磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/基质金属蛋白酶-9信号通路在芬太尼抑制人胃癌细胞侵袭和迁移中的作用

目的观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/基质金属蛋白酶(MMP)-9信号通路在芬太尼抑制人胃癌MGC-803细胞侵袭和迁移中的作用。方法将人胃癌MGC-803细胞随机分为空白对照组(C组)、芬太尼组(F组),LY294002组(LY组),SB-3CT组(SB组),LY294002+芬太尼组(FLY组)和SB-3CT+芬太尼组(FSB组)。Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭迁移能力,实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测MMP-9和Akt的mRNA和蛋白质的表达,使用方差分析和独立样本t检验分析组间差异。结果F组胃癌细胞侵袭数低于C组(35.91±3.36比48.46±4.86,t=3.679,P<0.05)、迁移数低于C组(74.75±3.76比96.00±5.20,t=5.739,P<0.05)细胞迁移率(%)低于C组(14.29±4.29比22.43±3.37,t=3.591,P<0.05),Akt mRNA表达低于C组(0.77±0.02比1.00,t=8.110,P<0.05)、MMP-9 mRNA表达低于C组(0.87±0.08比1.00,t=2.967,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于C组(0.76±0.04比0.90±0.05,t=3.940,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于C组(0.76±0.05比0.94±0.04,t=4.774,P<0.05),差异均有统计学意义。FLY组胃癌细胞侵袭数低于LY组(18.45±4.86比33.62±4.13,t=4.999,P<0.05)、细胞迁移数低于LY组(42.79±3.56比71.79±7.60,t=5.986,P<0.05)和细胞迁移率(%)低于LY组(7.52±1.30比11.02±1.73,t=2.811,P<0.05),FLY组Akt mRNA表达低于LY组(0.60±0.05比0.76±0.17,t=3.468,P<0.05)、MMP-9 mRNA表达低于LY组(0.75±0.06比0.88±0.03,t=3.288,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于LY组(0.60±0.02比0.75±0.05,t=4.783,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于LY组(0.48±0.03比0.74±0.06,t=7.266,P<0.05),差异均有统计学意义。FSB组胃癌细胞侵袭数低于SB组(18.67±2.15比32.33±6.20,t=3.607,P<0.05)、细胞迁移数低于SB组(45.67±4.63比75.04±4.47,t=7.898,P<0.05)和细胞迁移率(%)低于SB组(7.09±1.69比14.39±2.06,t=4.745,P<0.05),FSB组Akt mRNA表达低于SB组(0.53±0.11比0.76±0.07,t=2.950,P<0.05)、MMP-9 mRNA低于SB组表达(0.63±0.07比0.84±0.01,t=3.687,P<0.05)、Akt-1蛋白表达低于SB组(0.61±0.03比0.75±0.04,t=4.573,P<0.05)和MMP-9蛋白表达低于SB组(0.53±0.07比0.72±0.05,t=3.730,P<0.05),差异均有统计学意义。芬太尼可降低细胞侵袭和迁移能力,MMP-9和p-Akt表达减少,且芬太尼联合LY294002或SB-3CT较单独用药时进一步加强了抑制效果。结论芬太尼抑制人胃癌MGC-803细胞侵袭和迁移的机制与抑制PI3K/Akt/MMP-9信号通路有关。     

长链非编码RNA氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1对肾癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA氧化应激反应丝氨酸丰富1反义RNA 1(lncRNA OSER1-AS1)对肾癌ACHN细胞的增殖、迁移、侵袭的影响及其对微小RNA(microRNA,miR)-612的调控作用。方法2017年1月至2020年3月,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测肾癌组织、癌旁组织中OSER1-AS1、miR-612的表达量;体外培养肾癌细胞ACHN,分别将OSER1-AS1小分子干扰RNA(si-OSER1-AS1)及其阴性对照(si-NC)、miR-612寡核苷酸模拟物(miR-612 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、si-OSER1-AS1与miR-612特异性寡核苷酸抑制剂的阴性对照(anti-miR-NC)、si-OSER1-AS1与miR-612特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-612)转染至ACHN细胞;采用RT-qPCR法检测细胞中OSER1-AS1、miR-612的表达量;采用噻唑蓝(MTT)、Transwell小室实验分别检测细胞增殖、迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测OSER1-AS1、miR-612的靶向关系;蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21蛋白表达量。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果肾癌组织OSER1-AS1的表达水平(1.00±0.08比3.37±0.28)高于癌旁组织(t=52.113,P<0.05),miR-612的表达水平(1.00±0.06比0.47±0.04)低于癌旁组织(t=47.062,P<0.05);si-OSER1-AS1组细胞活力(0.66±0.05比0.31±0.03)与Cyclin D1(0.63±0.05比0.25±0.02)、MMP-2(0.82±0.07比0.35±0.03)、MMP-9(0.76±0.06比0.28±0.03)蛋白水平低于si-NC组(t=18.007、21.169、18.514、21.466,P<0.05),si-OSER1-AS1组迁移细胞数[(115.56±9.52)个比(55.99±5.59)个]、侵袭细胞数[(93.41±6.09)个比(46.05±4.35)个]低于si-NC组(t=16.188、18.984,P<0.05),si-OSER1-AS1组p21蛋白水平(0.15±0.02比0.57±0.05)高于si-NC组(t=23.398,P<0.05);miR-612组细胞活力(0.68±0.05比0.39±0.03)与Cyclin D1(0.66±0.05比0.28±0.03)、MMP-2(0.85±0.06比0.46±0.03)、MMP-9(0.78±0.05比0.34±0.02)蛋白水平低于miR-NC组(t=14.920、19.551、17.441、24.512,P<0.05),miR-612组迁移细胞数[(118.76±9.87)个比(64.39±4.65)个]、侵袭细胞数[(99.65±9.12)个比(53.57±3.67)个]低于miR-NC组(t=14.950、14.062,P<0.05),miR-612组p21蛋白水平(0.14±0.02比0.51±0.04)高于miR-NC组(t=24.820,P<0.05);双荧光素酶报告实验证实OSER1-AS1可靶向结合miR-612;抑制miR-612表达可明显逆转干扰OSER1-AS1对细胞增殖、迁移及侵袭的作用。结论干扰OSER1-AS1可通过上调miR-612的表达从而抑制肾癌ACHN细胞增殖、迁移及侵袭。     

长链非编码RNA反义RNA 1靶向微小RNA-501-3p对食管癌细胞恶性生物学行为影响的实验研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)胸腺生成素反义RNA 1(TMPO-AS1)对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制。方法2016年6月至2019年12月,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测20例食管癌组织和癌旁组织中lncRNA TMPO-AS1和微小RNA(miR)-501-3p的水平,食管癌Eca109细胞分为lncRNA TMPO-AS1干扰组(转染si-NC和si-TMPO-AS1);miR-501-3p过表达组(转染miR-NC和miR-501-3p);lncRNA TMPO-AS1过表达组(转染pcDNA和pcDNA-TMPO-AS1);lncRNA TMPO-AS1和miR-501-3p共抑制组(转染si-TMPO-AS1+anti-miR-NC和si-TMPO-AS1+anti-miR-501-3p)。噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术和Transwell实验分别检测食管癌Eca109细胞增殖、凋亡率、细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法(Western blot)检测相关蛋白水平,双荧光素酶报告系统验证lncRNA TMPO-AS1与miR-501-3p的调控关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差进行分析。结果食管癌组织组中的lncRNA TMPO-AS1水平(2.64±0.26)高于癌旁组织(1.00±0.09,t=26.657,P<0.05),miR-501-3p水平(0.44±0.04)低于癌旁组织(1.00±0.07,t=31.063,P<0.05);干扰lncRNA TMPO-AS1的Eca109细胞24 h增殖(0.36±0.03)低于si-NC组(0.39±0.03,t=2.121,P<0.05),48 h增殖(0.45±0.04)低于si-NC组(0.75±0.07,t=11.163,P<0.05),72 h增殖(0.57±0.05)低于si-NC组(1.16±0.09,t=17.191,P<0.05),迁移细胞数[(54.14±5.65)个]低于si-NC组[(113.02±9.87)个,t=15.531,P<0.05],侵袭细胞数[(47.69±5.01)个]低于si-NC组[(96.32±9.88)个,t=13.169,P<0.05],细胞凋亡率[(22.15±2.22)%]高于si-NC组[(6.98±0.69)%,t=19.576,P<0.05];过表达miR-501-3p的Eca109细胞48 h增殖(0.51±0.05)低于miR-NC组(0.77±0.07,t=9.067,P<0.05),72 h增殖(0.65±0.06)低于miR-NC组(1.15±0.09,t=13.867,P<0.05),迁移细胞数[(61.23±6.33)个]低于miR-NC组[(115.25±9.25)个,t=14.458,P<0.05],侵袭细胞数[(53.14±5.33)]低于miR-NC组[(98.32±8.47)个,t=13.543,P<0.05],细胞凋亡[(19.58±1.74)%]高于miR-NC组[(7.23±0.77)%,t=19.471,P<0.05],差异均有统计学意义。结论lncRNA TMPO-AS1通过靶向miR-501-3p促进食管癌细胞的恶性生物学行为,可被视为食管癌患者的潜在治疗靶标。     

长链非编码RNA Linc00472靶向微小RNA-381对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

目的观察长链非编码RNA Linc00472(LncRNA Linc00472)靶向调控微小RNA-381(miR-381)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法收集2017年3月至2018年5月郑州大学第一附属医院收治的骨肉瘤患者29例为研究对象,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测骨肉瘤组织和瘤旁组织中Linc00472的表达。将骨肉瘤U2OS细胞分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Linc00472组、pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组、pcDNA3.1-Linc00472+miR-381组。甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移及侵袭。双荧光素酶报告实验鉴定Linc00472与miR-381的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果Linc00472在骨肉瘤组织中的表达水平低于瘤旁组织(0.31±0.03比1.03±0.10,t=37.138,P<0.05),差异有统计学意义;与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-Linc00472组细胞存活率[(100.29±10.12)%比(53.29±5.44)%]低于pcDNA3.1组(t=12.272,P<0.05),差异有统计学意义,迁移细胞数[(266.00±23.61)个比(124.00±12.01)个]与侵袭细胞数[(131.00±13.06)个比(62.00±6.24)个]少于pcDNA3.1组(t=16.082,P<0.05;t=14.301,P<0.05),差异有统计学意义,而细胞凋亡率[(8.58±0.91)%比(26.61±2.64)%]高于pcDNA3.1组(t=19.370,P<0.05),差异有统计学意义;miR-381过表达可抑制野生型载体WT-Linc00472细胞的荧光素酶活性(t=19.827,P<0.05),差异有统计学意义;与pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组比较,pcDNA3.1-Linc00472+miR-381组可增强细胞增殖[(53.17±5.33)%比(85.26±8.62)%]、迁移[(122.00±12.31)个比(223.00±22.18)个]及侵袭[(64.00±6.36)个比(104.00±10.20)个]能力高于pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组(t=9.499,P<0.05;t=11.945,P<0.05;t=9.983,P<0.05),细胞凋亡率[(26.11±2.62)%比(13.11±1.34)%]低于pcDNA3.1-Linc00472+miR-NC组(t=13.253,P<0.05),差异有统计学意义。结论LncRNA Linc00472通过靶向调控miR-381可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭并诱导细胞凋亡。     

神经元五环素1对腰椎间盘突出症术后瘢痕成纤维细胞增殖和迁移的影响

目的观察NPTX-1基因对腰背部术后瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响。方法收集2018年9月至2020年9月于青岛大学附属医院诊断为腰椎间盘突出症术后并接受取内固定的二次手术患者的瘢痕组织6例。体外分离培养瘢痕成纤维细胞;将瘢痕成纤维细胞分为实验组(A组)和对照组(B组),其中A组转染敲除NPTX-1基因的小干扰RNA(siRNA),B组转染NPTX-1基因的阴性对照序列(NC)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测NPTX-1和PCNA的表达。细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞增殖能力。细胞迁移实验(Transwell实验)检测细胞迁移能力。采用独立样本t检验比较两组的均数。结果RT-qPCR结果显示,A组细胞NPTX-1表达低于B组(0.18±0.03比1.56±0.04,t=49.691,P<0.01),差异有统计学意义。Western blot结果显示,A组细胞NPTX-1蛋白表达低于B组(0.29±0.04比0.68±0.01,t=15.302,P<0.05),差异有统计学意义。CCK-8结果显示,A组细胞在24、48、72 h的490 nm吸光度(A490 nm)值低于B组(0.93±0.04比1.06±0.05、1.42±0.05比1.66±0.08、1.65±0.06比1.99±0.07,t=4.469、4.958、6.192,P<0.01),差异有统计学意义。RT-qPCR结果显示,A组细胞PCNA表达低于B组(0.36±0.02比0.96±0.01,t=55.164,P<0.01),差异有统计学意义。Western blot结果显示,A组细胞PCNA蛋白表达低于B组(0.25±0.04比0.45±0.03,t=6.871,P<0.05),差异有统计学意义。Transwell结果显示,A组细胞迁移数量低于B组[(138.67±4.51)个比(275.00±5.00)个,t=35.072,P<0.01],差异有统计学意义。结论下调瘢痕成纤维细胞的NPTX-1基因可抑制瘢痕成纤维细胞的增殖能力和迁移能力,并抑制PCNA的表达。     

LncRNA LOC730101通过Wnt/β-catenin信号通路对骨肉瘤U2OS细胞生物学特性的研究

目的 探讨长链非编码RNA (lncRNA)LOC730101对骨肉瘤U2OS细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法 2019年2月至2019年10月,将体外培养的U2OS细胞分为对照组(正常培养)、阴性组(转染阴性对照)和干扰组(转染靶向LOC730101的干扰序列),采用RT-PCR检测细胞中LOC730101表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率,流式细胞仪检测细胞周期分布情况, Transwell小室检测细胞侵袭与迁移,Western blotting法检测细胞中上皮间质转化相关蛋白波形蛋白(Vi- mentin)、N-钙黏附素(N-cadherin)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关蛋白β-catenin、c-Myc、细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)和基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)蛋白的表达水平。结果进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果 与对照组比较,干扰组细胞中LOC730101表达水平(干扰组、对照组分别为0.25±0.03、1.00±0.06,下同)、细胞成活率[(57.65±3.26)%、(100.00±7.39)%]、克隆形成率[(13.03 ± 2.12)%、(25.35±3.58)%]、侵袭细胞数(51.36±3.48、92.85±6.62)、迁移细胞数(77.15 ± 5.05、136.92 ± 15.35)和细胞在S期[(20.54±2.15)%、(28.15±2.38)%]、G2/M期所占百分比[(16.87±2.12)%、(23.36±3.12)%]以及细胞中Vimentin (0.52 ± 0.04、1.17 ± 0.13)、N-cadherin (0.31 ± 0.03、0.65 ± 0.04)、β-catenin (0.42 ± 0.03、0.73 ± 0.04)、c-Myc (0.29±0.03、0.65±0.03)、Cyclin D1 (0.26±0.02、0.58±0.04)、MMP-7蛋白表达水平(分别为0.55± 0.03、0.86±0.06)均明显降低,而细胞在G0/G1期所占百分比[分别为(62.62±5.15)%、(48.46±3.65)%]以及细胞中E-cadherin蛋白的表达水平(分别为0.82±0.06、0.38±0.03)均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);但阴性组的各指标与对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 下调LOC730101可抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖、侵袭和迁移,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

臭椿酮抑制ENST00000441270/miR-149轴影响结直肠癌细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨臭椿酮对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法根据检测结果实施分组,采用低(0.2μmol/L)、中(0.4μmol/L)、高剂量(0.6μmol/L)的臭椿酮干预结直肠癌SW1116细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,集落形成实验检测克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ENST00000441270和微小RNA-149(miR-149)的表达水平。转染ENST00000441270小干扰RNA(si-ENST00000441270)至SW1116细胞,采用上述方法检测干扰ENST00000441270表达对SW1116细胞活力、克隆形成以及凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验验证ENST00000441270与miR-149之间靶向关系。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果臭椿酮低剂量组SW1116细胞的活力[(0.84±0.05)比(0.84±0.05),t=0.529,P>0.05]、克隆形成数[(110.00±3.56)个比(111.33±3.86)个,t=0.499,P>0.05]、凋亡率[(7.56±0.80)%比(7.35±0.63)%,t=0.307,P>0.05]、ENST00000441270[(0.98±0.06)比(0.99±0.06),t=0.238,P>0.05]和miR-149[(1.01±0.07)比(0.99±0.07),t=0.303,P>0.05]表达与对照组比较,差异均无统计学意义。臭椿酮中、高剂量组SW1116细胞的活力(0.63±0.04、0.40±0.03比0.84±0.05,t=7.667、12.667,P<0.05]、克隆形成数[(85.67±2.87)个、(58.33±2.62)个比(111.33±3.86)个,t=9.487、24.666,P<0.05]、ENST00000441270表达[(0.69±0.05)、(0.41±0.03)比(0.99±0.06),t=7.138、13.799,P<0.05]低于对照组,差异均有统计学意义,细胞凋亡率[(12.61±0.91)%、(21.66±0.97)%比(7.35±0.63)%,t=7.715、12.036,P<0.05]、miR-149表达[(1.48±0.08)、(1.92±0.10)比(0.99±0.07),t=7.415、14.074,P<0.05]高于对照组,差异均有统计学意义。si-ENST00000441270组SW1116细胞活力[(0.35±0.02)比(0.88±0.05),t=17.047,P<0.05]、克隆形成数[(49.67±2.87)个比(112.67±3.40)个,t=24.525,P<0.05]低于阴性对照(si-NC)组,细胞凋亡率[(22.62±0.82)%比(7.58±0.65)%,t=24.896,P<0.05]高于si-NC组,差异均有统计学意义。miR-149是ENST00000441270的靶基因。结论0.4、0.6μmol/L的臭椿酮能够抑制结直肠癌细胞SW1116增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制ENST00000441270/miR-149分子轴有关。     

沙门菌致病岛1蛋白促进神经母细胞瘤Warburg效应的作用及分子机制

目的探讨沙门菌致病岛1(SPI1)蛋白在神经母细胞瘤中调控有氧糖酵解(即Warburg效应)的作用及分子机制。方法运用公用数据库,解析神经母细胞瘤中调控Warburg效应的候选关键转录因子SPI1;经嘌呤霉素筛选,获得稳定过表达/敲低SPI1的SK-N-BE(2)细胞株,分为空载体对照(Mock)组、SPI1过表达(SPI1)组、随机干扰(sh-Scb)组、SPI1干扰(sh-SPI1)组;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因及蛋白质印迹法(Western blot)检测靶基因启动子活性和表达水平;分光光度计法和糖酵解压力试验检测有氧糖酵解水平;软琼脂克隆形成和基质胶侵袭检测瘤细胞的增殖和侵袭活性。组间比较采用t检验。结果SPI1组己糖激酶2(HK2)表达高于Mock组(3.63±0.53比1.00±0.05,t=17.462,P<0.05),磷酸甘油酸激酶1(PGK1)表达高于Mock组(3.28±0.39比1.00±0.03,t=17.651,P<0.05),细胞外酸化率(ECAR)高于sh-Scb组[(32.17±3.15)mpH/min比(9.82±1.49)mpH/min,t=10.352,P<0.05],克隆形成数高于Mock组[(163.30±7.59)个比(48.02±4.85)个,t=17.840,P<0.05],侵袭细胞数高于Mock组[(184.70±10.58)个比(88.33±5.56)个,t=8.214,P<0.05]。sh-SPI1组HK2表达低于sh-Scb组(0.33±0.02比1.00±0.04,t=14.370,P<0.05),PGK1表达低于sh-Scb组(0.34±0.02比1.00±0.03,t=19.192,P<0.05),ECAR值低于sh-Scb组(3.07±0.48比10.05±1.37,t=7.580,P<0.05),克隆形成数低于sh-Scb组[(21.33±3.96)个比(44.67±5.69)个,t=5.916,P<0.05],侵袭细胞数低于sh-Scb组[(40.67±3.48)个比(88.00±6.89)个,t=4.994,P<0.05],差异均有统计学意义。结论转录因子SPI1通过增强HK2和PGK1表达,促进神经母细胞瘤的Warburg效应和肿瘤进展。     

癌相关成纤维细胞外泌体携带微小RNA-20a靶向CX43调控细胞缝隙连接促进PC-3细胞侵袭和迁移

目的探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源外泌体微小RNA(miR)-20a对前列腺癌细胞间通讯连接(GJIC)、侵袭和转移能力的影响及其机制。方法构建CAFs来源近红外荧光蛋白(IRFPs)标记外泌体,以不同浓度(0、10、100、200 mg/L)与PC-3细胞共培养。蛋白质印迹法检测PC-3细胞中CX43蛋白的相对表达水平;荧光漂白恢复技术测定PC-3细胞间缝隙连接功能;Transwell小室侵袭和迁移实验检测PC-3侵袭能力。构建高表达和低表达miR-20a的CAFs,分别与PC-3细胞共培养,检测缝隙链接蛋白43(Connexin 43,CX43)表达、细胞缝隙连接功能、细胞迁移和侵袭能力。双荧光素酶报告实验验证PC-3细胞中miR-20a与CX43基因是否直接结合。用Student’t检验分析组间差异。结果PC-3细胞的CX43表达水平及细胞缝隙连接功能均随外泌体浓度增加而降低(0.715±0.058、0.544±0.039、0.313±0.028和0.196±0.020,F=19.031,P<0.05),差异有统计学意义。Transwell小室检测结果表明,CAFs来源外泌体促进PC-3细胞迁移[各组每视野穿膜细胞数分别为(176.0±9.2)、(485.0±12.8)、(159.5±9.7)和(198.0±10.5)个,F=11.475,P<0.01]和侵袭[各组每视野穿膜细胞数分别为(150.0±8.4)、(443.0±21.7)、(182.0±11.2)和(153.5.0±10.1)个,F=16.306,P<0.01],差异有统计学意义;增强细胞缝隙连接能抑制此效应(F=14.052,P<0.01;F=14.804,P<0.01)。高表达miR-20a组的PC-3细胞的CX43表达水平(0.126±0.062比0.834±0.103,t=9.430,P<0.05)、荧光恢复率[(25.02±7.85)%比(46.65±6.98)%,t=5.782,P<0.05]均显著低于低表达miR-20a组,但细胞的迁移[(502.5±18.6)个比(128.5.0±9.4)个,t=9.120,P<0.05]和侵袭能力(458.0±16.8比194.5±9.2,t=6.286,P<0.05)均显著高于表达miR-20a组,差异均有统计学意义。双荧光素酶报告实验结果显示,野生型CX43的PC-3细胞中,转染miR-20a的细胞荧光活性显著低于miR-NC组(0.46±0.08比0.99±0.14,t=10.208,P<0.05),差异有统计学意义;而突变型CX43的PC-3细胞中,miR-20a组与miR-NC组细胞荧光活性差异无统计学意义(0.94±0.06比0.97±0.08,t=0.142,P>0.05)。结论CAFs来源外泌体miR-20a通过直接作用CX43基因,下调PC-3细胞CX43的表达,从而显著降低细胞间通讯连接功能,增强前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。     

姜黄素对人脊索瘤细胞系CM-319凋亡和放射敏感性影响的实验研究

目的探讨姜黄素对人脊索瘤细胞系CM-319凋亡和放射敏感性的影响及作用机制。方法体外培养CM-319细胞,分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素5μmol/L组、姜黄素10μmol/L组、姜黄素20μmol/L组、si-NC组、si-UHRF1组、姜黄素+pcDNA组、姜黄素+pcDNA-UHRF1组,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3和UHRF1蛋白表达,qRT-PCR检测UHRF1 mRNA表达,克隆形成实验检测CM-319细胞对放射线敏感性。结果姜黄素0μmol/L组CM-319细胞凋亡率7.24%±0.73%,姜黄素5、10、20μmol/L组CM-319细胞凋亡率分别为12.61%±1.57%、18.42%±1.54%、29.37%±2.65%,差异有统计学意义(t=9.305;t=19.680;t=24.153,均P<0.05);Bcl-2蛋白相对表达量为0.76±0.07,余3组分别为0.62±0.06、0.51±0.05、0.33±0.03(t=4.556;t=8.719;t=16.939,均P<0.05);Bax相对表达量为0.26±0.03、0.41±0.04、0.55±0.05、0.69±0.06(t=9.000;t=14.920;t=19.230,均P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量为0.24±0.03、0.37±0.04、0.49±0.05、0.62±0.06(t=7.800;t=12.862;t=16.994,均P<0.05),UHRF1mRNA相对表达量为1.01±0.09、0.82±0.08、0.67±0.07、0.42±0.04(t=4.734;t=8.946;t=17.972,均P<0.05),UHRF1蛋白相对表达量为0.83±0.08、0.61±0.06、0.48±0.05、0.31±0.0(t=6.600;t=11.130;t=18.258,均P<0.05),且呈剂量依赖性,增敏比分别为1.433、1.708和2.183。Si-NC组CM-319细胞中UHRF1蛋白相对表达量为0.79±0.08,si-UHRF1组表达降低为0.35±0.04(t=14.758,P<0.05);CM-319细胞凋亡率分别为8.24%±0.83%和21.49%±2.11%(t=17.531,P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平分别为0.71±0.07、0.34±0.03(t=14.575,P<0.05);Bax相对表达量为0.25±0.03、0.62±0.06(t=16.547,P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量为0.23±0.03、0.58±0.05(t=18.007,P<0.05),增敏比为1.727。姜黄素+pcDNA组CM-319细胞凋亡率为28.31%±3.01%,姜黄素+pcDNA-UHRF1组为13.59%±1.25%(t=13.549,P<0.05);Bcl-2相对表达量分别为0.31±0.03、0.63±0.06(t=14.311,P<0.05);Bax相对表达量分别为0.71±0.07、0.42±0.04(t=10.791,P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量分别为0.65±0.05、0.38±0.04(t=12.650,P<0.05),增敏比为0.539。结论姜黄素可诱导CM-319细胞凋亡并增强CM-319细胞的放射敏感性,其机制与下调UHRF1表达有关。     

瞬时感受器电位离子通道香草素受体4在睾丸缺血再灌注损伤中对GC-1细胞增殖及凋亡的作用及其机制

目的探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)在睾丸缺血再灌注损伤(IRI)中对GC-1细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法建立睾丸GC-1细胞缺氧复氧模型,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测不同复氧损伤时间点TRPV4的表达变化;分别采用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞术检测转染TRPV4对GC-1细胞增殖和凋亡的影响;采用Western blot法检测睾丸组织中转染TRPV4对GC-1细胞中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3和细胞色素C(Cyt-C)表达的影响,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果对照组及缺氧复氧组(0、6、12、24、48和72 h)TRPV4的蛋白表达水平分别为0.19±0.02、0.35±0.03、0.42±0.04、0.46±0.04、0.62±0.05、0.54±0.05、0.45±0.04。缺氧复氧组TRPV4表达显著高于未缺氧GC-1细胞的对照组,并在复氧24 h达到峰值(F=6.898,P<0.05),差异有统计学意义;缺氧复氧组中细胞增殖水平明显低于对照组(52.32±4.58比100.00±7.63,t=-9.280,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平高于对照组(15.60±1.72比4.08±0.87,t=10.352,P<0.05),差异有统计学意义;过表达TRPV4组中细胞增殖水平低于其对照组(23.65±3.98比51.35±4.67,t=-7.820,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平高于其对照组(26.93±2.15比14.62±1.68),t=7.814,P<0.05),差异有统计学意义;沉默TRPV4组中细胞增殖水平高于其对照组(72.49±6.21比53.18±5.14,t=4.150,P<0.05),差异有统计学意义,细胞凋亡水平低于其对照组(9.71±1.25比15.07±1.64,t=-4.502,P<0.05),差异有统计学意义。缺氧复氧组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于对照组(0.70±0.06比0.20±0.02,t=13.693,P<0.05;0.74±0.07比0.26±0.03,t=10.917,P<0.05),差异有统计学意义;过表达TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平高于其对照组(1.25±0.11比0.69±0.07,t=7.439,P<0.05;1.38±0.14比0.72±0.07,t=7.303,P<0.05),差异有统计学意义;沉默TRPV4组中Caspase-3和Cyt-C表达水平低于其对照组(0.46±0.05比0.68±0.06,t=-4.879,P<0.05;0.45±0.05比0.72±0.06,t=-5.988,P<0.05),差异有统计学意义。结论TRPV4在GC-1细胞中高表达,其可能通过改变GC-1细胞的增殖和凋亡能力,从而影响睾丸IRI的发生发展。     

微小RNA-205-5p调控轴抑制蛋白2基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响及作用机制的临床研究

目的探讨微小RNA(microRNA,miR)-205-5p靶向调节轴抑制蛋白2(AXIN2)基因表达对结肠癌细胞增殖凋亡的影响及作用机制。方法收集2017年1月至2019年1月山西省人民医院手术切除结肠癌组织组织标本并购买结肠癌细胞系,分别以距肿瘤边缘5 cm的癌旁组织和人正常结肠黏膜上皮细胞系为对照。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测分别检测组织和细胞中miR-205-5p和AXIN2表达水平。荧光素酶报告实验验证miR-205-5p与AXIN2的靶向关系。细胞计数试剂盒(CCK-8)法和流式细胞术检测各组转染细胞增殖和凋亡变化,两组和多组间比较分别采用t检验和单因素方差分析。结果结肠癌组织及细胞系中miR-205-5p低表达(2.16±0.24比1.00±0.04,t=10.660,P<0.01),AXIN2高表达(mRNA,0.21±0.02比1.00±0.04,t=30.600,P<0.01;蛋白,0.64±0.03比1.44±0.06,t=26.670,P<0.05),差异均有统计学意义。AXIN2是miR-205-5p的靶基因。mimic组AXIN2蛋白表达量显著低于Blank组和NC组,差异有统计学意义(0.33±0.03,t=116.490,P<0.05);miR-205-5p抑制剂(inhibitor)组AXIN2蛋白表达量显著高于Blank组和NC组,差异有统计学意义(1.67±0.11,t=11.270,P<0.05)。miR-205-5p mimic组(增殖,48 h 0.82±0.09,t=5.375,P<0.05;72 h 1.46±0.13,t=3.333,P<0.05;凋亡,28.71±2.27,t=12.350,P<0.05)和AXIN2沉默表达(siRNA-AXIN2)组(增殖,48 h 1.11±0.11,t=2.814,P<0.05;72 h 1.68±0.06,t=4.959,P<0.05;凋亡,4.45±0.64,t=5.090,P<0.05)结肠癌细胞增殖率显著低于Blank组和NC组,细胞凋亡率显著高于Blank组和NC组,差异有统计学意义;而miR-205-5p inhibitor组(增殖,48 h 2.11±0.18,t=4.386,P<0.05;72 h 2.66±0.19,t=4.898,P<0.05;凋亡,4.71±0.26,t=5.155,P<0.05)和AXIN2过表达(OE-AXIN2)组(增殖,48 h 0.44±0.05,t=0.002,P<0.05;72 h 0.88±0.11,t=7.446,P<0.05;凋亡,25.65±2.12,t=10.900,P<0.05)结肠癌细胞增殖率显著高于Blank组和NC组,细胞凋亡率显著低于Blank组和NC组,差异有统计学意义。结论miR-205-5p在结肠癌中异常升表达,AXIN2呈低表达。miR-205-5p抑制表达靶向上调AXIN2表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡。     

微小RNA-143-3p靶向调控Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因介导丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶信号通路对胃癌细胞增殖侵袭及上皮间质转化的作用机制

目的探讨miR-143-3p靶向调控Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路对胃癌细胞增殖和侵袭的作用机制。方法双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p与KRAS基因的靶向关系。将购自上海中国科学院的胃癌细胞株转染分组,将筛选人胃癌细胞株按照不同转染构建分为6组,miR-143-3p mimic阴性对照(negative control,NC)组、miR-143-3p Inhibitor NC组、miR-143-3p mimic组、miR-143-3p Inhibitor组、si-KRAS NC组、si-KRAS组、miR-143-3p Inhibitor+si-KRAS组。实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测转染后各组细胞相关因子的mRNA和蛋白的表达情况。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法及Transwell小室法检测胃癌细胞增殖及侵袭能力的变化。组间比较采用t检验。结果双荧光素酶报告基因实验证明KRAS是miR-143-3p靶基因。miR-143-3p mimic组的miR-143-3p表达量高于NC组(t=17.630,P<0.05),在miR-143-3p inhibitor组中表达量低于NC组(t=20.780,P<0.05),差异有统计学意义。在miR-143-3p mimic组(mRNA:KRAS为1.00±0.05比0.33±0.03,t=19.900;ERK为1.00±0.05比0.27±0.01,t=24.800;JNK为1.00±0.06比0.60±0.04,t=9.608;E-cadherin为1.00±0.04比1.69±0.06,t=16.570;N-cadherin为1.00±0.03比0.54±0.04,t=15.930;Snail为1.00±0.05比0.39±0.03,t=18.120;蛋白:KRAS为0.54±0.04比0.23±0.01,t=13.020;ERK为0.63±0.04比0.30±0.01,t=13.860;JNK为0.71±0.05比0.33±0.02,t=12.220;E-cadherin为0.85±0.05比1.20±0.06,t=7.762;N-cadherin为0.44±0.03比0.36±0.02,t=3.843;Snail为0.50±0.03比0.25±0.01,t=13.690)中KRAS、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、N-cadherin和Snail的mRNA和蛋白表达量低于NC组,而E-cadherin的mRNA和蛋白表达量高于NC组,细胞增殖(miR-143-3p mimic组:48 h为1.124±0.060比0.978±0.050,t=3.238;72 h为2.545±0.120比2.122±0.110,t=4.501;si-KRAS组:48 h为1.140±0.060比1.020±0.060,t=2.449;72 h为2.500±0.120比2.070±0.100,t=4.768)及侵袭能力(miR-143-3p mimic组:210.00±10.00比110.00±7.00,t=14.190;si-KRAS组:215.00±12.00比100.00±6.00,t=14.850)低于NC组,差异均有统计学意义(P值均<0.05);而miR-143-3p Inhibitor组前述趋势逆转(P值均<0.05),差异有统计学意义。结论miR-143-3p抑制靶向KRAS基因表达,阻断MAPK/ERK信号通路的激活,从而抑制人胃癌增殖侵袭,并调控上皮间质转化进程。     

微小RNA-15b-5p靶向犰狳重复X连锁蛋白2抑制膀胱尿路上皮癌细胞增殖的实验研究

目的检测膀胱尿路上皮癌中微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)的表达,探讨其靶向犰狳重复X连锁蛋白2(ARMCX2)对细胞增殖的调控作用。方法选择69例2014年6月至2015年5月在海南医学院第二附属医院确诊并行手术治疗膀胱尿路上皮癌的患者,留取肿瘤组织。实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-15b-5p、免疫组织化学法检测ARMCX2和细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达。选择尿路上皮癌T24细胞系,应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-15b-5p和ARMCX2的靶向关系。建立无关序列组(NC组)、miR-15b-5p mimic组、miR-15b-5p inhibitor组、miR-15b-5p inhibitor和小干扰RNA(siRNA)-ARMCX2共转染组,应用蛋白质印迹法(Western blot)检测ARMCX2和Ki-67的表达,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性。两组间比较行独立样本的t检验,多组间比较行方差分析(SNK法行两两比较)。结果膀胱尿路上皮癌中miR-15b-5p的表达量范围为1.2~4.5,miR-15b-5p的表达量和ARMCX2的阳性率在不同病变级别(1.51±0.26比2.04±0.43,t=4.560,P<0.05;78.95%比19.35%,χ^2=24.290,P<0.05)、是否为浸润性生长(1.60±0.40比1.86±0.44,t=2.360,P<0.05;73.33%比35.90%,χ^2=9.520,P<0.05)的分组中差异有统计学意义。相关分析显示miR-15b-5p和ARMCX2(r=-0.620,P<0.05)、miR-15b-5p和Ki-67(r=-0.600,P<0.05)呈负相关,ARMCX2和Ki-67(r=0.660,P<0.05)呈正相关。生存分析显示miR-15b-5p和ARMCX2与生存时间有关(χ^2=5.010,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-15b-5p和ARMCX2具有靶向关系。MiR-15b-5p mimic组中ARMCX2(1.15±0.40比1.82±0.28,t=3.430,P<0.05)和Ki-67(1.34±0.37比0.99±0.21,t=2.780,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性低于NC组,miR-15b-5p inhibitor组中ARMCX2(2.24±0.35比1.82±0.28,t=2.630,P<0.05)和Ki-67(1.65±0.26比0.99±0.21,t=5.760,P<0.05)的表达高于NC组,细胞活性高于NC组,miR-15b-5p inhibitor和siRNA-ARMCX2共转染组ARMCX2(1.66±0.25比1.82±0.28,t=1.130,P>0.05)、Ki-67(1.24±0.29比0.99±0.21,t=1.710,P>0.05)的表达差异无统计学意义。结论MiR-15b-5p在膀胱尿路上皮癌中低表达,与肿瘤细胞的增殖及生长相关。MiR-15b-5p靶向ARMCX2抑制尿路上皮癌细胞的增殖。     

铁死亡在重症急性胰腺炎引起的急性肾损伤中的作用及其机制

目的探讨铁死亡在重症急性胰腺炎(SAP)诱发急性肾损伤(AKI)的作用及其机制。方法胰腺炎建模后24 h,将36只SD大鼠(购自青岛大学医学部实验室动物中心)采用完全随机分组法分为3组(n=12):假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1干预组(SAP+Fer组)。建立SAP模型24 h后,检测血清淀粉酶(AMY)、肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平;检测肾组织中铁含量、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)变化及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性;苏木精-伊红(HE)染色观察胰腺和肾脏组织学改变;透射电镜(TEM)观察铁死亡的形态学特征;蛋白质印迹法(Western blot)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光染色等方法分析长链脂酰CoA合成酶4(ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁蛋白重链1(FTH1)等铁死亡相关蛋白和基因的表达。组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果SAP组大鼠血清AMY[(6276.5±562.2)比(1086.6±192.3)U/L]、Cr[(98.0±16.2)比(19.5±5.2)μmol/L]、BUN[(17.1±2.8)比(7.2±1.7)mmol/L]水平明显高于SO组(t=30.314、15.927、10.375,P值均<0.01),差异均有统计学意义;肾组织铁[(0.65±0.13)比(0.44±0.12)mg/g]、MDA[(7.25±0.81)比(1.84±0.24)μmol/g]、ROS[(68.54±7.04)比(15.67±5.21)×104/mg]高于SO组(t=3.855、22.167、11.496,P值均<0.01),GSH[(358.38±41.59)比(518.64±55.72)nmol/g]和GPX4[(7.75±1.09)比(14.72±2.56)U/mg]明显低于SO组(t=7.984、8.674,P值均<0.01),差异有统计学意义;胰腺和肾组织病理损伤程度增加;线粒体出现明显萎缩;肾脏ACSL4蛋白(0.84±0.03比0.34±0.02)表达高于SO组(t=7.876,P<0.01),GPX4、FTH1蛋白(0.69±0.03比1.04±0.06、0.26±0.02比0.83±0.04)表达低于SO组(t=5.651、8.134,P值均<0.01),差异有统计学意义;ACSL4、铁响应元件结合蛋白2(IREB2)mRNA(0.87±0.06比0.24±0.03、1.23±0.05比0.32±0.02)表达高于SO组(t=12.864、15.163,P均<0.01),差异有统计学意义。SAP+Fer组大鼠血清AMY[(5124.3±483.5)比(6276.5±562.2)U/L]、Cr[(55.2±13.7)比(98.0±16.2)μmol/L]、BUN[(9.8±2.1)比(17.1±2.8)mmol/L]水平显著低于SAP组(t=5.287、6.989、7.359,P值均<0.01),差异有统计学意义;肾组织铁[(0.54±0.07)比(0.65±0.13)mg/g]、MDA[(4.67±0.73)比(7.25±0.81)μmol/g]、ROS[(28.39±6.36)比(68.54±7.04)×104/mg]低于SAP组(t=2.639、7.176、8.247,P值均<0.05),GSH[(448.21±45.51)比(358.38±41.59)nmol/g]和GPX4[(11.31±1.89)比(7.75±1.09)U/mg]高于SAP组(t=5.048、5.639,P值均<0.01),差异有统计学意义;胰腺和肾组织病理损伤程度减轻;线粒体轻度萎缩;肾脏ACSL4蛋白(0.49±0.02比0.84±0.03)表达低于SAP组(t=2.781,P<0.05),GPX4、FTH1蛋白(0.69±0.03比1.04±0.06、0.26±0.02比0.83±0.04)表达高于SAP组(t=2.427、2.876,P值均<0.05),差异有统计学意义;ACSL4、IREB2 mRNA(0.52±0.04比0.87±0.06、0.74±0.04比1.23±0.05)表达低于SAP组(t=5.843、6.781,P值均<0.01),差异均有统计学意义。结论铁死亡参与SAP引起的AKI,抑制铁死亡能改善肾功能,减轻肾组织脂质过氧化和病理损伤。