CGRP与VEGF对内皮细胞成血管的作用比较研究

[目的]比较降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对血管内皮细胞增殖、迁移、体外成血管作用的大小.[方法]体外分离培养获取脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs).并通过血管性血友病因子(vonWillebrand factor,Vwf)与CD31抗原鉴定.实验分9组,(10-12～10-8)CGRP,(5 ～20 ng/ml) VEGF165,另设置一个空白对照组.采用细胞免疫荧光脱察HUVECs的CGRP受体(calcitonin gene-related peptide receptors,CGRPR)表达情况,alarmar Blue法动态检测各组HUVECs的增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力,采用体外成管实验检测各组促血管生成作用大小.Q-PCR检测CGRP和VEGF165刺激细胞时,CGRP受体的mRNA表达情况.[结果]CGRP及VEGF165时间-浓度依赖性促进HUVECs增殖,VEGF165促内皮细胞增殖的能力强于CGRP,差异有显著性.CGRP及VEGF165都能明显促进HUVECs迁移及促进HUVECs在基质胶中形成毛细血管样结构.并且两者的最大作用基本相当.CGRP与VEGF165都能促进内皮细胞中CGRP受体表达水平增加.但是CGRP促CGRP受体的生成作用明显强于VEGF165.[结论]CGRP是强的促血管生成因子,其促血管生成的作用与低浓度(5 ～20ng/ml) VEGF165相当.     

降钙素基因相关肽对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制研究

目的组织工程骨的神经化能有效促进支架材料内血管生成,修复骨缺损。研究降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖与迁移的作用,进一步揭示组织工程骨的神经化促血管生成机制。方法体外分离获取HUVECs,并通过血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与CD31抗原鉴定,取第1代细胞用于实验。实验分为6组,分别以0(A组)、1×10—12(B组)、1×10—11(C组)、1×10—10(D组)、1×10—9(E组)、1×10—8mol/L(F组)浓度CGRP干预HUVECs。采用细胞免疫荧光观察HUVECs的CGRP1受体(CGRP1 receptor,CGRP1R)表达情况,AlarmarBlue法动态检测各组HUVECs增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力,ELISA法检测HUVECs分泌VEGF的水平,Westernblot法检测其局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的表达。结果分离的细胞通过形态学及vWF、CD31免疫荧光鉴定为HUVECs,并可见CGRP1R在细胞质和细胞膜表达。CGRP呈时间-浓度依赖性刺激HUVECs增殖;B～F组各时间点细胞增殖能力均高于A组(P<0.05),F组各时间点细胞增殖能力最高。B～F组迁移细胞数均显著高于A组(P<0.05),最大增幅达3倍以上。B～F组VEGF分泌量均显著高于A组(P<0.05);C、D组促进细胞分泌VEGF的能力最强。Western blot检测示,与A组相比,B～F组CGRP刺激HUVECs 3、7、10 d后,FAK表达明显增加(P<0.05)。结论 CGRP对HUVECs的增殖和迁移有直接促进作用,可能作用机制为CGRP能促进VEGF分泌和增加FAK的表达。     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。     

血管内皮生长因子及其受体mRNA在乳腺癌组织中的表达

目的　研究血管内皮生长因子及其受体FLT 1、FLK 1mRNA在乳腺癌组织中的表达及与临床病理因素的相关性。　方法　采用逆转录聚合酶链反应技术对手术的 47例乳腺癌标本 ,11例乳腺良性病变标本中血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体FLT 1、FLK 1mRNA的表达进行检测。结果　在良、恶性乳腺组织中均检测到VEGF12 1、165mRNA的表达 ,在乳腺癌组织中表达水平分别为0 42 0± 0 13 3、0 2 91± 0 0 94高于良性乳腺组织 0 196± 0 0 67(P =0 0 0 0 )、0 2 0 6± 0 0 5 8(P =0 0 0 1) ;在乳腺癌组织中 ,VEGF12 1mRNA表达高于VEGF165mRNA(P =0 0 0 0 ) ,而在良性乳腺组织中两者表达水平差异无显著性意义 (P =0 666)。FLT 1、FLK 1mRNA在部分乳腺癌组织中表达 ,分别为 3 8 3 %(18/4 7)和 2 5 5 % (12 /4 7) ,而在良性乳腺组织中未见表达。乳腺癌组织中VEGF12 1、VEGF165、FLT 1、FLK 1mRNA表达与患者年龄、肿块大小、淋巴结转移状况、肿瘤分期及雌、孕激素受体状况之间无明显相关性。　结论　乳腺癌组织中VEGF12 1、165及其受体FLT 1、FLK 1mRNA表达水平上调 ,提示其在乳腺癌的血管生成中起着重要作用。     

血管内皮生长因子及其受体在鼠成骨细胞分化中的作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)在鼠成骨细胞分化过程中的作用。方法 利用鼠原代FRC细胞培养系统(第0、5、9、14天)和取材新生鼠颅盖骨组织(5例)，采用反转录聚合酶链反应(RT．PCR)和免疫组织化学染色方法，检测VEGF及其受体Flt-1和KDR／Flk-1在FRC细胞分化、矿化过程中mRNA和在新生鼠颅盖骨组织中蛋白质的表达。结果 在控制培养条件下，FRC细胞出现明显的成骨特性。结合FRC细胞分化特性，RT-PCR检测发现VEGF及其受体Flt-1和KDR／Flk-1在FRC细胞中从分化到矿化过程中，mRNA表达逐渐增强。特别是在矿化后第9天和第14天表达水平明显增强。免疫组织化学染色证实了RT-PCR结果，新生鼠颅盖骨中的成骨细胞同时表达VEGF及其受体Flt-1和KDR／Flk-1。结论 VEGF及其受体Flt-1和KDR／Flk-1在成骨细胞分化和矿化过程中表达逐渐增强。作为一种重要的血管性因子，VEGF的自分泌作用方式在成骨细胞的分化中起重要作用。     

奥曲肽体外抑制血管生成的研究

目的探讨奥曲肽对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外构建新生血管的抑制作用。方法应用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞仪、侵袭和迁移实验、Matrigel实验,研究不同浓度奥曲肽(1×10-10～1×10-5mol/L)对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖、侵袭、迁移和分化成血管能力的影响。应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测HUVECs生长抑素受体(SSTR)的表达。结果奥曲肽浓度在1×10-8～1×10-5mol/L时抑制VEGF诱导的HUVECs增殖;流式细胞仪检测表明HUVECs被扣留在细胞周期G0/G1期;浓度为1×10-7～1×10-5mol/L时,奥曲肽抑制VEGF诱导的HUVECs侵袭作用,对HUVECs迁移无影响;浓度为1×10-8mol/L时,奥曲肽抑制HUVECs体外分化成管样结构,浓度为1×10-6mol/L时,完全阻断HUVECs体外分化成管样结构。RTPCR显示HUVECs表达高水平的SSTR3。结论奥曲肽对HUVECs体外构建新生血管具有抑制作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中降钙素基因相关肽受体的表达

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)受体的表达变化。[方法]采用全骨髓法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为诱导成骨组与未诱导组,在传代培养的不同时期(1、2、3周),采用免疫细胞化学、Western Blot对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化进行鉴定,采用RT-PCR、Western Blot检测各组细胞CGRP受体mRNA、蛋白的表达情况。[结果]RT-PCR结果显示同一时间点诱导组CGRP受体mRNA表达量高于未诱导组,诱导组CGRP受体mRNA表达以时间依赖性的方式不断增高;Western Blot结果显示同一时间点诱导组CGRP受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组CGRP受体蛋白水平以时间依赖性的方式增高。[结论]本实验从mRNA、蛋白水平证实大鼠骨髓间充质干细胞表达CGRP受体,随着成骨诱导的不断进行,CGRP的表达量随之上升。     

乳腺癌发生与演进过程中血管生成作用的评价

目的 探讨人乳腺癌前病变、原位癌及浸润性癌中CD34、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1/KDR的表达变化及血管生成异常与乳腺癌发生发展的关系.方法 应用免疫组织化学技术检测30例正常乳腺、30例普通性增生、30例非典型增生(AH)、20例导管内癌、50例浸润性导管癌组织中微血管密度(MVD)、VEGF及Flk-1/KDR的表达.结果 各组CD34、VEGF及Flk-1/KDR的表达程度不同,浸润性导管癌组最高.随病程演进MVD逐渐增加(P<0.05),VEGF及其受体Flk.1/KDR在血管内皮细胞表达渐进性增高(P<0.05),但在病程初期各主要指标改变不明显,显著变化始于AH阶段.MVD在AH与导管内癌组间差异无统计学意义(P>0.05),VEGF及Flk-1/KDR的表达在AH与导管内癌组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 血管生成异常可能是乳腺癌发生过程中的早期事件.VEGF及Flk-1/KDR的表达异常可能是乳腺普通性增生-AH-乳腺癌这一癌性转化过程中血管生成异常的主要始动因素,其可能成为乳腺癌早期诊治的靶标.     

血管内皮细胞生长因子及其受体在脊柱转移癌中定量表达的研究

目的探讨血管内皮细胞生长因子及其受体在脊柱转移癌中的定量表达,及其与新生血管形成之间的关系。方法应用免疫组化及图像分析技术,检测77例人脊柱转移癌组织VEGF、FLT、FLK-1表达和微血管密度计数(MicrovesselscountMVC)。结果VEGF、FLT、FLK-1主要表达于转移癌细胞。VEGF表达以肺癌转移组最高为3.16±0.23(P<0.01),FLK-1表达以乳腺癌组为最高2.98±0.18(P<0.01)。新生血管形成多位于转移癌的侵袭性边缘。平均MVC计数20.93±11.82个(8.8~67.3)。FLK-1、FLT、VEGF表达和MVC计数之间均呈显著相关(P<0.01)。结论血管内皮细胞生长因子及其受体的表达在脊柱转移癌新生血管形成的过程中具有重要作用。     

赖氨酰氧化酶样蛋白2在胆管癌中的表达以及与血管内皮生长因子A及血管生成的关系

目的:探讨赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)在胆管癌中的表达以及与胆管癌血管生成的关系。方法:下载GEO数据库中相关数据,比较胆管癌组织和癌旁组织LOXL2的mRNA表达差异;通过基因集富集分析法分析LOXL2在胆管癌中的功能;分析各数据集中LOXL2与血管内皮生长因子A(VEGFA)表达的关系。通过Western blot、qRT-PCR和ELISA检测下调或上调胆管癌细胞株中LOXL2的表达后,VEGFA的表达和分泌水平变化。用干扰或过表达LOXL2的胆管癌细胞的条件培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,观察其管腔形成情况。结果:GEO数据库分析结果显示,LOXL2在癌组织中的表达明显比癌旁高(P0.05);LOXL2可能参与了胆管癌血管生成;各GEO数据集中LOXL2与VEGFA的表达均呈正相关(r=0.320、0.243、0.234、0.665,均P0.05)。在胆管癌细胞中,干扰LOXL2后VEGFA的表达及分泌水平均明显下降,过表达LOXL2后VEGFA的表达和分泌水平均明显升高(均P0.05)。干扰LOXL2的胆管癌细胞的条件培养基培养后HUVECs管腔形成明显减少,而过表达LOXL2的条件培养基培养后HUVECs管腔形成明显增加(均P0.05)。结论:LOXL2在胆管癌中的表达升高,并可能通过上调VEGFA的表达促进胆管癌的血管生成。     

The Kinase Insert Domain-containing Receptor (KDR) is Regulated by Shear Stress

Objective : Intimal hyperplasia develops in areas with low shear stress. The aim of the present study was to investigate if the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), Fms-like tyrosine kinase-1 receptor (Flt-1) and kinase insert domain-containing receptor (KDR) is regulated by shear stress. Design : Endothelial cells from human umbilical veins were in an in vitro system subjected to different levels of shear stress during 1 and 12 h. The mRNA expression of VEGF, Flt-1 and KDR was measured with RT-PCR. eNOS served as positive control and actin as housekeeping gene. Results : The KDR expression was isolated upregulated 3-4 times after 12 h exposure to high shear stress. Conclusion : The genetic expression of KDR is upregulated by shear stress and this response is time dependent.     

The kinase insert domain-containing receptor (KDR) is regulated by shear stress

OBJECTIVE: Intimal hyperplasia develops in areas with low shear stress. The aim of the present study was to investigate if the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), Fms-like tyrosine kinase-1 receptor (Flt-1) and kinase insert domain-containing receptor (KDR) is regulated by shear stress. DESIGN: Endothelial cells from human umbilical veins were in an in vitro system subjected to different levels of shear stress during 1 and 12 h. The mRNA expression of VEGF, Flt-1 and KDR was measured with RT-PCR. eNOS served as positive control and actin as housekeeping gene. RESULTS: The KDR expression was isolated upregulated 3-4 times after 12 h exposure to high shear stress. CONCLUSION: The genetic expression of KDR is upregulated by shear stress and this response is time dependent.     

抑制信号传导与转录激活因子3对人胰腺癌体外血管生成的影响

目的　探讨RNA干扰(RNAi)抑制信号传导与转录激活因子3(STAT3)对人胰腺癌体外血管生成的影响及其机制.方法 RNAi抑制胰腺癌细胞株SW1990细胞中STAT3、噻唑蓝(MTT)和流式细胞技术分别检测胰腺癌细胞上清液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞增殖和细胞周期的影响.体外迁移实验检测胰腺癌细胞上清液诱导的HUVEC迁移能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胰腺癌细胞上清液中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达.结果　MTT和流式细胞仪结果显示RNAi抑制STAT3后,HUVEC增殖能力下降,24、48、72 h的细胞增殖率分别为(1.19±0.11)％、(1.62±0.15)％、(1.95±0.18)％;细胞周期阻滞于G0/G1期,为(80.95±7.49)％.体外迁移实验显示RNAi抑制STAT3后,HUVEC迁移能力明显减弱.ELISA显示RNAi抑制STAT3后,VEGF蛋白表达下降60％.结论　RNAi抑制STAT3可以通过下调VEGF,抑制胰腺癌细胞体外血管生成能力.     

Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors Flt-1 and KDR/Flk-1 in chronic cyclosporine nephrotoxicity

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an endothelial cell mitogen involved in angiogenesis, wound healing, and inflammation. METHODS: Rats placed on low salt diet (LSD) or normal salt diet (NSD) were treated with cyclosporine (CsA) or vehicle (VH) and killed at 7 or 28 days. We studied the expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR/Flk-1 mRNA by Northern and that of VEGF protein by Western blot. RESULTS: CsA induced VEGF mRNA and protein expressions at 7 and 28 days in LSD rats. At 7 days, CsA up-regulated the expression of Flt-1 and KDR/Flk-1 receptors; however, at 28 days, Flt-1 remained unchanged whereas KDR/Flk-1 expression declined. In NSD rats, in which the lesion did not develop, the expression of VEGF and its receptors remained similar to control. CONCLUSIONS: What causes VEGF to be up-regulated remains unclear. Further studies are needed to study the role of hypoxia and other cytokines in relation to VEGF in this model.     

巨噬细胞对内皮细胞系同源盒B2基因和血管内皮生长因子受体mRNA及整合素αvβ3表达的影响

目的　体外观察巨噬细胞(M)对血管内皮细胞同源盒(HOX)B2基因mRNA和血管内皮生长因子(VEGF)受体KDRmRNA及整合素ανβ3表达的影响。　方法　体外培养人脐静脉血管内皮细胞系ECV304,分为(1)ECV304组; (2)ECV304 伴刀豆球蛋白A(conA,终浓度25mg/L)组; (3)ECV304 人M系U937组:ECV304细胞中加入1×105 /mlU937细胞; (4)ECV304 U937 conA组:ECV304中加入1×105 /mlU937细胞及终浓度25mg/L的conA.反应48h后,用免疫荧光技术检测各组ECV304细胞整合素ανβ3的表达情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)技术检测细胞KDRmRNA和HOXB2基因mRNA的表达水平。　结果　ECV304组细胞的整合素ανβ3、KDRmRNA及HOXB2基因mRNA的表达水平分别为6. 7±1. 5、0. 633±0. 012、0. 674±0. 004。ECV304 U937 conA组细胞上述指标较ECV304组均明显上调(P<0. 01 ),分别为10. 2±1. 7、0. 879±0 003、0. 947±0 003。其余两组细胞上述指标与ECV304组比较,差异均无统计学意义(P>0. 05).结论　被conA活化的M通过影响内皮细胞的KDRmRNA、HOXB2mRNA基因及整合素ανβ3的表达,来促进内皮细胞增殖、迁移及与基质黏附,从而调节血管生成。     

血管内皮生长因子对血管内皮细胞αv整合素表达的影响

目的明确和完善外源性血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）对体外培养的大血管内皮细胞αv整合素表达的影响，探讨VEGF促进血管内皮细胞迁移及血管新生的机制。方法采用人脐静脉内皮细胞原代培养，分为实验组和对照组，实验组加入20ng／mlVEGF165，对照组加入无血清DMEM，用免疫细胞化学的方法检测αv整合素的表达。结果αv整合素阳性表达于内皮细胞膜上；对照组（DMEM组）HUVEC膜表面αv整合素呈弱表达；实验组（VEGF组）细胞膜上可见棕褐色染色明显加深。因细胞膜立体包绕胞质和胞核，故染色颗粒覆盖了胞浆和胞核。平均灰度值差异有明显统计学意义（P〈0．01）。结论外源性VEGF在作用24h后，能明显上调体外培养的人脐静脉内皮细胞αv整合素的表达。     

Nitric oxide modulates vascular endothelial growth factor and receptors in chronic cyclosporine nephrotoxicity

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is involved in angiogenesis, wound healing, and inflammation and exerts its effect via tyrosine kinase receptors, fms-like tyrosine kinase (Flt-1) and fetal liver kinase (Flk-1 or KDR). We have previously shown that VEGF is up-regulated in a model of chronic cyclosporine (CsA) nephrotoxicity and that l-arginine (l-Arg) improved while N-nitro-l-arginine-methyl ester (L-NAME) worsened fibrosis. We examined the role of nitric oxide modulation on VEGF in this model. METHODS: Pair-fed salt-depleted rats were administered CsA, CsA + L-NAME, CsA +l-Arg, vehicle (VH), VH + L-NAME or VH +l-Arg and were sacrificed at 7 or 28 days. Physiologic and histologic changes were studied in addition to the mRNA expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR/Flk-1 by Northern blot and the protein expression of VEGF by Western blot and immunohistochemical staining. RESULTS: While L-NAME worsened renal function and histology, l-Arg had the opposite beneficial effect in CsA-treated rats. VEGF mRNA and protein expressions increased with CsA, further increased with L-NAME and became significantly reduced with L-Arg. Flt-1 expression was similar in all groups. On the other hand, KDR/Flk-1 mRNA expression was modulated in a fashion similar to VEGF. Also, nitric oxide modulation did not have an effect on VH-treated rats. CONCLUSIONS: VEGF expression in chronic CsA nephrotoxicity is increased by nitric oxide blockade and decreased by nitric oxide enhancement. Moreover, VEGF probably exerted its effect via the KDR/Flk-1 receptor. The actions of VEGF in this model remain speculative, but it is probable that VEGF plays a role, either independently or through nitric oxide, in CsA-induced fibrosis.