褪黑素与全反式维甲酸共同作用对大鼠脊髓神经干细胞分化的影响

[目的]研究全反式维甲酸(all-trans retinoic ac id,ATRA)与不同浓度的褪黑素(m elaton in,MT)共同作用对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元方向分化的影响。[方法]取孕14 d的胚胎大鼠脊髓,原代培养出脊髓NSCs,传4代后分别加入ATRA与不同浓度的MT组合。采用细胞计数结合免疫荧光检测法,观察NSCs细胞的生长增殖及分化状况,并作统计学分析。[结果]与对照组[(8.8±1)%]相比,单纯ATRA作用组神经元分化比率[(10.6±2%]无明显差异;单纯MT作用组100 mol/L[(24.8±2)%]与10 nmol/LMT[23.4±1%)]2组都能明显促进脊髓NSCs向神经元分化,2组间比较无明显差异;ATPA与100μmol/LMT共同作用组[(53.9±2)%],进一步提高了脊髓NSCs向神经元分化的比率;ATRA与10 nmol/LMT共同作用组[(26.7±2)%]也能促进脊髓NSCs向神经元方向分化(与对照组相比较),但其分化率与单一使用MT的2组比较无明显差异。[结论]单纯应用不同浓度的MT都促进脊髓源性的NSCs向神经元分化,但ATRA与不同浓度的MT联用对神经元分化率有着不同影响。     

miR-126信号在神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中的作用

目的探讨miR-126信号在脊髓源性神经干细胞定向分化为胆碱能神经元过程中的作用。方法采用神经干细胞球形成方法培养获得纯化的脊髓源性神经干细胞,添加诱导因子,诱导分化为胆碱能神经元,定量检测分化前后miR-126的表达变化。采用生物信息学方法,分析miR-126的靶基因和转录因子结合位点。结果 miR-126的表达在分化后的胆碱能神经元较未分化的神经干细胞明显增高。MiR-126作用的靶基因的作用包括蛋白结合、磷酸化修饰、神经发育、突触发育、细胞迁移、粘附等。miR-126含有3个潜在的转录因子结合位点。结论本文提示miR-126信号在神经干细胞向胆碱能神经元分化过程中具有调节作用。     

神经干细胞移植治疗结肠去神经节小鼠

目的 观察神经干细胞在去神经节小鼠结肠壁内的存活分化,探讨神经干细胞移植治疗结肠无神经节细胞症的可行性.方法 0.5%苯扎氯铵(BAC)处理8周龄昆明小鼠结肠浆膜层选择性去除结肠肇神经节制作巨结肠模型,原代培养新生小鼠大脑皮质来源神经干细胞,Hoechsd3342标记传代纯化后神经干细胞.运用微量注射器将标记后的神经干细胞移植入模型鼠病变肠段,分别于术后1、2、3、4周行大体观察,苏木素-伊红(HE)染色,免疫组织荧光检测小鼠生物学特性和神经干细胞存活分化情况.结果 原代培养神经干细胞Nestin表达阳性,体外培养可分化为神经元和神经胶质细胞;BAC处理后,HE染色及免疫组织化学染色显示小鼠结肠肌间及黏膜下神经节消失;神经干细胞移植后各观测时间点可见荧光标记细胞,免疫组织荧光检测显示术后1周结肠壁存在巢蛋白(Nestin)表达阳性细胞,3周后可见神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性细胞,对照组未观察到阳性表达.结论 神经干细胞可以在去神经节小鼠结肠肇内存活并分化为神经元及胶质细胞,部分恢复肠道神经的调节作用.     

人GDNF基因的腺病毒载体构建及其在人神经干细胞中的表达

目的：观察构建的含人胶质细胞源性生长因子（GDNF）基因腺病毒载体对人神经干细胞的感染及其基因表达情况,为脊髓损伤的基因及神经干细胞治疗提供前期实验依据。方法：从12周龄流产人新鲜胚胎中提取人神经干细胞并进行培养,行Nestin免疫荧光染色进行检验。将全长558bp编码人GDNF的cDNA克隆到重组腺病毒载体质粒,并在人胚肾细胞（HEK293细胞）中包装出含有目的基因hGDNF的腺病毒,然后用该腺病毒感染人神经干细胞,应用荧光显微镜和Western-blot检测病毒感染及外源基因的表达情况,并进行GFAP和Tubulin免疫荧光染色检测神经干细胞向神经细胞分化情况。结果：Nestin免疫荧光染色显示所培养细胞为阳性染色红色,表明其具有神经干细胞性状;感染48h后观察到神经干细胞中有大量的增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达,以及hGDNF蛋白高表达;感染后的神经干细胞有长的伪足伸出,呈GFAP和Tubulin染色阳性,表明促进了神经干细胞向神经元的分化。结论：腺病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可作为一种良好的基因导入载体,实现外源基因hGDNF在神经干细胞内的有效表达,并可为神经干细胞分化为神经元提供更有利条件。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的体外研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞( marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞定向分化中神经蛋白分子的表达情况。　方法　取第5～7代体外培养Wistar大鼠MSCs,以0 .5μmol/ L全反式视黄酸( all- trans retinoidacid,ATRA)预诱导2 4 h后,换用改良神经细胞培养基( modified neuronal medium,MNM)继续培养。在ATRA作用2 4 h及MNM作用2、6、9、18及36 h,免疫组织化学检测巢蛋白( Nestin)、神经元特异性核心抗原( neuron- specificnuclear protein,Neu N)、微管相关蛋白2 ( microtubule- associated protein 2 ,MAP- 2 )和胶质纤维酸性蛋白的表达情况。　结果　ATRA和MNM作用后,MSCs呈典型神经元样,伸出较多的突起和分支,形成网络。Nestin最先表达,ATRA作用2 4 h出现,Neu N其次,MNM作用2 h检测到,MAP- 2最晚,MNM作用9h检测到。Nestin在MNM作用18h后表达最强,其阳性率为92 .3%±3.4 % ;36 h后表达明显减弱,阳性率仅为12 .3%±3.4 % ,而其它标志蛋白则持续表达。　结论　ATRA和MNM能促进MSCs向神经前体细胞和神经元转化,神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致,为研究神经细胞发育提供了一个较好的体外模型     

EphrinB2对妊娠中期小鼠子宫血管内皮生长因子表达的影响

目的 通过观察EphrinB2对小鼠妊娠中期子宫血管内皮生长因子(VEGF)表达及孕体生长情况的影响来探讨EphrinB2促血管发育的机制. 方法 C57BL/6小鼠分为4组,分别为1组(对照组)、2组(低浓度组,EphrinB2-Fc10 μg/kg,ip)、3组(中浓度组,EphrinB2-Fc 50 μg/kg,ip)和4组(高浓度组,EphrinB2-Fc 250 μg/kg浓度组,ip),2、3、4组在检查到阴栓当天腹腔注射EphrinB2-Fc PBS溶液,对照组注射等量PBS,连续注射7d,妊娠10.5d处死小鼠,称量孕体重量,应用实时聚合酶链反应(Realtime PCR)及免疫组化法检测子宫VEGFmRNA和蛋白的表达. 结果 (1)小鼠孕体重量在EphrinB2高浓度组明显增高;(2) EphrinB2促进小鼠子宫VEGFmRNA及蛋白表达. 结论 EphrinB2调控妊娠血管发育的作用可能与其促子宫VEGF表达增加有关,EphrinB2亦可促进孕中期孕体生长加速.     

脑源性神经营养因子对低温移植干细胞的环境营养与促神经分化作用

我们利用脑源性神经营养因子(BDNF)的营养神经及其易于诱导干细胞向神经元分化的双重作用机制,观察BDNF对亚低温环境下移植干细胞的环境营养作用以及其促进向神经元分化的体内实际效果.     

过表达Mash-1-1基因促进小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨过表达Mash-1基因对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)向神经细胞分化的影响。方法采用病毒感染技术将MSCV-Mash-1基因、MSCV空载体感染至小鼠ESC(CE3细胞)(MSCV-Mash-1-CE3组、MSCV-CE3组),RT-PCR鉴定细胞Mash-1基因的表达情况;然后采用悬滴培养法使其形成拟胚体,再经神经培养液贴壁诱导分化。培养7、21 d于倒置相差显微镜下观察细胞形态改变;免疫荧光染色检测细胞贴壁后其神经干细胞和神经元标记蛋白巢蛋白(nestin)和β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)的阳性率;实时荧光定量PCR检测诱导培养0、1、7、14、21 d时,细胞甲胎蛋白(α-fetal protein,AFP)(内胚层标记基因)、Brachyury(中胚层标记基因)、FGF-5(外胚层标记基因)、Oct3/4(ESC标记基因)、nestin(神经干细胞标记基因)和β-tubulinⅢ(神经元标记基因)表达情况。以正常CE3细胞作为对照(CE3组)。结果与MSCV-CE3组和CE3组比较,MSCVMash-1-CE3组细胞Mash-1基因表达明显升高。经神经培养液诱导培养7、21 d后,MSCV-Mash-1-CE3组可见许多细胞折光性增强,长出细长轴突,出现单极、双极或多极形态,呈神经干细胞和神经元细胞形态;MSCV-CE3组和CE3组仅能观察到少数细胞长出细长轴突。免疫荧光染色检测示MSCV-Mash-1-CE3组诱导分化7 d nestin阳性率和21 dβ-tubulinⅢ阳性率显著高于MSCV-CE3组及CE3组(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示,与CE3组及MSCV-CE3组比较,培养1 d后MSCV-Mash-1-CE3组Brachyury表达明显降低(P0.05),FGF-5和nestin表达增高(P0.05);7 d后β-tubulinⅢ表达亦显著增高(P0.05);CE3组及MSCV-CE3组以上指标比较,差异均无统计学意义(P0.05)。3组间各时间点AFP和Oct3/4表达比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论过表达Mash-1基因能促进小鼠ESC向神经细胞方向分化。     

成体神经干细胞培养方法的建立

目的 探讨体外建立培养成体神经干细胞(MSC)的方法.方法 从6周龄大鼠脑组织中分离神经干细胞,用神经干细胞培养液[DMEM/F12培养液添加1%N2、2%B27、20 μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]使其稳定增殖,10%胎牛血清诱导其贴壁分化.倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇酶(NSE,成熟神经元的特异性标志)、半乳糖脑苷脂(Galc-C,成熟少突胶质细胞的标记物)的表达.结果 分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测显示Nestin阳性细胞为97.6%,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE、Galc-C阳性细胞.结论 采用无血清的神经干细胞培养液能培养出具有分化潜能的成体神经干细胞.     

脊髓神经干细胞的研究进展及应用前景

上世纪末,Reynolds等[1]从成年小鼠纹状体中分离出能够在体外不断分裂增殖的具有多分化潜能的细胞群,提出了神经干细胞(neuralstemcell,NSC)的概念。1997年Mckay[2]在Science上指出神经干细胞是指能自我更新、具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞能力的细胞,它具有多分化潜能、自我更新能力和干细胞基本生物学特性。Gage[3]也提出神经干细胞是被用来描述那些能产生神经组织或来源于神经系统、有一定的自我更新能力、能通过不对称分裂产生除它本身以外的细胞。神经干细胞的出现彻底改变了中枢神经系统(CNS)神经元不能再生…     

VEGF与颅脑损伤修复机制的研究进展

干细胞对颅脑损伤的治疗是当前研究的热点.但干细胞移植仍然存在排斥、存活率低等很多问题.研究招募自体骨髓间充质干细胞至损伤部位,并诱导定向分化为神经元细胞达到修复损伤的作用,从而成为颅脑损伤治疗方法的又一大热点.血管内皮细胞生长因子及其受体广泛分布于中枢神经系统,血管内皮细胞生长因子可促进脑微循环重塑、诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮分化,可抑制神经元死亡和凋亡,并且具有招募、诱导自体神经祖细胞及骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的功能.血管内皮细胞生长因子、骨髓间充质干细胞与神经营养因子之间形成网络机制,共同促进颅脑损伤修复.这种自身修复治疗有望成为一种有良好前景的研究方案.     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的：研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法：从12周龄人胚胎脑皮质分离细胞，采用无血清培养技术，协同应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(ECF)和重组人白血病抑制因子(rhLIF)进行培养；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记检测细胞的增殖能力，间接免疫荧光化学法检测细胞的分化情况。结果：培养得到的大量半悬浮生长的神经干细胞球能够传代培养；BrdU标记阳性，可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：人胚胎脑皮质分离细胞培养得到的细胞群具有神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

不同诱导剂对骨髓间充质干细胞向神经元分化的影响

目的 寻找一种较为理想的诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元的诱导剂及方法.方法 采用人淋巴细胞分离液从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增后,以不同组合的复合神经诱导剂加以诱导,诱导期间观察细胞形态的变化,通过免疫细胞化学鉴定诱导细胞的分化情况,并用SPSS 12.0进行数据分析.结果 人骨髓间充质干细胞在加入不同组合的复合神经诱导剂后,均出现了胞体收缩、突起伸出的神经元样改变.免疫组化结果显示,兔抗人巢蛋白(nestin)、鼠抗人神经丝单克隆抗体(neurofilament,NF)出现了不同的阳性率,其中以E组阳性率最高,nestin(5.653±1.228)%,NF(74.724±3.651)%,兔抗人胶质纤维酸性蛋白(gliafiber acid protein,GFAP)免疫组化染色均呈阴性,SPSS 12.0分析显示各诱导组之间差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 本实验探索出一种较为理想的诱导入骨髓间充质干细胞分化为神经元的复合神经诱导剂及方法.     

骨形成蛋白-2诱导脊髓神经干细胞分化的实验研究

目的：研究不同浓度的骨形成蛋白-2(bone norphogenetic protein-2，BMP-2)对脊髓源性神经干细胞(neural stem cells，NSCs)诱导分化成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)的影响。方法：取孕14d的胚胎小鼠脊髓，原代培养出脊髓NSCs。培养四代后，分别在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在与否的不同条件下，加入不同浓度的BMP-2．观察细胞的增殖、分化情况，用免疫组织化学的方法进行鉴定，并进行统计学分析：结果：低浓度的BMP-2(1～10ng／ml)与bFGF(20ng／ml)联合作用，可促进脊髓NSCs向神经元和星形胶质细胞分化，抑制其向少突胶质细胞分化。较高浓度BMP-2(100ng／ml)可抑制脊髓NSCs的增殖甚至导致细胞死亡。结论：脊髓NSCs在低浓度BMP和bFGF联合作用下能有效地分化成具有多种特性的神经样细胞，并与脊髓具有良好的同源性，可为脊髓损伤的修复研究提供良好的细胞学基础。     

脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经干细胞神经前体细胞的研究

目的 探索脑脊液诱导人间充质干细胞定向分化为神经干细胞的可行性.方法 分别采用同种异体脑脊液和细胞生长因子为诱导剂,体外诱导人脐血源和骨髓源间充质干细胞分化为神经干细胞.从形态学、免疫组化、荧光免疫绀化法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对诱导后细胞进行鉴定.结果 两种方法诱导后间充质干细胞呈现神经干细胞改变,均可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并表现相应的特征形态结构、表型和生物学特性,细胞长势良好.而脑脊液诱导组,从形态上与细胞生长因子诱导组基本一致,但从时间上缩短神经干细胞、神经样细胞的生长周期.结论 两种诱导方法均可在体外定向诱导不间来源人间充质干细胞转化为神经样细胞,而脑脊液诱导组诱导时问和细胞周期均较短.     

不同浓度神经生长因子诱导BMSCs的实验研究

目的 研究不同浓度神经生长因子体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的调节作用.方法 贴壁培养BMSCs,流式细胞检测表面标志物.A组加入3种浓度EGF和bFGF;B组加同样浓度bFGF;C组不加诱导剂.A、B组用脑源性神经营养因子(BDNF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导,免疫荧光及免疫组化鉴定.结果 第3代BMSCs为梭形样细胞,CD29、CD44、CD90为阳性,CD34、CD45为阴性.A组中100μg/L巢蛋白(NESTIN)(81.9±1.8)%.A组与B组比较,差异有统计学意义(P<0.05).继续诱导,可见微管相关蛋白2(MAP2)、神经丝(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结论 采用改良的全骨髓贴壁法,细胞活性好.bFGF和EGF同时应用比bFGF单独应用效果好.100μg//L(bFGF+EGF)预诱导m神经干细胞数量多,并分化为神经元样细胞.     

骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化过程的形态学观察

骨髓基质细胞(BMSCs)是骨髓内的一种多潜能的干细胞,具有分化为间叶组织,包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉等的能力,在一定条件下,骨髓基质细胞可诱导分化神经细胞,对中枢神经系统疾病的治疗有潜在的应用价值[1] 。一、材料与方法1.主要材料:αMEM培养基(Gibco公司) ,人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF b ,Chemicon公司) ,抗人巢蛋白(nestin)单抗(Chemicon公司) ,小鼠抗微管相关蛋白 2 (MAP 2 )单抗(Sigma公司) ,β巯基乙醇(BME ,Sigma公司) ,胎牛血清(Gibco公司) ,SP免疫组织化学试剂盒(福州迈新生物技术开发公司) ,LSM 5 10Meta激…     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养和分化的研究

目的探讨脊髓源性神经干细胞的培养方法和体外分化特性. 方法从孕龄15天的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清限定性培养基培养并进行干细胞体外分化,细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果. 结果胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,培养10天左右可获得干细胞球;用细胞免疫荧光化学法鉴定干细胞分化,可见其中含有神经元和星形胶质细胞. 结论无血清限定性培养基是脊髓源性神经干细胞的良好培养基;脊髓源性神经干细胞体外可诱导分化为神经元和神经胶质细胞.     

bFGF-2基因定向敲除影响肌体对周围神经损伤的反应

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF-2)作为神经营养因子对神经系统的发育、修复和存活有重要影响,已知外源性bFGF-2对培养基中神经元的存活和神经多肽的表达等有重要作用。为了研究周围神经损伤后再生过程中内源性bFGF-2的生理作用,该文作者通过形态定量分析、形态学和免疫组织化学等方法对bFGF-2基因缺失小鼠进行了一系列的研究。通过对野生性小鼠和bFGF-2基因定向敲除小鼠有髓鞘坐骨神经轴突的数量和直径的定量分析,发现在没     

血管内皮生长因子基因体外转染大鼠神经干细胞的研究

目的 探讨经脂质体介导转染血管内皮生长因子(VEGF)121基因的大鼠胚胎神经干细胞体内外基因表达的特点。方法脂质体介导法将VEGF121基因转染到大鼠神经干细胞中。经逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫荧光染色检测转基因神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况。用立体定向法将BrdU标记的转基因神经移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区。免疫荧光染色观察移植后1周转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况。结果转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达并持续2周左右。转基因神经干细胞移植后1周在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物。结论经脂质体介导转染VEGF121基因的大鼠胚胎神经干细胞在体内外均有良好的基因表达。