HBx蛋白诱发人肝细胞恶性表型的蛋白组学比较分析

目的探讨HBx蛋白对人肝细胞发生侵袭恶性表型的影响和作用机制。方法利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离稳定表达HBx基因的CCL13-HBx细胞系及转染空质粒的CCL13-pcDNA3.1细胞系的总蛋白质,凝胶经蓝银显色后,采用Image Master 2-DE Elite 4.01图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,MALDI-TOF-MS质谱仪得到相应的肽质指纹图谱后,搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的CCL13-HBx和CCL13-pcDNA3.1细胞总蛋白,图像分析识别差异蛋白质点共26个,通过质谱分析鉴定出14个非冗余的与细胞代谢、细胞周期及信号转导相关的差异表达蛋白质。结论建立了CCL13-HBx,CCL13-pcDNA3.1细胞系的2-DE图谱,鉴定了14个HBx诱发肝癌发生的相关蛋白质,为在蛋白质水平阐明HBx的诱发肝癌发生的机制提供了新线索。     

乙型肝炎病毒X蛋白对血管内皮生长因子的调节通路研究

目的 研究NF-kB信号转导通路在乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)调节血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用.方法 建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx),用不同浓度的NF-kB信号转导通路阻断剂吡咯二硫氢基甲醋酯(PDTC)阻断NF-kB信号转导通路,荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及PDTC加入前后NF-kB信号转导通路的激活及失活情况,同时用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染前后及PDTC加入前后VEGF在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果 以L02细胞为参照,转染HBx基因后的L02-HBx细胞NF-kB信号转导通路被激活,VEGF mRNA和蛋白水平分别增加(4.07±0.31)和(4.34±0.64)倍,差异有统计学意义(P<0.05);加入25.0和50.0μmol/L的PDTC作用24 h后,L02-HBx细胞NF-kB信号转导通路被阻断,VEGF mRNA表达水平分别增加(2.33±0.22)和(1.86±0.18)倍;VEGF蛋白表达水平分别增加(2.52±0.29)和(2.17±0.34)倍,与未加入PDTC的L02-HBx细胞的差异有统计学意义(P<0.05).12.5μmol/L PDTC作用24 h后,VEGF mRNA和蛋白水平的变化无统计学意义(P>0.05).结论 NF-kB信号转导通路是HBx上调VEGF表达、促进肝癌血管生成的途径之一.     

乙肝病毒X 蛋白对正常肝细胞生物钟基因表达的影响

目的：探讨乙肝病毒X蛋白（HBx）对人正常肝细胞中生物钟基因表达的影响。 方法：分别将HBx表达质粒（pcDNA3.1-HBx）与空载体质粒（pcDNA3.1）转染入人正常肝细胞系L02后,用RT-PCR与Western blot法检测细胞HBx mRNA与蛋白的表达;real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的表达。 结果：RT-PCR与Western blot结果显示,L02细胞转染HBx表达质粒后有明显的HBx mRNA与蛋白表达,而转染空载体质粒的L02细胞无HBx mRNA与蛋白表达。与转染空载体质粒的L02细胞比较,转染HBx表达质粒的L02细胞CLOCK与Cry1的mRNA表达明显升高,而BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry2、CKIε的mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：HBx能使正常肝细胞中的生物钟基因表达发生改变,破坏肝细胞正常的生物节律,这可能为其导致肝癌形成的机制之一。     

细胞外信号调节激酶通路在乙肝病毒X基因改变肝癌细胞化疗敏感性中的作用

目的 观察细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路在乙肝病毒X基因(HBx)改变肝癌细胞HepG2对顺铂敏感性中的作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pCP10质粒中扩增482 bp HBx的开放读码框(ORF),构建表达载体pcDNA3-HBx并进行酶切及测序鉴定.应用脂质体将其转染HepG2,50 mg/L G418筛选阳性克隆,抽提mRNA,逆转录(RT)-PCR鉴定是否稳定表达HBx.Western blot法检测转染前后44×103及42×103磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达.噻唑蓝(MTT)法检测转染空脂质体组、空载体组HepG2、HBx+ HepG2对2 mg/L顺铂敏感性的差异,以及顺铂联合ERK通路特异性抑制剂PD98059对HBx+HepG2抑制率的改变.结果 从pCP10中扩增得到482 bp HBx-ORF片段.将其与pcDNA3连接后经酶切及测序鉴定,成功构建HBx-ORF表达载体.从G418抗性细胞克隆中成功扩增出482 bp HBx-ORF,表明转染后的HepG2细胞稳定表达目的片段.经Western blot及灰度扫描鉴定,HBx+细胞中p-ERK蛋白表达是空脂质体组的1.97倍,是空载体组的1.67倍.MTT法检测2 mg/L顺铂作用24 h,对HBx+ HepG2的抑制率为19.56％,明显低于对空脂质体组和空载体组HepG2的抑制率(35.21％和30.18％).而先以100 μmol/L PD98059孵育2h的HBx+ HepG2,顺铂对其抑制率上升至31.20％,与未加PD98059时比较有显著提高(P＜0.05).结论 ERK信号传导通路的激活在抑制HBx+的肝癌细胞的化疗敏感性方面起重要作用,对该通路的特异性抑制有助于提高HBx+肝癌的化疗效果.     

乙肝病毒X蛋白激活NF-κB信号通路对AFP表达的影响

目的: 研究乙肝病毒X蛋白（HBx）通过核因子-κB (NF-κB)信号通路对甲胎蛋白（AFP）的调节作用。方法:建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx)，用特异性的NF-κB信号通路阻断剂PDTC阻断该信号通路，荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及加入PDTC前后NF-κB信号通路的激活、失活情况，同时用实时定量 PCR和Western Blot技术检测转染前后及加入PDTC前后AFP在mRNA及蛋白水平上的表达变化。结果:以L02细胞为参照，转染HBx基因后的L02-HBx细胞NF-κB信号通路被激活，AFP mRNA和蛋白水平较转染前分别增加（2.78±0.43）倍和（4.72±0.53）倍,差异有统计学意义（P<0.05）；PDTC作用24 h后L02/HBx细胞NF-κB信号通路阻断，AFP mRNA和蛋白表达分别为（1.40±0.16）倍和（3.12±0.44）倍，与未加入PDTC作用的L02-HBx细胞相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:NF-κB信号通路是HBx上调AFP表达的途径之一。     

干扰素α抑制乙肝病毒X蛋白诱导的肝癌转移的分子机制研究

目的 研究干扰素α抑制乙肝病毒X蛋白诱导肝细胞癌侵袭转移的分子机制,为肝癌的临床治疗研究提供实验依据.方法 采用脂质体法构建pcDNA 3.1-HBx质粒转染CCL13细胞,将CCL13/HBx细胞与干扰素-α共培养,并用RT-PCR、Western Blot从mRNA和蛋白质水平检测CCL13/pcDNA3.1、CCL13/HBx、CCL13/HBx-INF-α中p202、PTEN基因表达,Transwell实验检测CCL13/pcDNA3.1、CCL13/HBx、CCL13/HBx-INF-α细胞侵袭能力.结果 CCL13/HBx细胞中p202、PTEN基因的mRNA及蛋白表达水平明显低于CCL13/pcDNA3.1细胞和CCL13/HBx-INF-α细胞(P＜0.05),而CCL13/pcDNA3.1细胞与CCL13/HBx-INF-α细胞间表达差异无统计学意义(P＞0.05).CCL13/HBx细胞通过Matrigel的细胞数[(37.2±3.8)个/HP]明显多于CCL13/pcDNA3.1[(6.4±1.2)个/HP,t=8.369,P＜0.05]和CCL13/HBx-INF-α细胞[(7.6±1.3)个/HP,t=7.256,P＜0.05],而CCL13/pcDNA3.1与CCL13/HBx-INF-α细胞间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 干扰素α可能通过上调乙肝病毒X蛋白所介导的p202基因、PTEN基因表达,抑制肝癌细胞的侵袭转移.     

LI-钙黏蛋白和E-钙黏蛋白在结肠癌中的表达及意义

探讨LI-钙黏蛋白(LI-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)在结肠癌组织中的表达及临床意义。2011年7月—2012年12月在山东大学齐鲁医院胃肠外科行手术治疗的结肠癌患者78例(结肠癌组),肠镜检查正常者56例(正常组),用免疫组织化学技术检测正常结肠黏膜和结肠癌组织中LI-钙黏蛋白和E-钙黏蛋白的表达。结肠癌组E-cadherin表达异常者与正常组相比显著增高(P0.05);结肠癌组LI-cadherin表达阳性率为69.2%,显著低于正常组(92.9%,P0.05)。E-cadherin和LI-cadherin表达与结肠癌临床病理因素关系显示,分化程度越低,E-cadherin异常表达明显升高,LI-cadherin表达阳性率降低(P0.05)。Dukes分期越高,E-cadherin异常表达明显升高,LI-cadherin表达阳性率显著降低(P0.05)。发生淋巴结转移的患者E-cadherin异常表达率为67.5%,显著高于未发生淋巴结转移者(39.5%);LI-cadherin在淋巴结发生转移者阳性率为62.5%,显著低于未发生转移者(76.3%,P0.05)。LI-cadherin和E-cadherin异常表达与结肠癌的发生密切相关,表达的异常可能成为结肠癌恶性程度以及是否转移的参考指标。     

转染丙型肝炎病毒核心基因对胆管癌细胞上皮-间叶样表型转化的影响

目的 观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)在诱导胆管癌细胞上皮-间叶样表型转化中的作用.方法 将转染的胆管癌细胞(QBC939)分成空载体对照组和HCVc基因实验组,通过半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学的方法 分别检测两组细胞中HCVc、上皮性标志物上皮性钙黏附素(E-cadherin)、间叶性标志物波形蛋白(Vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)的mRNA及蛋白的表达.结果 转染HCVc基因的实验组细胞能够较好地表达该基因,而空载体对照组未见其表达,实验组细胞E-cadherin的mRNA表达水平(0.44±0.03)较对照组(0.56±0.03)明显下降(P＜0.05),而其Vimentin(0.61±0.01)、Fibronectin(0.58±0.05)表达水平较对照组(0.38±0.02)、(0.42±0.03)明显增加(P＜0.05).两组细胞各标志物蛋白表达差异明显,转染HCVc基因的实验组细胞较空载体对照组细胞E-cadherin表达明显缺失,Vimentin、Fibronectin明显增高.结论 丙型肝炎病毒核心蛋白可能诱导胆管癌细胞发生了上皮-间叶样表型转化.     

乙型肝炎病毒x蛋白与肝癌生物学特性的研究

目的 观察乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)对肝癌多药耐药基因(MDR)1和MRP1和促血管生长因子(VEGF)之间的作用,探讨HBx影响肝癌生物学特性如多药耐药性和血管生成的分子机制。方法利用瞬时转染HBx基因的方法建立细胞模型,分别使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测转染前后HepG2细胞的多药耐药相关基因和VEGF的表达情况。使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和流式细胞仪检测阿霉素诱导后两种细胞的存活率和凋亡率,了解HBx转染后细胞耐药性的变化。结果转染前后相比,转染HBx基因的HepG2细胞多药耐药相关基因和VEGF基因表达水平比转染前均明显上升(P<0.05),转染后MRP1基因表达量与转染前之比分别为3.11,MDR1为3.70,VEGF为2.83。Western blot显示转染后MDR1蛋白水平上升1.10倍,MRP1蛋白上升1.74倍。MTT结果显示转染后细胞IC50明显高于对照组(P<0.05)。AnnexinV-FITC／PI检测提示阿霉素诱导后转染组凋亡率明显低于于对照组的(9.8±1.5)％、(17.8±1.7)％。结论乙型肝炎病毒x蛋白可能与肝癌发展过程中的生物学特性如多药耐药和血管生成密切相关。     

干扰素-α对CCL13/HBx细胞生长及侵袭转移潜能的抑制作用

目的 观察干扰素-α对恶性转化的CCL13/HBx细胞的生长和侵袭转移潜能的抑制效应.方法 采脂质体法将pcDNA3.1-HBx质粒转入CCL13细胞,将CCL13/HBx细胞分别在普通条件下培养或与干扰素-α共培养,采用绘制生长曲线、平板集落形成实验、划痕愈合实验、体外侵袭力、体内裸鼠成瘤实验分别检测CCL13/HBx、INF-α-CCL13/HBx、CCL13/PcDNA3.1细胞在体内、体外的生长及运动迁移能力的差异.结果 pcDNA3.1-HBx质粒转染CCL13细胞后在该细胞中稳定表达,CCL13/HBx细胞生长明显快于INF-α-CCL13/HBx和CCL13/PcDNA3.1细胞,克隆生成率明显增高(31.2%比10.8%比12.4%,P<0.05),划痕愈合能力明显增强,穿过人工基底膜的细胞数明显增多[(41.6±3.1)/HP比(7.4±1.2)/HP比(9.2±1.6)/HP,P<0.05].干扰素-α治疗组CCL13/HBx细胞裸鼠皮下成瘤体积减小[(2.4±0.2)cm3比(4.2±0.3)cm3,P<0.05].结论 CCL13/HBx细胞较CCL13/pcDNA3.1细胞具有更强的生长和侵袭转移潜能,干扰素-α能明显抑制HBx蛋白所诱导的细胞恶性表型.