而且与单独应用5-Aza-dC相比较,对hMLH1 mRNA和hMLH1蛋白表达的影响更明显(P<0.05).5-Aza-dC单用及联合应用TSA对COC1/DDP细胞生长抑制率明显高于COC1组、阴性对照组(P<0.05).结论:COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性与hMLH1mRNA和蛋白的表达缺失有关,而hMLH1基因和蛋白的表达缺失与其基因启动子区DNA甲基化相关,5-Aza-dC单用及联合TSA使hMLH1基因发生DNA去甲基化,促进hMLH1的表达,逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性.