转染骨形态发生蛋白-2基因的人脐带间充质干细胞成骨研究

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染人脐带间充质干细胞(hUCMSC)对其成骨分化和体内异位成骨的影响.方法 实验分为3组,空白组:10％胎牛血清+ DMEM培养基,对照组:10％胎牛血清+DMEM培养基+空慢病毒载体转染,实验组:10％胎牛血清+DMEM培养基+BMP-2+增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染,检测3组不同培养基培养后人脐带间充质细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性变化,蛋白印迹法检测骨桥蛋白(OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、BMP-2的蛋白表达变化.yon kossa染色观察hUCMSC钙结节形成.大鼠肌袋内植入BMP-2转染hUCMSC/COL1,通过CT三维重建及苏木素-伊红(HE)染色观察其体内成骨能力.结果 hUCMSC BMP-2转染良好,转染率可达到(90.95±4.35)％,实验组细胞在第5天,ALP活性就由(26.492 ±7.105) U/g·蛋白增加至(38.625±11.592) U/g·蛋白,在第14天,实验组的ALP的活性可以高达(49.732±13.068) U/g·蛋白,对比空白组和对照组都有明显增加(P＜0.05).对比空白组和对照组,实验组COL1、BMP-2和OPN蛋白呈现高表达(P＜0.05).转染BMP-2基因后,hUCMSC培养28 d可形成大量的钙结节.BMP-2转染hUCMSC/COL1在大鼠肌袋内可异位成骨.结论 转染BMP2基因可促进hUCMSC细胞成骨能力.     

人骨形态蛋白-2可调控系统在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建携带四环素真核诱导表达系统(Tet-on)调控的人骨形态发生蛋白2(h BMP-2)慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),为骨缺损修复提供可控的成骨活性细胞。方法设计目的基因h BMP-2引物,将扩增纯化的目的基因h BMP-2定向克隆至携带Tet-on的慢病毒GV347载体上并测序鉴定产物。h BMP-2-GV347质粒、空载的GV347质粒分别与辅助质粒共感染293T细胞以收获慢病毒浓缩液。用h BMP-2-GV347慢病毒转染大鼠BMSCs,得到h BMP-2阳性表达细胞,探索转染最佳感染复数(MOI)。用CCK8法比较BMSCs转染前后的增殖活性;强力霉素(DOX)诱导打开Tet-on,real-time PCR、Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况。结果 PCR后得到目的基因h BMP-2,定向克隆至携带Tet-on系统调控的GV347质粒上,经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的h BMP-2-GV347质粒。h BMP-2-GV347质粒与空载GV347质粒分别感染293T细胞后获得h BMP-2-GV347慢病毒浓缩液。在DOX诱导下,h BMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。h BMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9,且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强,并在DOX浓度为10μg/ml诱导下稳定表达BMP-2蛋白和RNA。结论本研究成功构建携带Tet-on系统调控h BMP-2慢病毒表达载体,转染BMSCs后在DOX调控下可持续高效表达BMP-2蛋白。     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05),与成骨诱导液处理组相当(P0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

BMP-2转染间充质干细胞上清对软骨的影响

[目的]观察从腺病毒-骨形态发生蛋白-2-绿色荧光蛋白(Ad-BMP-2-GFP)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)获取的含有BMP-2的上清对软骨细胞体外凋亡和体内再生的影响。[方法]通过Ad-BMP-2-GFP转染BMSCs使BMP-2高表达,采用冰冻干燥法浓缩BMSCs细胞上清至10倍浓度,过滤后-20℃储存备用。体外实验:加入IL-1β(18 ng/ml)建立软骨细胞体外炎症环境,施加转染后和未转染浓缩上清,并以PBS处理为空白对照组,流式细胞术检测各处理组软骨细胞凋亡水平。体内实验:20只雄性新西兰大白兔随机分为4组,除假手术组外,其他3组建立兔膝关节软骨缺损模型,分别注射等量的纯生理盐水、转染组和未转染的培养上清。6周后取材,通过大体标本和番红O固绿染色观察关节软骨缺损修复效果。[结果]体外实验显示,转染上清组的软骨细胞凋亡水平较未转染上清组和空白对照组明显减弱(P0.05);体内实验显示,转染上清组对软骨缺损修复效果优于未转染上清组和单纯生理盐水组。[结论]通过Ad-BMP-2-GFP转染BMSCs,获取含有BMP-2的上清可以抑制体外炎症环境下软骨细胞凋亡,促进体内软骨缺损修复。     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转基因干细胞构建组织工程骨的初步实验研究

目的 用转基因干细胞在体外构建组织工程骨.方法 用携带有人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的慢病毒感染骨髓基质干细胞(BMSCs)后接种于纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;RT-PCR、ELISA和Western-blot用于基因转染的表达检测;流式细胞仪检测细胞增殖;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况;ALP活性检测成骨能力.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;RT-PCR检测到BMP-2阳性表达,与实际值1191 bp基本一致;ELIISA检测24 h BMP-2蛋白含量为(148.2±21.6)pg/ml;流式细胞仪检测到细胞S期比例增加;ALP活性检测基因转染组明显强于对照组(P＜0.05);扫描电镜见细胞在nHAC/PLA支架上粘附生长良好;第8周时Western-blot仍可检测到BMP-2在相对分子质量26×103处出现阳性条带.结论 BMP-2基因可在BMSCs稳定表达并诱导其向成骨分化,与nHAC/PLA复合培养可用于组织工程骨构建.     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

骨形态发生蛋白-7基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响.方法 体外培养的新生大鼠心肌细胞分为3组:正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(HR组)培养的心肌细胞置于95%N2-5%CO2混合气体饱和的缺氧罐中缺氧2 h后,放回孵育箱中继续培养4 h;BMP-7基因转染组(BT组)将含pcDNA3.1-BMP-7基因的质粒在转染试剂作用下转染心肌细胞后72 h再行缺氧2 h,复氧4 h.每组重复8次.计数心肌细胞搏动次数,采用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性.倒置显微镜下观察心肌细胞形态.采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,免疫细胞化学方法测定Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 与c组相比,HR组和BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率增加,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05);与HR组相比,BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05).结论 BMP-7基因转染可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤,其机制可能与调控Bcl-2、Bax蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡有关.     

基因修饰细胞和成骨蛋白在脊柱融合中作用比浇

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导大鼠脊柱融合的能力,并与已广泛商品化使用的BMP-2蛋白比较.方法 分别将携带BMP-2和β-半乳糖苷酶的腺病毒转染BMSCs,在大鼠脊柱融合模型中建立5个实验组,每组8只,分别植入:Ⅰ组,5×106个BMP-2转染细胞;Ⅱ组,5×106个β-半乳糖苷酶转染细胞;Ⅲ组,10μgBMP-2蛋白;Ⅳ组,5×106个未转染细胞;Ⅴ组,单独的胶原海绵.8周后处死大鼠,进行各项观察.结果 手触力学评价显示Ⅰ、Ⅲ组全部达到骨性融合,而其他组均未融合.X线评分Ⅰ组(5.02)和Ⅲ组(4.21)也明显高于其他组.Micro-CT和组织学切片显示Ⅲ组的新骨骨量较少,骨小梁较细.结论 基因修饰的骨髓间充质干细胞能够很好地诱导脊柱融合,诱导效果要好于商品化的BMP-2蛋白.     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。     

Paxillin对骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的影响

目的 :探讨Paxillin对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核细胞分化的影响。方法 :取3周龄健康SD大鼠骨髓,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,传至第3代,用流式细胞仪对其表面标志分子进行鉴定。利用pc DNA3.1(-)/Myc-His B质粒构建真核表达载体pc DNA3.1-Paxillin。取第3代BMSCs分为3组:实验组,转染pc DNA3.1-Paxillin;阴性对照组,转染pc DNA3.1(-)/Myc-His B;空白对照组,不转染质粒。分别培养36h后,实验组和阴性对照经G418筛选,取3组BMSCs采用实时荧光定量PCR方法(q RT-PCR)检测各组Paxillin、蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原α1(collagen typeⅡα1,COL2α1)、性别决定区Y框蛋白9(sex determining region Y box protein 9,SOX9)、角蛋白19(keratin19,KRT19)、配对盒1(paired box 1,PAX1)和叉头蛋白(forkhead box F1,FOXF1)的m RNA表达量;免疫印迹法(Western blot)检测Paxillin、KRT19、PAX1和FOXF1蛋白表达水平。结果:BMSCs原代培养至第3代的细胞形态大体一致,呈长梭形,细胞连接紧密且均匀分布,CD44、CD90呈现高表达(95.6%和96.8%),CD45、CD11则呈现低表达(1.82%和2.16%)。实验组中Paxillin的m RNA和蛋白表达量较阴性对照组和空白对照组升高,差异具有显著性(P0.05);经G418筛选后的BMSCs和髓核细胞形态相似。实验组中COL2α1、SOX9、Aggrecan、KRT19、PAX1、FOXF1的m RNA表达量较阴性对照组和空白对照组显著性升高(P0.05);实验组KRT19、PAX1和FOXF1的蛋白表达量显著性高于阴性对照组和空白对照组(P0.05)。结论 :Paxillin可以促进BMSCs向类髓核细胞分化,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗提供基础。     

透明质酸水凝胶包封对携带BMP-2基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞增殖活性及其表达的影响

目的:探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后应用透明质酸水凝胶(hyaluronic acid hydrogel,HAH)包封对BMSCs增殖能力及其表达目标蛋白BMP-2的影响。方法:体外分离、提取、鉴定BMSCs,并将提前构建好的Ad-BMP-2转染BMSCs并使用HAH进行包封,激光共聚焦显微镜下观察Ad-BMP-2转染的BMSCs在HAH包封下的三维形态。实验分为4组(各组培养条件无差异):A组(未转染BMP-2的BMSCs);B组(HAH+未转染BMP-2的BMSCs);C组(转染BMP-2的BMSCs);D组(HAH+转染BMP-2的BMSCs)。分别一周内不同时相点(1d、2d、3d……7d)使用CCK-8法检测各组OD值来评价细胞增殖活性;ELISA法检测各组BMP-2的量(pg/ml)来评价目标蛋白的表达状况。结果 :激光共聚焦显微镜三维重建可观察到BMSCs可在HAH中任意平面铺展,有充足的生长空间。BMSCs的增殖活性检测显示,随着培养时间延长,细胞增殖活性逐渐增强,A组、C组4d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);B组和D组5d后的OD值较1d时明显增大(P0.05);至7d时,A组OD值为1.283±0.061,B组为1.844±0.075;C组为1.570±0.099;D组为1.976±0.142,包封HAH的B、D组OD值均优于没有包封HAH的A、C组(P0.05)。BMP-2的表达在A、B组较弱,不同时间点间无显著性差异(P0.05);C、D组的BMP-2表达各时间点均明显高于A、B组(P0.05);从4d时起,C、D两组的BMP-2表达显著增加(与1d时比较P0.05),且D组明显优于C组,差异有显著性(P0.05)。结论 :三维环境下(即包封HAH后),Ad-BMP-2转染的BMSCs不仅有较强的增殖活性;而且对BMP-2的表达具有一定的促进作用。     

miR-214通过对BMP-2和Smad4的靶向调控作用对骨质疏松的影响

目的探究miR-214能否靶向调控BMP-2和Smad4对骨质疏松症产生影响。方法将大鼠分为2组(假手术组、手术组),对手术组进行手术构建去卵巢骨质疏松模型,对两组大鼠血清中相关因子、骨密度、股骨进行病理学染色观察,同时将各组大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外培养,使用q PCR检测其miR-214表达水平,Western blot检测其BMP-2和Smad4相关蛋白表达水平。体外培养大鼠成骨细胞,将细胞分为3组(对照组、过表达组和抑制组),向过表达组和抑制组分别转染miR-214 mimics及anti-miR-214,对各组大鼠成骨细胞的增殖能力、细胞凋亡情况和BMP-2和Smad4相关蛋白表达水平进行检测。结果与假手术组相比,手术组大鼠血钙、碱性磷酸酶(ALP)水平及骨密度(BMD)明显下降,血磷水平明显上升,差异具有统计学意义(P0.05)。两组大鼠的BMSCs增长速率相比差异无统计学意义(P0.05),同时假手术组大鼠BMSCs ALP水平显著高于手术组,差异具有统计学意义(P0.05)。手术组与假手术组的BMSCs相比较,细胞中miR-214表达明显上升,BMP-2及Smad4表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。对转染后各组大鼠成骨细胞检测,与对照组相比,过表达组细胞增殖能力明显下降,细胞凋亡情况显著增高,BMP-2及Smad4水平下降,抑制组细胞增殖能力显著升高,细胞凋亡数量明显下调,BMP-2及Smad4表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 miR-214可能通过靶向调控BMP-2与Smad4抑制成骨细胞的增殖,从而发生或发展成骨质疏松症。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白-7基因的干细胞用于组织工程骨构建的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),观察其成骨分化,并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨的可行性.方法 实验分4组:BMP-7和eGFI基因转染组(A组)、eGFP基因转染组(B组)、常规成骨诱导组(C组)、未转染组(D组).用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达,判断转染效率;以逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、ELISA检测目的基因表达,四唑盐(MTT)实验检测细胞活力,碱性磷酸酶(ALP)活性和Gomori染色榆测成骨情况;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%.RTPCR检测到A组在1300 bp处出现特异性条带,其他组结果阴性;ELISA检测24 h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/mL,种植支架复合培养8周后BMP-7含量为(76.6±7.4)pg/mL;MTT实验显示细胞活性与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05);ALP活性以16 d最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后黏附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

Akt1基因转染对BMSCs缺氧耐受影响的实验研究

目的探讨重组慢病毒(lentivirus,LVs)介导Akt1基因转染大鼠BMSCs能否提高细胞缺氧耐受能力,为提高干细胞移植治疗心肌梗死效果提供理论依据。方法以LVs作为转染载体,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标记,构建携带Akt1基因的p LVX-EGFP-3FLAG病毒载体。取第3代3~5周龄SD大鼠BMSCs分别转染p LVX-EGFP空白病毒液(B组)和p LVX-EGFP-3FLAG病毒液(C组),以未转染病毒的BMSCs为空白对照组(A组)。转染后2~3 d荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,并于48 h时采用Western blot法检测B、C组Akt1蛋白表达情况。将B、C组培养的BMSCs分别置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱进行缺氧干预(分别为B1、C1组),取B1、C1组缺氧干预0、3、6、9、12 h的细胞以膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶双染法行流式细胞仪分析细胞凋亡率和死亡率、MTT法分析细胞增殖情况、Western blot法检测凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达情况。结果转染后A组荧光显微镜下未见绿色荧光表达,B、C组可见明显绿色荧光,转染效率约60%;Western blot可检测到B、C组Akt1表达,且C组Akt1表达明显高于B组(t=17.525,P=0.013)。B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高,差异有统计学意义(P0.05);C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3 h短暂下降,之后逐渐增高,差异有统计学意义(P0.05)。除0 h外,缺氧干预各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于B1组,差异有统计学意义(P0.05)。MTT法检测示,常氧条件下B、C组各时间点吸光度(A)值均显著高于缺氧条件下B1、C1组(P0.05),C组各时间点A值均显著高于B组(P0.05),缺氧干预后6、9、12 h B1组A值显著低于C1组(P0.05)。Western blot法检测示,与B1组比较,C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达均显著下调(P0.05)。结论通过重组LVs介导Akt1基因转染可通过抑制凋亡显著提高BMSCs的缺氧耐受能力,从而为改善干细胞移植治疗心肌梗死效果提供新思路。